综述：用于水生监测中非酶促氧化应激生物标志物的生物技术方法

《Marine Pollution Bulletin》：Biotechnological approaches for non-enzymatic oxidative stress biomarkers in aquatic monitoring

　　Maira Lima| Rosa Freitas| Lucas Nunes| Thiago Matos| Ricardo Coutinho| Lohengrin Fernandes
海洋生物技术研究生项目
IEAPM/UFF，地址：Rua Kioto 253, Praia dos Anjos, 28930-000, Arraial do Cabo, Rio de Janeiro, Brazil
或
Rua Prof. Marcos Waldemar de Freitas Reis, S?o Domingos, 24210-201, Niterói - Rio de Janeiro, Brazil

**摘要**
非酶类氧化应激生物标志物，如硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）、蛋白质羰基（PC）和还原型谷胱甘肽（GSH），是水生生物监测和生态毒理学中最广泛应用的指标，对于评估沿海、河口和海洋生态系统的污染状况具有重要意义。然而，尽管这些标志物已使用了数十年，但它们成为可靠的环境监测工具的努力仍受到分析方法和解释方面的限制，包括实验室间可比性差、采样和储存程序不统一、基质干扰、标准化策略不一致以及质量保证框架不足等问题。本文批判性地研究了这些生物标志物在水生系统中的应用，重点探讨了目前限制其实际应用的方法学和技术障碍。我们综合了关于方法学变异、分析误差以及影响生物标志物响应的各种生物学基质和环境因素的 evidence。分析表明，TBARS、PC 和 GSH 是检测与多种污染物（包括金属、有机污染物和复杂污染物混合物）相关的氧化损伤的高度敏感指标。然而，不同研究之间的分析方法和实验设计存在显著差异，这阻碍了结果之间的可比性以及具有生态意义的基线值的建立。最后，我们提出了一条以技术为导向的路线图，旨在改进生物标志物的标准化和现场应用性，包括最低报告要求、验证优先级以及可扩展的分析策略（如微型化检测、微流控平台和基于智能手机的检测系统）。总体而言，这些方法的整合可能有助于将非酶类氧化应激生物标志物从研究工具转变为适用于水生生态系统环境监测和决策的标准化工具。

**1. 引言**
人类活动对水生生态系统的压力不断增加——例如废水排放、农业中化肥的过度使用以及流域内的城市扩张——引发了人们对水生生物亚致死影响的高度关注（Ali et al., 2019; H?der et al., 2020）。作为回应，环境生态毒理学越来越多地将氧化应激生物标志物作为检测早期生化变化的重要工具，这些变化通常早于可观察到的种群水平或生态效应（Valavanidis et al., 2006; Regoli and Giuliani, 2014; Hook et al., 2014; Vellani et al., 2025）。水生生态系统日益受到工业排放物、农业径流和生活污水等复杂污染物混合物的污染。其中，药品、染料、金属、农药和其他新兴污染物可能改变生态过程并损害生物体的发育和代谢功能。最新研究进一步强调了化学污染物和环境压力因素可能在水生系统中引发致畸作用，并影响与代谢调节相关的微生物途径，从而加剧了污染暴露的广泛生物后果（Madesh et al., 2024; Nayak et al., 2025）。为了减轻这些污染物的环境负担，人们探索了传统和新兴的修复技术。传统方法包括混凝-絮凝、过滤、氧化和吸附，而近期研究则强调了聚合物水凝胶、壳聚糖基材料和含有纳米零价铁（nZVI）的纳米复合材料在污染物去除和水处理中的重要作用。例如，Sivasuriyan（2025）报告了使用基于聚合物 CS-OM-nZVI 的水凝胶珠子去除水中的环丙沙星，而 Varshan（2026a）描述了一种基于真菌衍生壳聚糖纳米颗粒的生物-纳米吸附系统用于去除结晶紫。此外，Sivasuriyan（2024）展示了壳聚糖和秋葵黏液在含有 nZVI 的纳米复合材料中协同控制水生系统中病原体的作用，进一步说明了可持续纳米结构材料在环境修复中的重要作用。

在生物层面上，环境污染物暴露通常通过增加活性氧（ROS）的产生来引发氧化应激。为了对抗氧化损伤，水生生物依赖于由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等酶类抗氧化剂组成的防御系统，这些抗氧化剂通过催化活性分子的解毒和维持细胞氧化还原稳态发挥第一道防线的作用（Valavanidis et al., 2006; Regoli and Giuliani, 2014）。尽管这些酶类生物标志物在水生生态毒理学研究中广泛用于评估污染物暴露和生理压力，但它们的响应可能因物种特异性代谢、发育阶段、温度和营养状态等多种生理和环境因素而表现出很大差异，这使得现场研究中酶类响应的解释变得复杂，并限制了其在常规环境监测中的应用可靠性（Van der Oost et al., 2003; Hook et al., 2014）。

尽管氧化应激生物标志物在水生生态毒理学中得到广泛应用，但它们尚未完全转化为适用于常规污染监测程序的标准化、可扩展且适用于现场的分析解决方案。因此，当前面临的挑战不仅在于这些生物标志物的生物学意义，还包括将其从实验室检测方法转化为具有强大验证能力、统一的工作流程和质量保证框架的实用分析平台（Hagger et al., 2006）。在现有的方法中，非酶类氧化应激生物标志物（如硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）、蛋白质羰基（PC）和还原型谷胱甘肽（GSH）因其对多种有机和无机污染物的高敏感性和在不同分类群中的适用性而特别值得关注（Ferreira et al., 2010; El-SiKaily and Shabaka, 2024）。这些指标反映了与氧化应激相关的核心生理过程，包括脂质过氧化、蛋白质氧化和细胞氧化还原状态的波动，在环境风险评估和水污染评估中得到广泛应用（Parvez and Raisuddin, 2005）。

从生物技术的角度来看，TBARS、PC 和 GSH 不仅是氧化失衡的机制指标，也是基于检测方法的指标，其在环境监测中的有效性取决于分析性能、标准化以及在不同基质和环境条件下的适用性。其实际应用潜力取决于提高分析方法的稳健性、减少分析误差，并确保量化结果适用于淡水、河口和海洋生态系统的分散式和低成本监测策略（Tadi? et al., 2025）。尽管在实验室提取和量化方面取得了显著进展，但这些生物标志物在水环境监测中的整合仍受到专门分析基础设施依赖、试剂和设备成本高昂以及需要专业人员培训等挑战的阻碍（Van der Oost et al., 2003; Ruiz-Ojeda et al., 2018）。此外，许多现有方法不适用于现场条件或偏远地区，从而延长了检测时间并限制了快速决策。因此，人们对新型和创新分析解决方案（如便携设备、微流控平台和自动化系统）产生了浓厚兴趣，这些解决方案能够提供快速、经济且可靠的测量结果，同时保持足够的灵敏度和特异性（Williams et al., 2024）。这些限制直接影响了重复性和实验室间可比性——这是开发基于生物技术的监测工具的两个关键要求。在这方面，氧化应激生物标志物的量化应采用以应用为导向的框架，优先考虑最低报告标准、方法验证、参考对照和QA/QC标准，以便将这些检测方法整合到具有统一解释性的监测项目中，包括针对沿海、河口、海洋污染和内陆水域的项目（Dominutti et al., 2025）。

**2. 非酶类氧化应激生物标志物在水生环境中的应用**
**2.1. 氧化应激的概念及其环境意义**
氧化应激（OS）是一种生化状态，由活性氧（ROS）的产生与细胞抗氧化系统中和它们的能力之间的不平衡引起（Livingstone, 2001; Pizzino et al., 2017）。在水生生态系统中，这一现象尤为重要，因为存在多种能够产生 ROS 的污染物，包括金属、农药、碳氢化合物、营养物质和个人护理产品等外来物质（Livingstone, 2001; Madesh et al., 2024）。OS 对各种水生生物（如鱼类、软体动物、甲壳动物和微肢动物）的影响已有充分记录（Chowdhury and Saikia, 2020; Frías-Espericueta et al., 2022; Song et al., 2023），包括细胞代谢改变（如核酸损伤和酶抑制），在严重情况下甚至会导致种群死亡率增加。因此，通过非酶促氧化生物标志物评估氧化应激（OS）为从个体到生态系统的多个尺度上的环境健康评估提供了一种敏感且早期的诊断工具，能够在死亡事件发生之前就检测到亚致死效应（Valavanidis等，2006；Lomartire等，2021；El-SiKaily和Shabaka，2024）。然而，不应不加批判地将OS解释为毒性的直接指标或生态损害的标志。ROS生成的适度增加可能会激活补偿性生理反应，包括抗氧化酶、分子伴侣和细胞修复系统的诱导，从而恢复氧化还原平衡和细胞稳态，而不会产生可测量的不良后果。这种现象通常被称为“激素效应”，反映了剂量-反应的双相关系：低至中等的压力暴露可能引发适应性甚至有益的反应，只有较高的暴露强度才会导致不可逆的损害和适应性成本（Calabrese和Baldwin，2002）。与此框架一致的是，在暴露于金属、农药和药物的水生生物中已经报告了激素效应的反应，表现为抗氧化防御的增强，在某些情况下，在低浓度下生长也会增强，而在较高暴露水平下则会出现抑制或有害效应（Agathokleous等，2021；Rix等，2022）。同样，长期暴露于污染物的生物体可能会通过适应过程降低OS水平或减弱生物标志物的反应，但这并不意味着暴露或生态风险的消除。抗氧化代谢的可塑性、解毒途径的上调以及能量分配的变化已被确定为鱼类和无脊椎动物在受污染环境中这种反应的关键机制（Meyer和Di Giulio，2003；Nacci等，2009；Bury等，2018）。因此，氧化生物标志物的增加和减少都应在更广泛的生态毒理学框架内进行解释，该框架整合了暴露历史、污染物浓度、生物体状况以及补充性终点（例如组织病理学、生长和繁殖），而不是事先假设它们等同于毒性效应。

2.2. 脂质过氧化和TBARS
脂质过氧化（LPO）涉及细胞膜内多不饱和脂肪酸的氧化降解，产生反应性醛类物质，其中丙二醛（MDA）是最常研究的标志物（Ayala等，2014；Tsikas，2017；Zheng等，2024）。TBARS测试通过在酸性、高温条件下与硫代巴比妥酸反应来定量MDA，形成一种粉红色的发色化合物，然后通过分光光度法进行测量（Hodges等，1999）。
脂质过氧化最常通过TBARS测试来评估，因其对不同化学应力引起的氧化损伤具有高度敏感性（El-SiKaily和Shabaka，2024）。在暴露于金属、农药和石油衍生物的水生生物中，已一致报告TBARS水平升高，反映了污染物驱动的氧化应力下膜脂质的增强氧化（Oakes和Van Der Kraak，2003）。例如，在Moussa等（2022）的研究中，从工业化地区收集的Oreochromis niloticus的肝脏和鳃组织中发现了显著升高的TBARS浓度，脂质过氧化水平与沉积物中重金属混合物的污染程度相关。在暴露于农业农药和城市废水的鱼类中也记录了类似的TBARS升高，这表明生物标志物对分散源和点源污染具有响应性。重要的是，TBARS反应不仅限于鱼类或金属污染。在双壳类软体动物和甲壳类动物（包括Mytilus spp.、Ruditapes spp.和淡水端足类动物）中，暴露于城市废水排放、农业径流、多环芳烃（PAHs）和新兴污染物后，也报告了脂质过氧化的增加，通常伴随着抗氧化防御的改变（Turja等，2020；Silva等，2022）。这些发现支持TBARS作为跨分类群和污染场景普遍响应的膜氧化损伤指标的适用性。
除了化学应力因素外，与气候变化相关的驱动因素也被证明对水生生物的脂质过氧化过程有强烈影响。实验性升温反复与鱼类和无脊椎动物中TBARS水平的升高相关，反映了代谢率的提高、活性氧（ROS）生成的增加以及膜稳定性的降低。例如，在Carassius auratus鱼类中，热应力导致脂质过氧化显著增加，表明在高温条件下抵消氧化损伤的能力有限（Lushchak和Bagnyukova，2006）。类似的温度驱动的TBARS增加也在海洋双壳类动物（包括Mytilus galloprovincialis和Ruditapes philippinarum）中报告，特别是在长期升温或海洋热浪的情况下（Freitas等，2017a；Freitas等，2019b）。缺氧和脱氧在沿海和河口系统中也越来越普遍，也被证明会增强脂质过氧化。在暴露于低氧条件下的鱼类（如Oncorhynchus mykiss和Carassius auratus）中，缺氧-再氧化循环触发了TBARS的显著增加，这与线粒体功能障碍和再氧化期间的ROS爆发一致（Lushchak和Bagnyukova，2006）。在双壳类动物（如M. edulis）中也观察到了类似的反应，缺氧暴露增加了脂质过氧化，损害了膜完整性和细胞功能（Falfushynska等，2020）。海洋酸化也被报道会加剧脂质过氧化，尤其是在钙化生物中。高pCO?暴露导致牡蛎（Crassostrea virginica）和贻贝（M. galloprovincialis）的TBARS水平升高和膜脂质组成改变，当酸化与升温结合时，这些效应会更加显著（Matoo等，2013；Freitas等，2017b）。此外，与淡水输入变化和极端气候事件相关的盐度波动也被证明会在广盐性鱼类和无脊椎动物中引起氧化膜损伤，TBARS的增加反映了渗透调节应激的能量和氧化还原成本（Freitas等，2017b；Gostyukhina等，2023）。
重要的是，与气候变化相关的应力因素经常与化学污染物协同作用，导致比单一应力暴露更强烈的脂质过氧化。在海洋双壳类动物中的实验研究表明，升温与金属或有机污染的组合导致TBARS水平显著高于任何单一应力因素，反映了累积的氧化压力和膜修复能力的降低（Freitas等，2017a；Freitas等，2019b；Pra?a等，2025）。
总而言之，这些研究表明，TBARS是一种敏感且操作上稳健的指标，适用于暴露于化学污染物和气候相关应力的各种水生类群的脂质过氧化，支持其在综合多生物标志物监测框架中的持续使用。
尽管TBARS测试被广泛使用，但它存在一些局限性。其对MDA的特异性相对较低，因为其他醛类和氧化分子也可能与硫代巴比妥酸反应，从而产生假阳性结果（Slaninova等，2009；Leon和Borges，2020）。此外，实验变量如pH值波动、培养时间和组织中天然抗氧化剂的存在会显著影响该方法的准确性（Díaz等，2014；Rizzo，2024）。鉴于这些限制，建议将TBARS测量与其他OS生物标志物结合使用，以获得对水生生物氧化失衡的更全面和可靠的评估（Tkachenko等，2014；Oliveira等，2024）。
然而，一个更关键的问题是TBARS结果的解释。尽管TBARS仍然是生态毒理学中评估脂质过氧化最常用的测试之一，但它不应被视为氧化损伤的特定或无可争议的指标。由于硫代巴比妥酸反应的化学选择性有限，TBARS值更适合作为硫代巴比妥酸-反应性醛类的综合指标，而不是直接且唯一的MDA估计值（Janero，1990；Gutteridge，1995；Halliwell和Gutteridge，2015）。从实际角度来看，TBARS定量在探索性或筛选环境中仍然可以接受和有用，例如对污染区域的初步评估、对比明显不同的地点或处理方式，以及在与其他氧化应激生物标志物（如蛋白质羰基、抗氧化酶）结合使用的研究中，这些标志物共同支持脂质过氧化的发生。相比之下，当目标是获得关于MDA的化合物特异性信息、建立个别污染物的因果关系或在分子水平上进行机制解释时，TBARS是不够的，这时需要色谱或质谱方法（Esterbauer和Cheeseman，1990；Del Rio等，2005；Tsikas，2017）。另一个限制TBARS诊断价值的因素是缺乏普遍接受的水生生物参考值或生态学相关的阈值。基础TBARS水平在物种、组织、生命阶段、营养状况和温度条件之间存在很大差异，无法定义固定的“正常”与“异常”范围（Livingstone，2001；Regoli和Giuliani，2014）。因此，TBARS数据作为相对于适当对照组或参考群体的相对变化（增加或减少）表达时更为可靠，而不是以绝对定量术语解释（Van der Oost等，2003）。
综合考虑这些因素，应采取一种平衡和务实的立场：TBARS应主要作为低成本、高灵敏度的筛选工具，在综合多生物标志物框架中使用，而不是作为脂质过氧化或毒性的独立指标。其在环境监测中的持续应用基于操作简便性和历史可比性；然而，其解释必须明确承认其化学非特异性和缺乏生态学定义的参考区间（Van der Oost等，2003；Hook等，2014；Tsikas，2017）。

2.3. 蛋白质羰基（PC）
蛋白质羰基是通过氨基酸侧链（特别是脯氨酸、精氨酸、赖氨酸和苏氨酸）的氧化形成的，导致稳定的羰基团引入蛋白质结构（Maisonneuve等，2008；Zhang等，2025）。这些残基特别容易受到ROS的修饰，例如通过金属催化的氧化过程，将脯氨酸和精氨酸转化为谷氨酸半醛，将赖氨酸转化为氨基己二酸半醛等其他稳定的羰基衍生物（Weng等，2017；Estévez等，2022）。这种不可逆的氧化修饰改变了酶、结构蛋白和细胞骨架成分的结构完整性和功能能力，直接影响生物体的生理机能（Fedorova等，2013；Estévez等，2022）。由于其化学稳定性和与环境污染物的强相关性，蛋白质羰基已成为生态毒理学研究中的首选生物标志物（Valavanidis等，2006；Benedetti等，2015；El-Agri等，2022）。
许多研究表明，在暴露于环境应激的各种水生类群中，蛋白质羰基水平显著增加，支持它们作为氧化蛋白质损伤的综合指标的价值。例如，在埃及Qarun湖的Solea aegyptiaca中，从金属污染严重的地区收集的个体的肝脏、鳃和肌肉中的PC水平显著升高，表明PC适用于评估实际暴露情景下的生态毒理学风险（El-Agri等，2022）。在生活在城市和工业影响水体中的Oreochromis niloticus中也观察到了类似的变化，其中肝脏PC水平的升高与镉、铅和其他金属的暴露相关，反映了累积的氧化蛋白质损伤而非化合物特异性效应（Domingues等，2019）。重要的是，蛋白质羰基水平的升高不仅限于金属暴露或鱼类。在包括双壳类（M. galloprovincialis、R. philippinarum）和甲壳类在内的水生无脊椎动物中，暴露于农药、多环芳烃（PAHs）、药物和其他新兴污染物后也报告了蛋白质羰基的增加，通常伴随着脂质过氧化和抗氧化防御的调节（Dorts等，2009；Rilievo等，2021；Freitas等，2019a；Freitas等，2021）。这些发现增强了PC作为跨分类群和化学复杂暴露背景下的氧化蛋白质修饰指标的稳健性。
除了化学污染外，与气候变化相关的应力因素也被证明显著影响蛋白质羰基的积累。实验性升温与鱼类和无脊椎动物中蛋白质羰基形成的增加相关，反映了在高代谢需求下氧化压力的增强和蛋白质周转的受损（Lushchak和Bagnyukova，2006；Kaur等，2011；Andrade等，2019）。类似地，缺氧条件也被证明会增加鱼类和双壳类动物的PC水平，特别是在缺氧-再氧化循环期间，线粒体功能障碍和ROS爆发促进了蛋白质氧化（Lushchak和Bagnyukova，2006）。海洋酸化也被报道会加剧钙化生物（包括牡蛎和双壳类）中的蛋白质羰基化，尤其是在与升温结合时（Matoo等，2013；Freitas等，2017b）。与淡水输入变化和极端气候事件相关的盐度波动也被证明会引起广盐性鱼类和无脊椎动物的氧化膜损伤，TBARS的增加反映了渗透调节应激的能量和氧化还原成本（Freitas等，2017b；Gostyukhina等，2023）。
总之，这些证据表明，蛋白质羰基水平的增加代表了暴露于化学污染物和气候相关应力因素的各种水生类群中氧化蛋白质损伤的敏感且广泛适用的早期预警信号。据此，蛋白羰基化物（PC）在多生物标志物框架中具有特别的价值，这些框架旨在检测亚致死性压力，并在生物体适应性明显受损之前预测下游的毒性效应。这些例子共同表明了一个模式：在化学复杂污染情况下，PC水平持续升高，这支持了其作为氧化蛋白损伤的一般标志物的适用性，而不仅仅与单一污染物相关（Valavanidis等人，2006年）。尽管蛋白质羰基化物的稳定性较高，但其测量结果仍需谨慎解读。基线水平可能受到饮食组成、生物体年龄和多种同时作用的压力因素的影响，这使得孤立数据的解读变得复杂（Estévez等人，2022年）。在多重压力环境下，例如同时暴露于金属、缺氧和热应激条件下，PC的反应可能是加性的、协同的，甚至是拮抗的，这使得将效应归因于单一污染物变得困难。氧化途径与炎症或能量应激之间的相互作用会进一步调节蛋白质氧化，从而强调了综合评估框架的必要性（Lushchak，2011年；Sokolova，2013年；Lindberg和Di，2019年）。分析测定通常依赖于精确的蛋白质提取，然后使用2,4-二硝基苯肼（DNPH）进行衍生化，如果实验操作不严谨，这一过程可能会引入较大的偏差。pH值、反应时间、试剂浓度和样品制备条件的变化可能会影响准确性，尤其是在蛋白质含量低或血红蛋白水平高的组织中，这些因素会干扰吸光度测量。比较研究表明，自动化协议和替代方法（如Oxime blot方法）可能提供更高的特异性和重现性，从而减少传统DNPH衍生化方法常见的误差（Weber等人，2015年；Georgiou等人，2018年；Ladouce等人，2023年）。与其它蛋白质损伤标志物相比，蛋白质羰基化物具有互补的优点和局限性。诸如蛋白质巯基耗竭和高级氧化蛋白产物（AOPP）等指标通常对氧化挑战反应迅速，但表现出较大的可逆性和较低的化学稳定性。相比之下，特定氧化加合物（包括3-硝基酪氨酸和高级糖基化终产物）的检测提供了更高的机制分辨率，但需要高成本的分析平台，如高效液相色谱-质谱（HPLC–MS/MS）或免疫检测技术（Dalle-Donne等人，2006年）。在这种情况下，蛋白质羰基化物处于中间位置：虽然不如靶向加合物特异，但在化学上更稳定且更具整合性，因此特别适合于存在物流限制的大规模生物监测项目。

2.4. 还原型谷胱甘肽（GSH）和细胞氧化还原状态
還原型谷胱甘肽（GSH）是细胞质中含量丰富的三肽，由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成，是抗氧化防御中的主要细胞内巯基化合物。它不仅在直接中和活性氧（ROS）方面起作用，还能中和氮（RNS）和硫（RSS）物质，同时参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环，有助于其它抗氧化剂（如谷胱甘肽过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶）的再生。GSH保持还原型状态依赖于谷胱甘肽还原酶（GR）这一酶的催化，该酶以NADPH为辅因子，维持了一个在氧化应激条件下高度敏感的细胞氧化还原系统（Lushchak，2012年；Townsend等人，2020年；Labarrere和Kassab，2022年；Va?ková等人，2023年）。大量研究表明，谷胱甘肽平衡的破坏是对各种污染物暴露的常见生化反应，这不仅限于金属。例如，铜和汞（Hg）已被证明会显著消耗水生生物中的GSH——反映了严重的氧化应激和氧化还原缓冲能力的下降——类似的反应也在多种有机污染物中观察到。在鱼类的研究中，常见的鰕虎鱼Pomatoschistus microps亚致死性暴露于铜或Hg后，GSH浓度显著下降，同时关键的抗氧化酶（如谷胱甘肽过氧化物酶GPx和谷胱甘肽还原酶GR）也发生改变，表明其清除自由基的能力受损（Vieira等人，2009年）。在接触杀虫剂（包括有机磷和拟除虫菊酯）的硬骨鱼类中观察到了类似的模式，GSH的消耗与脂质过氧化和氧化蛋白损伤有关，反映了氧化挑战和结合解毒的需求（Livingstone，2001年；Lushchak，2011年）。非金属污染物暴露于水生无脊椎动物中也广泛记录了GSH动态的破坏。例如，在双壳类软体动物M. galloprovincialis和R. philippinarum中，水杨酸（NSAID/药物；新兴污染物）的暴露会导致GSH水平下降，同时伴随着脂质过氧化的增加和抗氧化酶活性的改变（Freitas等人，2019a；Freitas等人，2020年）。同样，包括抗生素和非甾体抗炎药物在内的药物化合物也被报道会在软体动物和甲壳动物中引起GSH的消耗，尤其是在慢性暴露情况下，这可能是由于持续的氧化压力和依赖于谷胱甘肽的生物转化过程（Gonzalez-Rey和Bebianno，2012年；Freitas等人，2019a；Hallmann等人，2023年；Queirós等人，2024年）。在单细胞和底栖生物中，暴露于不同的化学压力源后也观察到了GSH的下降。例如，在底栖有孔虫Amphistegina lessonii中，汞暴露导致GSH水平显著下降，同时其他氧化应激标志物也增加（Ciacci等人，2022年）；而在暴露于有机污染物的微型甲壳类动物和端足类动物中的研究中也报告了GSH的消耗，这与活性氧（ROS）的产生增加和抗氧化能力下降有关（Gorokhova等人，2013年；Belaid和Sbartai，2020年）。与气候变化相关的压力源，包括变暖、缺氧、海洋酸化和盐度变化，已被证明会显著调节多种水生生物的谷胱甘肽平衡，常常加剧氧化应激并加速還原型谷胱甘肽（GSH）的消耗（Heise等人，2006年；Lushchak和Bagnyukova，2006年）。热应激会影响适应寒冷和温带的鱼类（如南极鳕鱼Pachycara brachycephalum和河口物种Dicentrarchus labrax）以及海洋双壳类动物（如M. galloprovincialis）的GSH动态，尤其是在长时间或热浪条件下（Heise等人，2006年；Madeira等人，2013年；Freitas等人，2019b）。缺氧还会进一步扰乱鱼类（Perccottus glenii）和双壳类动物（M. edulis）的GSH代谢，导致GSH水平下降和氧化还原缓冲能力受损，尤其是在再氧合过程中（Lushchak和Bagnyukova，2006年；Lushchak和Bagnyukova，2007年；Falfushynska等人，2020年）。海洋酸化改变了钙化生物（如Crassostrea virginica、R. philippinarum和M. galloprovincialis）中的谷胱甘肽相关途径，当与变暖结合时，通常会加剧氧化失衡（Tomanek等人，2011年；Freitas等人，2017b）。在广盐性鱼类（如Dicentrarchus labrax）和双壳类动物（C. gigas）中，盐度变化会带来额外的能量和氧化还原压力，从而导致GSH消耗（Zanette等人，2011年；Bal等人，2021年；Chang等人，2021年）。重要的是，这些由气候变化驱动的压力源经常与化学污染物协同作用，放大GSH的消耗和氧化损伤，从而降低生物体在未来全球变化情景下的抵抗力（Portner和Farrell，2008年；Sokolova，2013年；Freitas等人，2019a）。总的来说，这些发现表明，還原型谷胱甘肽（GSH）的消耗是暴露于多种化学污染物（包括金属、杀虫剂、多环芳烃（PAHs）和药物）以及与气候变化相关的压力源（如变暖、缺氧、海洋酸化和盐度变化）的常见和综合性的生化结果，这些因素单独或共同作用于各种水生生物体。总的来说，这些证据强化了GSH作为氧化应激和解毒压力的敏感指标的价值，同时也强调了在多生物标志物框架内进行谨慎解读的必要性，需要考虑污染物类型、暴露时间、生物体生理学以及结合代谢对观察到的GSH动态的潜在贡献。尽管GSH具有生态相关性，但其作为环境生物标志物的使用受到重要的技术限制。GSH在生物样本中本质上是不稳定的，需要严格的采集、处理和储存条件以防止降解（Nuhu等人，2020年；Iddrisu等人，2024年；Coden等人，2024年）。此外，物种、性别、年龄和组织类型之间的自然变异性强烈影响基线水平，就像其他氧化应激生物标志物（如蛋白质羰基化物）一样。不同组织（例如肝脏与血液）之间的差异以及种间变异性阻碍了除非实行严格标准化措施否则难以在不同研究之间直接进行比较。因此，强烈建议采用经过验证的方案和内部对照，以及统一的采样标准，以确保生态毒理学评估中GSH数据的可靠性和可比性（Browne等人，2008年；Braconi等人，2011年；Aleuy等人，2023年）。一个重要的概念限制是GSH反应的方向性模糊性。在氧化应激下，GSH浓度的增加和减少都可能发生，这取决于暴露时间、污染物类型和生理状态。在早期或中度应激下，GSH可能会由于合成的补偿性上调或巯基储备的动员而增加，而严重或长期暴露往往会导致其通过与异生物物质的结合、氧化为GSSG或合成受损而减少（Meister和Anderson，1983年；Lushchak，2012年）。因此，不应不加批判地以“降低=更差”的单向框架来解释GSH的变化。在这种情况下，還原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比率被认为比单独的GSH更具信息性。GSH/GSSG比率的下降反映了向氧化状态的转变，并更准确地反映了GSH的消耗和GSSG的积累，从而更好地捕捉了氧化还原缓冲能力（Schafer和Buettner，2001年；Jones，2006年）。因此，许多作者建议同时报告GSH和GSSG的值，或者在可行的情况下至少根据测量的GSSG或氧化还原电位估计（Eh）来解释GSH值（Freitas等人，2019a；Freitas等人，2020年；Freitas等人，2021年）。从生态毒理学的角度来看，在多重压力情况下，GSH的孤立测量可能导致结论模糊，尤其是在异生物暴露与缺氧、温度异常或营养压力共存的情况下。在这种情况下，对于相似的污染物负荷，不同的GSH反应表明了将GSH/GSSG比率与蛋白质羰基化物、TBARS和酶类抗氧化剂等互补生物标志物结合起来整合的重要性（Sokolova，2013年；Bal等人，2021年）。

3. 传统检测方法
3.1. 分析方法的发展历史
检测非酶促氧化生物标志物的方法的发展与分子生态学的进步并行。早期量化鱼组织中脂质过氧化物产物的工作可以追溯到Ohkawa等人（1979年）的开创性研究，他们应用硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定法通过其与硫代巴比妥酸的反应来测量脂质过氧化物。当时的主要目标是建立能够在种群水平影响显现之前检测亚致死效应的污染物敏感生物标志物，这种方法后来被Livingstone等人（2001年）等作者进一步巩固。多年来，分析协议不断发展，引入了更具选择性的试剂（如2,4-二硝基苯肼（DNPH）用于蛋白质羰基化物的检测和N-甲基苯基吲哚用于丙二醛的测量），以及先进的仪器技术，包括高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）。这些发展得到了Valavanidis等人（2006年）等方法学综述的支持，使得方法具有更高的特异性、更好的灵敏度和更广泛的适用性。将非酶促氧化生物标志物整合到环境监测项目中在20世纪90年代和21世纪获得了发展势头，当时TBARS、蛋白质羰基化物（PC）和還原型谷胱甘肽（GSH）的联合使用被正式认作是一种高度敏感的多参数策略。这一综合方法已成为检测水生生物受到污染时的亚致死生化反应的技术基准（Regoli和Giuliani，2014年）。在各种环境条件下进行的实证研究证实，同时评估TBARS、PC和GSH可以提供更稳健和生态相关的氧化状态诊断（Regoli和Giuliani，2014年；Moreira等人，2020年；Matias等人，2024年）。这些结果共同表明，多生物标志物框架增强了急性及慢性应激模式的检测，为解释污染物引起的生理紊乱提供了更准确的基础，并为环境决策提供了指导。尽管现在有更多选择性的色谱和质谱方法可用，但经典的比色测定方法（如TBARS和基于DNPH的蛋白质羰基化物定量）仍在应用生态毒理学中占主导地位。这种表面的方法惯性不仅仅是历史性的，它反映了环境监测的结构限制：高分辨率技术需要昂贵的仪器、专业的人员、严格的维护制度和持续的试剂供应，这些条件在常规监测实验室或资源匮乏地区很少满足（Van der Oost等人，2003年；Regoli和Giuliani，2014年；Tsikas，2017年）。此外，监管和管理机构通常偏好方法上的连续性，因为历史数据系列基于较旧的测定方法。过去和现在评估之间的时间可比性需求强调了继续使用传统方法的重要性，即使其分析特异性被认为不够理想（Dubé等人，2021年；Moulinec等人，2025年）。因此，方法选择往往不仅受到分析性能的驱动，还受到治理和物流因素的影响。最后，还有一个概念性因素：生态毒理学中的许多生态解释和阈值建议是基于TBARS、PC和GSH建立的，这增加了它们的“核心地位”。实际上，这意味着在研究环境中更倾向于采用先进的技术（例如，使用LC–MS定量特定的氧化产物），而操作监测仍然主要依赖于简单的分光光度法检测（Jardine等人，2002年；Halliwell和Gutteridge，2015年）。理解创新与应用之间的这种差异对于批判性地解读生物标志物数据以及实际规划方法转型至关重要。

3.2. 经典的检测方案：TBARS、DNPH、DTNB

硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）检测基于脂质过氧化的主要副产物甲基二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件（pH≈4）和高温（约95°C）下的反应。这种反应产生一种粉红色的有色物质（MDA–TBA?加合物），其强度在532纳米处通过分光光度法进行定量（Ohkawa等人，1979年；Janero，1990年）。最近的方法改进采用了高效液相色谱（HPLC）来分离和定量MDA–TBA?加合物，相比传统的比色法具有更高的选择性和更小的干扰（Seljeskog等人，2006年；Tsikas，2017年）。尽管如此，由于其操作简单、成本低廉和处理能力强，传统的比色法在环境研究中仍然普遍使用，尽管其特异性存在已知的局限（Leon和Borges，2020年）。表2总结了经典方法与先进TBARS方法的比较。

表2. - 水生生物中非酶促氧化应激生物标志物的经典和先进分析方法

| 目标生物标志物 | 经典方法 | 主要优点 | 关键局限性 | 当先进方法更优选时 |
| -------- | -------- | -------- | -------- | -------- |
| 脂质过氧化（MDA） | TBARS（比色法） | 简单；低成本；高通量 | 低特异性，检出限接近环境水平，多干扰物 | HPLC–TBARS或LC–MS（MDA, 4-HNE） |
| 蛋白质氧化 | DNPH–蛋白质羰基（分光光度法） | 综合标志物；稳定末端产物 | 色素/浑浊度干扰；分子分辨率有限 | 免疫印迹/ELISA或LC–MS加合物分析 |
| 氧化还原状态 | DTNB–GSH（比色法） | 快速；可能适用于现场 | 不需要纯化即可测量总巯基；解释模糊 | HPLC分离GSH/GSSG；氧化还原电位估计 |

然而，在需要精确定量MDA时，或样品中含有高水平糖类、胆红素、血红蛋白或多酚类物质（这些物质会生成与TBA反应的加合物），或预期浓度接近方法的检测限时，应避免使用TBARS（Tsikas，2017年）。在自然环境中，背景脂质过氧化产物通常很低（亚微摩尔级别），接近或低于经典比色法的检出限；在这种情况下，建议使用HPLC–TBARS或LC–MS方法以避免假阳性并提高分析选择性（Moselhy等人，2013年；Seljeskog等人，2006年；Tsikas，2017年）。

蛋白质羰基的定量涉及用2,4-二硝基苯肼（DNPH）对氧化的羰基进行衍生化，生成在大约370纳米处有强吸收能力的稳定腙衍生物（Levine等人，2000年；Wehr和Levine，2013年；Weber等人，2015年）。标准协议包括用三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白质，用溶剂混合物（例如乙醇:乙酸）多次洗涤以去除残留的DNPH，然后将蛋白质颗粒溶解在缓冲液中或胍中，再进行分光光度分析（Georgiou等人，2018年）。或者，使用抗DNP抗体的免疫检测方法，如Western blotting或酶联免疫吸附测定（ELISA），虽然它们在环境研究中的使用受到成本较高和需要专业实验室基础设施的限制（Colombo等人，2016年），但具有更高的选择性和灵敏度。这些方法的优点和局限性在表2中进行了总结。基于DNPH的分光光度法特别容易受到核酸、有色色素和样品浑浊度的干扰，这些因素可能人为地提高360–380纳米处的吸光度（Dalle-Donne等人，2003年）。此外，在基线羰基含量较高的组织中，污染引起的增加可能落在分析噪声范围内，限制了诊断能力（Weber等人，2015年）。在这种情况下，免疫化学检测方法如OxyBlot或ELISA，或通过LC–MS识别特定蛋白质加合物，提供了更高的分析敏感性和分子特异性（Dalle-Donne等人，2003年；Weber等人，2015年），在这种情况下，表2中列出的先进方法更可取。

GSH的定量通常使用5,5′-二硫双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）进行，它与巯基反应生成黄色的5-硫-2-硝基苯甲酸（TNB）。生成的有色物质在412纳米处通过分光光度法进行测量（Smith等人，1988年；Rahman等人，2006年）。为了最小化样品处理过程中的人为氧化，协议建议立即酸化，通常使用磺osalicylic acid（SSA），并使用还原剂保持谷胱甘肽的还原形式（Rahman等人，2006年）。

在更先进的分析背景下，HPLC能够精确区分GSH及其氧化形式（GSSG），更准确地反映细胞的氧化还原状态，并有助于生成详细的氧化生物标志物谱型（Giustarini等人，2016年；Nuhu等人，2020年）。从经典DTNB检测方法过渡到先进色谱或质谱方法的条件在表2中进行了说明。重要的是，基于DTNB的方法只能定量总自由巯基，如果样品纯化不足，则无法区分GSH和其他低分子量巯基（Schafer和Buettner，2001年）。在GSH浓度非常低的情况下，这些方法的可靠性也较差，这种情况常见于营养极度贫乏或寒冷的环境中，此时检测限可能超过生理浓度。在这种情况下，建议使用衍生化结合HPLC或荧光检测，特别是当GSH/GSSG比值是关注变量时（Schafer和Buettner，2001年；Jones，2006年）。

总体而言，由于其经济性和高通量，TBARS、DNPH和DTNB协议在大规模生物监测中仍然有其适用性；然而，必须明确承认它们的局限性（Van der Oost等人，2003年；Regoli和Giuliani，2014年）。方法选择应根据预期的浓度范围、基质组成、对分子特异性的需求，以及是否需要历史可比性或机制分辨率来决定（Dalle-Donne等人，2003年；Schafer和Buettner，2001年；Jones，2006年），这些在表1中进行了概念性总结，并在表2中进行了操作细节说明。

3.3. 色谱和分光光度分析：进展与局限性

分光光度方法，如TBARS检测，在环境生态毒理学中仍然广泛使用，因为它们操作简单、成本低廉且易于大规模应用，特别是在基础设施有限的背景下（Osyczka等人，2023年）。然而，其灵敏度和选择性可能会受到样品基质中的干扰，例如其他醛类或反应性色素的存在。这些成分在与TBA反应时与目标分析物竞争，导致结果被高估，这在比色法与HPLC的比较研究中得到了验证（Janero，1990年；Rizzo，2024年）。此外，样品制备中的缺陷，包括孵育时间、温度的变化，或沉淀后用三氯乙酸去除试剂不充分，可能会引入显著的分析偏差，从而在没有严格标准化的情况下限制数据的准确性（H?rak和Cohen，2010年；Rizzo，2024年）。

色谱技术的进步，特别是与质谱（LC–MS/MS）和GC–MS结合的技术，在识别脂质氧化产物（如异前列腺素和氧化醛类）方面提供了更高的特异性。这些改进大大减少了使用传统分光光度方法时常见的不确定性（Milne等人，2013年）。然而，这些方法需要复杂的设备、专业的技术培训和强大的基础设施，并且操作成本较高，这限制了它们在常规环境监测程序中的使用。这些限制在技术能力有限和实验室基础设施不足的地区尤为明显（Barceló和Petrovic，2007年；Hollender等人，2023年）。

除了这些限制外，色谱技术还面临生态和分析上的挑战。环境样品通常具有较高的化学复杂性，共洗脱的天然产物以及变化的盐度或有机物含量可能会抑制LC–MS中的离子化，从而在未受污染或营养贫乏系统的低浓度范围内增加不确定性（Matuszewski等人，1998年；Trufelli等人，2010年）。在这些条件下，方法验证需要广泛的校准和基质匹配的标准，而这些在常规监测中很少可用（Matuszewski等人，1998年；Fu等人，2024年）。另一个重要限制是检测限和生态解释。LC–MS方法能够检测到非常低浓度（通常是纳摩尔级别）的多种氧化脂质产物（Milne等人，2013年）。然而，在自然种群中，组织、个体和物种之间的生物变异性经常超过分析精度，这意味着仪器检测到的差异不一定反映生态学上的相关模式（Sokolova，2013年；Regoli和Giuliani，2014年）。因此，即使测量非常精确，当背景变异较大或生物同时暴露于多种压力源时（这在自然环境中很常见），也可能无法得出清晰的生态推断（Sokolova，2013年）。

为了调和分析的稳健性和操作的可行性，采用混合协议是一种有前景的策略。在这种框架下，分光光度检测（如TBARS、DNPH、DTNB）被用作高通量筛查工具，以识别可能存在氧化还原不平衡的样品或地点。随后，使用色谱技术（HPLC、LC–MS/MS）重新分析一部分样品以确认结果、定量特定的氧化产物并排除基质干扰（Van der Oost等人，2003年；Regoli和Giuliani，2014年；Tsikas，2017年）。混合设计通过将高复杂性仪器的使用限制在少数重点样品上，同时增强了从常规分光光度检测中获得的解释的稳健性。这些设计在大规模生物监测项目中特别有利，其中必须快速处理数百个样品，但监管或管理决策需要对一小部分关键情况进行确认性、化合物特异性的分析（Brack等人，2016年）。实际上，这种方法还有助于从传统分析平台逐步过渡到先进分析平台，同时保持历史数据集的连续性，并逐步整合化合物特异性信息。

3.4. 实验室间变异性和标准化努力

在环境监测项目中应用非酶促生化指标（如TBARS、蛋白质羰基和GSH）时，实验室间的变异性仍然是一个主要挑战。即使协议表面上相同，样品制备、试剂纯度和来源、反应时间以及设备校准的微小差异也可能导致结果的重大差异（Buenger等人，2006年；Dominutti等人，2025年）。证据表明，方法上的不一致性损害了全球数据集的可比性，并阻碍了稳健参考值的建立（Hollender等人，2019年）。这些局限性强调了需要统一的协议和严格的实验室实践。推荐的措施包括定期校准和验证分析设备以确保准确性和精度；在采购和储存过程中使用经过认证的试剂和明确定义的质量控制程序；在每个分析批次中实施阳性和阴性对照；参与能力测试和实验室间比较练习（ISO/IEC 17043）；以及使用由合格参考材料生产商支持的认证参考材料（ISO 17034）和适当的参考材料表征指南（ISO Guide 35）。遵守如ISO/IEC 17025:2017等国际标准化框架对于保证结果的可重复性和可靠性至关重要，特别是在跨国监测网络中。

遵守国际标准化框架（如ISO/IEC 17025:2017）对于保证结果的可重复性和可靠性至关重要，特别是在跨国监测网络中。最近在分子生态毒理学和新污染物分析中的实验室间试验展示了遵循标准化指南的重要性。只有持续和系统地应用这些程序，才能在不同实验室和不同地理区域生成的数据集之间进行有意义的比较（McIlwraith等人，2025年；Rodriguez等人，2025年）。因此，方法标准化不应仅仅被视为一种监管要求，而应被视为一种战略性的必然。当分析程序在不同研究中得到协调时，所得到的非酶促氧化生物标志物数据在技术上变得可比较，在科学上也更加一致，从而加强了它们作为可靠的环境管理和管理工具的用途。

在相关环境领域已经实施了具体的标准化举措。欧洲的ICES/OSPAR联合监测计划为海洋生物中的生物标志物分析建立了共同的QA/QC指南，包括标准操作程序、交叉校准练习和环测试。同样，波罗的海的HELCOM计划促进了污染物和生物标志物测定的协调协议和集中式能力测试。这些举措展示了在实验室间标准化氧化生物标志物分析的可行途径。

3.5. 人为误差风险、质量控制和文献建议

传统的检测非酶促生化指标的方法容易受到多种分析人为误差的影响，包括由于储存不当导致的样品降解、交叉污染以及处理过程中的非特异性化学反应（Santana等人，2018年；Nakayasu等人，2021年）。为了最小化这些风险，文献强调了采用严格实验室操作规范的重要性。这些措施包括精确控制处理时间和储存温度，使用惰性和无污染物的容器，以及添加酶抑制剂以防止采集后的生化变化。此外，分析协议的每个步骤都应通过回收测试进行验证，包含内部标准，并实施盲法和随机化程序以减少偏差（美国环境保护署（US EPA），2009年；Nakayasu等人，2021年）。研究还强调了在处理受复杂污染物混合物影响的生态系统时并行使用多种生物标志物的重要性，从而涵盖不同的生物组织层次，并整合分子、生理和组织学反应（Van der Oost等人，2003年；Hook等人，2014年；Lomartire等人，2021年）。因此，这些数据的解释必须具有特定背景，考虑生物变量，如物种、性别和发育阶段，以及环境因素，包括当地条件、季节性和共存污染物。此外，必须考虑技术因素，如测定灵敏度、方法变异性和批次效应，以确保评估的可靠性和生态学意义（Hagger等人，2006年；Dalzochio和Gehlen，2016年；Santana等人，2018年）。这种综合方法对于将生物标志物转化为应用生态毒理学中的可靠和可行的工具至关重要。通过建立生物分子反应与生态影响之间的关联，并在多种环境压力下识别出一致的模式，这种方法增强了基于生物标志物的评估的预测和诊断价值（De Coen等人，2000年；Connon等人，2012年；Ghisi等人，2017年）。实际上，TBARS、DNPH和DTNB测定中最常见的误差来源可以分为五类：由于冷冻或解冻周期延迟造成的分析前降解；来自增塑剂、血红蛋白或色素的污染；TBA和DNPH与无关醛类或酮类的非特异性反应；由于温度和孵育变异性导致的分析漂移；以及由于忽视检测和定量限而产生的误解。在方法规划期间明确识别这些类别可以显著减少整个分析链中的误差传播（Dalle-Donne等人，2003年；Luo和Wehr，2009年；Giustarini等人，2016年；Tsikas，2017年）。为了便于实际实施这些建议，应用TBARS、蛋白质羰基和基于谷胱甘肽的生物标志物进行环境生物监测的主要最佳实践可以总结如下：（1）样品处理和保存应尽量减少采集和冷冻之间的延迟（最好≤30-60分钟），尽可能使用液氮快速冷冻，避免重复冷冻-解冻周期，并在≤-80°C下保存，同时记录保存时间；（2）为防止采集后的生化改变，在分析GSH/GSSG时需要立即添加合适的抑制剂或还原剂，以避免人为氧化或还原；（3）污染控制应包括使用惰性容器，防止光照，并仔细筛查潜在的干扰物，如色素、血红蛋白、糖类、金属和腐殖物质；（4）分析验证应包括试剂和基质空白对照、阳性和阴性对照、适用于环境浓度范围的校准曲线，以及明确报告检测限（LOD）和定量限（LOQ）；（5）必须通过重复或三倍分析验证精确度和仪器性能，评估批次内和批次间的变异性，以及定期检查分光光度计的准确性和基线稳定性；（6）数据解释应优先考虑多终点框架，并在生物学上有必要时，使用基于比值的指数，如GSH/GSSG，而不是仅依赖单一生物标志物的测量。这些操作建议通过图1所示的质量控制工作流程付诸实践，该流程将分析步骤组织成从采样到最终生态解释的结构化决策序列。

图1. 说明基于生物标志物的生态毒理学评估中应用的质量控制程序的流程图，包括样品完整性保证、分析偏差最小化、验证标准以及导致有限预测价值或具有生态学意义的决策路径。

4. 实际挑战
总体而言，使用氧化应激生物标志物进行环境监测的挑战可以根据其对数据可靠性的影响进行分类。关键挑战是那些可能导致结果无效的挑战（例如，降解、保存不当、培训不足）。操作挑战主要影响可行性和连续性（例如，成本、物流）。解释挑战与生物标志物反应的生态学意义和整合有关（Van der Oost等人，2003年；Livingstone，2001年；Regoli和Giuliani，2014年；Hook等人，2014年）。

4.1. 样品采集、运输和保存（关键挑战）
生物材料的采样阶段和随后的运输是确保OS研究数据可靠性的两个关键步骤。许多氧化还原生物标志物，特别是非酶促的，非常不稳定，容易因环境温度、过度氧化和采集与分析之间的延迟而迅速发生变化。这些条件可能导致处理前的生物标志物水平发生实质性变化，从而可能损害数据准确性（Nuhu等人，2020年；Venter等人，2021年）。一个显著的例子是GSH，它非常不稳定；在室温下，如果分析前处理不足，采样与立即稳定之间的延迟可能导致测量浓度减少约25%（Nuhu等人，2020年）。同样，脂质过氧化副产物在生物体死亡后可能会继续积累，特别是在缺乏适当保存的情况下，导致测量样品中氧化应激水平的过高估计（Melvin等人，2022年；Fanti等人，2025年）。鉴于许多氧化应激生物标志物的敏感性，强烈建议立即进行稳定处理。生物样品应使用液氮冷冻（冷冻保存）或储存在干冰上，以停止采集后的生化反应并保持原始的氧化还原状态（Melvin等人，2022年）。然而，在野外工作中维持这种保存条件，尤其是在偏远或物流困难的环境中，可能会很困难，从而限制了严格的保存协议的实施，并对大规模或常规环境监测构成了重大障碍（Venter等人，2021年；Melvin等人，2022年）。由于降解过程是不可逆的，这一阶段的失败会带来一个关键挑战，可能会使分析结果无效。

4.2. 环境和暴露介质因素的影响：pH值、温度和生物基质（关键/解释挑战）
采样点的环境异质性以及受控暴露条件下的物理化学变异性会显著影响生物标志物的稳定性，从而影响分析性能。非生物参数如水pH值和环境温度会影响还原型谷胱甘肽（GSH）和抗氧化酶的氧化还原平衡，从而直接影响检测到的生物标志物水平（Hu等人，2015年）。这些参数不仅在自然环境中变化，在实验设计中使用的暴露介质中也会有所不同，影响污染物的形态和生物利用度，进而影响氧化反应。特别是大的温度波动可能会加剧脂质过氧化，这表现为TBARS水平的增加和酶活性（如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的变化（Wojtal-Frankiewicz等人，2017年；Recabarren-Villalón等人，2024年）。也有研究记录了水pH值变化的影响，最近的综述将pH值和氧化水平的变化与鱼类中增强的氧化反应相关联（Recabarren-Villalón等人，2024年）。生物基质，无论是肝脏、肌肉、鳃还是其他组织，在分析试剂的效率中也起着关键作用，因为脂质、蛋白质和金属含量的差异可能干扰生物标志物的提取和定量（El-SiKaily和Shabaka，2024年；Borkovi?-Miti?等人，2024年）。针对水生物种的实验研究表明，组织类型（例如，生殖腺、肝脏、鳃）和污染物暴露会产生不同的酶促和非酶促特征，包括SOD、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的变化。这些发现突显了需要针对基质对分析协议进行特定验证，以确保研究的准确性和可比性（Borkovi?-Miti?等人，2024年）。这些因素不仅仅是增加了数据的噪声；它们还塑造了生物标志物的基线，因此构成了一个主要的解释性挑战，因为生态背景对于正确解释数据至关重要。

4.3. 紧急情况下快速响应的限制（操作挑战）
在环境紧急情况下，如工业事故、石油泄漏、废水排放或大规模死亡事件中，分析结果的及时性对于指导即时响应和缓解措施至关重要。然而，传统的非酶促生化指标分析方法通常涉及多个实验室步骤、长时间的样品运输和漫长的处理时间，这使得实时或接近实时的现场诊断变得不切实际。例如，石油泄漏的生态毒理学评估经常受到操作延迟和缺乏标准化协议的限制，限制了生物标志物在紧急情况下的实际应用（Colvin等人，2020年）。因此，环境影响因素发生与分析数据可用之间的时间间隔往往与此类事件所需的快速决策不相容。新兴分析技术的综述强调了生物传感器、微流控平台和集成即时检测（POC）系统在加速生物标志物检测和数据输出方面的潜力，这些技术在临床诊断中已经证明了通过显著减少处理时间取得了成就（Shin等人，2019年）。这些创新中的许多都具有便携性和低成本的特点，具有适应现场环境监测的潜力（Rafat等人，2023年）。这构成了一个操作挑战：结果仍然有效，但它们的延迟可用性限制了它们在即时决策中的实用性。

4.4. 运营成本和物流限制（操作挑战）
高纯度试剂和仪器的高昂成本以及采购成本仍然是低收入和中等收入国家科学研究和环境监测的主要限制。这些结构性限制导致延迟、运营成本增加以及长期监测计划的连续性降低（De Melo和Solleder，2020年）。在这些情况下，物流挑战还包括官僚主义障碍，如严格的海关检查、特定的许可要求和行政延迟，这些都可能推迟或危及长期环境监测计划。许多这些困难源于非关税壁垒，如技术检查、原产地规则和许可程序，最终增加了进口过程的成本和复杂性（De Melo和Solleder，2020年）。此外，高质量分析投入的有限获取阻碍了技术转移，并限制了先进环境分析方法的采用（De Melo和Solleder，2020年）。

4.5. 技术能力和机构障碍（关键挑战）
非酶促生化指标分析的可靠性不仅取决于适当的实验室基础设施，还取决于参与样品采集、处理和数据分析的人员的技术能力。执行敏感协议（如量化脂质过氧化产物（TBARS）或氧化蛋白质损伤（PC）的准确执行需要严格的培训和持续的专业发展（Dakappagari等人，2017年）。然而，许多环境监测计划受到人员高流动率、缺乏持续能力建设计划以及缺乏保留专业人员的结构化策略的影响。在许多地区，尤其是在资源匮乏的情况下，专门培训的资金有限和人力资源保留的机构弱点削弱了分析团队的稳定性和连续性（Dakappagari等人，2017年）。这些限制影响了时间序列数据的稳健性，并妨碍了比较性，特别是在长期监测工作中。此外，缺乏稳定的技术团队阻碍了机构技术记忆的建立，迫使每次更换工作人员时都必须重新开始培训过程。克服这些障碍需要持续投资于专业培训、标准化的能力建设项目以及旨在保留专业人员的激励措施。由于技术错误可能会引入误差或误解，这一类别代表了另一个直接影响数据可靠性的关键挑战。

4.6. 多参数方法：非酶促氧化生物标志物的整合（解释挑战）
分析单一生物标志物很少能够全面捕捉生物对氧化应激的复杂反应，特别是在受到复杂污染物混合物影响的环境中。因此，许多研究建议采用多参数方法，整合互补的指标，如TBARS（脂质过氧化）、蛋白质羰基（蛋白质氧化）和还原型谷胱甘肽（细胞氧化还原状态），以及抗氧化酶（例如，SOD、CAT、GPx），必要时还包括基因毒性或免疫毒性标志物（Cant等人，2022年；Ahmad等人，2024年）。这种综合策略提高了诊断灵敏度，并改善了区分不同类型和强度污染区域的能力。即使在传统物理化学参数无法完全揭示累积毒性程度的情况下，它仍然有效。在受到工业和城市活动影响的河流流域、热带淡水系统和河口进行的比较研究表明，结合多种生物标志物可以更准确地识别环境压力梯度（Ghisi等人，2017年；Sousa等人，2021年；Abdallah等人，2024年）。然而，这种方法的有效应用取决于严格的方法标准化，包括明确的生物标志物选择标准、协调的采样协议、标准化的样品制备程序和一致的数据分析框架，以确保研究的可重复性和可比性、生态系统和地理区域之间的可比性。这主要代表了一个解释上的挑战：它并不削弱个别生物标志物的有效性，而是确定如何一致地整合多条证据。5. 最近的趋势和替代技术 5.1. 传统协议的自动化（已经测试并投入使用的技术）近年来，人们越来越重视自动化非酶促氧化生物标志物的检测协议，目的是减少分析时间、最小化人为错误并提高结果的可重复性。国际领先的实验室投资了机器人 pipetting 系统、自动化微孔板 reader 和先进的数据处理软件，使得能够以更快的速度和更高的精度同时分析大量样本。例如，pipetting 自动化在准确性和效率方面取得了显著提升，特别是在处理纳升级别的微量样本时，大大减少了手动 pipetting 的变异性（Kong et al., 2012; Steffens et al., 2017）。同样，自动化微孔板读取平台也有了显著的改进：新开发的系统现在可以在几分钟内对多个样本进行全光谱扫描，其灵敏度高于传统的单波长 reader（Steffens et al., 2017）。与此同时，基于生物传感器的自动化平台、流动分析系统、微流控设备和自动化免疫测定技术的进步使得从样本准备到定量结果输出的全过程几乎不需要人工干预（Kong et al., 2012; Yang et al., 2022; Raju et al., 2024）。对于成本控制优先的场合，基于开源硬件的低成本 pipetting 机器人已经在多孔板生态毒理学检测中展示了强大的性能和实用性，显示出在环境监测应用中的巨大潜力（Steffens et al., 2017）。综合评论确认，实验室自动化提高了实验的可重复性，减少了操作者带来的变异性，并有助于处理大量样本，这对于像生物标志物分析这样的敏感协议至关重要（Steffens et al., 2017）。这些自动化方法源自已经在生态毒理学中广泛应用的成熟技术，特别是用于检测脂质过氧化的 TBARS、基于 DNPH 的蛋白质羰基测定以及基于 DTNB 的硫醇定量（Esterbauer 和 Cheeseman, 1990; Dalle-Donne et al., 2003; Valavanidis et al., 2006）。由于这些自动化方法保留了传统检测的核心分析化学原理，因此有助于与历史数据集的连续性，并减少操作者依赖的变异性，支持其在常规实验室工作流程中的实施（Regoli 和 Giuliani, 2014）。然而，自动化并不能解决内在的分析限制，例如 TBARS 对 MDA 的低化学特异性以及与基质相关的干扰，这些仍然是解释和跨研究比较的主要障碍（Tsikas, 2017）。5.2. 环境传感器和便携式设备（过渡技术——部分验证）另一个新兴趋势是开发可以直接在采样现场进行快速测量的便携式环境传感器。利用电化学、光学或比色转换的生物传感器已经被用于监测物理化学参数和某些酶促生物标志物（Bui et al., 2023; Du, 2024）。与智能手机和移动平台的集成进一步扩展了实时数据的可访问性，通过云计算和人工智能（AI）实现了自动化分析（Xing et al., 2025）。尽管将便携式设备应用于非酶促氧化生物标志物的范围仍然有限——主要是由于选择性和基质干扰及试剂稳定性方面的挑战——但这些技术障碍正在逐步得到解决。材料科学、纳米技术和生物技术的进步现在提供了新的途径来提升传感器性能，表明便携式和现场即用的检测系统可能很快就能实现（Li et al., 2024）。这些设备处于成熟技术和新兴技术之间的中间位置：虽然便携式传感平台在技术上已经成熟，但它们对于氧化应激生物标志物（如 TBARS、蛋白质羰基和 GSH）的监管验证尚未完成，特别是在复杂的環境基质中，其中分析干扰持续存在且缺乏标准化的阈值（Dalle-Donne et al., 2003; Yetisen et al., 2013; Regoli 和 Giuliani, 2014; Tsikas, 2017）。5.3. 微流控平台和“芯片实验室”（概念性/预监管技术）微流控设备的发展，通常称为“芯片实验室”，是实现环境分析微型化和便携化的最有前景的创新之一（Wang et al., 2020; Alhalaili et al., 2022; Aryal et al., 2024）。这些平台将混合、反应、分离和检测等多个分析步骤整合到一个芯片上，只需要极少量的试剂和样本（Wang et al., 2020）。微流控技术已经成功用于检测环境样本中的重金属、营养物质和选定的酶促生物标志物（Alhalaili et al., 2022; Aryal et al., 2024）。然而，对于非酶促氧化生物标志物的验证，特别是在复杂的環境基质中，仍处于开发的早期阶段（Dou et al., 2024）。这一差距突显了需要针对性研究来适应 TBARS、PC 和 GSH 的化学特异性，最终使其能够集成到快速、低成本的環境监测系统中。除了分析能力外，芯片实验室设备还支持现场分析，提供了协议完全自动化的潜力，并可以与数字系统结合进行实时数据采集和远程监测（Xiao et al., 2024; Antonelli et al., 2024）。这些特性使它们特别适合快速响应监测和在偏远或资源有限的地区部署。然而，在现阶段，大多数这些平台仍应被视为概念性或预验证的解决方案。它们的性能主要在受控实验室条件下得到证明，仍需进行大规模的实验室间验证才能纳入监管监测计划（Yetisen et al., 2013; Mesquita et al., 2022; ISO/IEC 17025:, 2017）。5.4. 验证和标准化挑战尽管替代分析技术具有创新潜力，但在不同物种、组织和环境基质之间验证这些方法仍面临重大挑战。要实现广泛的适用性，需要进行严格的实验室间测试，并遵守国际认证和标准化协议，如 ISO 16140-2（ISO, 2024）中规定的标准。只有通过这种方法学上的协调，这些新兴技术才能获得有效纳入常规环境监测和监管框架所需的可靠性。特别是在仍处于发展阶段的微流控技术中，目前缺乏广泛认可的评估设备性能、可靠性和安全性的标准（Reyes et al., 2021; Natu et al., 2023）。监管要求包括内部和实验室间的结构化验证程序，以证明方法的选择性、可重复性和在不同基质中的稳健性（美国环境保护署 (US EPA), 2009）。根据 ISO 17034/17035 指南的一致使用认证参考材料对于确保全球范围内的结果可比性至关重要。一个核心难点是氧化应激生物标志物代表的是生物反应而不是简单的化学分析物。因此，验证不仅必须考虑分析性能，还必须考虑生物学和生态学相关性，包括与不良结果途径和生物体适应性的联系（Van der Oost et al., 2003; Hagger et al., 2006）。这种双重要求——方法必须在分析上稳健且在生物学上有意义——有助于解释新生物标志物技术监管采纳相对缓慢的原因，以及最近评论中表达的持续谨慎态度（Lomartire et al., 2021）。在这种情况下，自动化的传统分光光度测定方法可以视为最接近监管准备就绪的技术，而便携式传感器平台则更应被视为处于操作验证阶段的过渡技术。相比之下，集成人工智能的微流控设备和系统仍然是概念性的，虽然有望实现快速和分散的分析，但仍处于早期验证和标准化阶段（Yetisen et al., 2013; Mesquita et al., 2022）。6. 未来展望及其对公共政策的相关性 6.1. 非酶促生物标志物在生态风险评估中的未来前景在未来几十年内，非酶促生化指标预计将从主要的学术工具发展为实时环境监测系统的组成部分。将 TBARS、PC 和 GSH 与便携式传感器、微流控平台和地理参考数据库集成，可以实现近乎实时的诊断，显著缩短从影响检测到采取缓解措施之间的时间（Leprêtre et al., 2022; Mazaher et al., 2024）。建立特定物种和生态系统的阈值将是减少误解和促进国际层面标准化比较的关键步骤（Leprêtre et al., 2022）。此外，来自受采矿活动影响的欧洲沿海地区和巴西河口的案例研究表明，将生化数据与生态和社会经济指标结合可以显著增加它们对环境决策和公共政策制定的影响（Gabriel et al., 2020; Viarengo et al., 2007）。然而，目前限制这些生物标志物被明确监管采用的主要障碍是大多数非酶促指标缺乏法律认可的参考范围或效应阈值。美国环境保护署 (US EPA) 和欧洲化学品管理局 (ECHA) 等机构主导的监管框架很少将 TBARS、蛋白质羰基或谷胱甘肽指标作为主要决策标准；相反，它们更常被视为更广泛的证据权重方法中的辅助证据（Suter et al., 2017; Manfra et al., 2021）。实际上，现行的监管指南强调在评估生态风险时需要经过验证的协议、相关性和可靠性的证明，以及多源信息的整合（OECD, 2019）。在缺乏 ISO/OECD 验证的方法、稳健的剂量-反应关系和可辩护的群体水平推论的情况下，氧化应激生物标志物很少被接受为生态损害的独立证据，无论是许可、合规监测还是诉讼场合（OECD, 2019）。这种监管差距有助于解释为什么许多官方监测计划仍然主要依赖于物理化学参数和社区层面的生物指标，即使有高质量的生物标志物数据集可用。6.2. 对技术创新和科学资金的需求非酶促生化指标在大规模监测计划中的扩展依赖于技术创新和可持续科学资金的并行进展。诸如流动微装置、生物传感器和基于智能手机的分析系统等有前景的技术已经证明了其在快速、低成本环境评估中的概念验证潜力，但仍有待在不同环境基质和操作条件下进行验证（Zhang et al., 2023; Mazaher et al., 2024）。这些系统的自动化及其与人工智能的集成将改善生化响应模式的分析。这种集成还将允许将这些响应与复杂的環境压力相关联，支持更准确的预测模型的发展（Leprêtre et al., 2022）。然而，这些创新的成功实施取决于长期的财务稳定性和优先考虑应用科学的公共政策。从长期监测计划（如 LTERs）以及欧洲和拉丁美洲的大学和研究所协调的计划中的经验来看，持续的资金支持对于维护基础设施、培训人员和支持合作网络至关重要（Viarengo et al., 2007; Gabriel et al., 2020; Cordeiro et al., 2022）。与此同时，监管验证需要的投资远远超出了单纯的技术开发。实验室间循环测试、熟练度试验和认证参考材料的可用性是国际质量保证框架（如 ISO/IEC 17025）下方法认证的必要元素（ISO/IEC, 2017）。国际分析验证指南强调，可靠的监管方法必须在不同实验室之间表现出可重复性、参与外部熟练度计划，并能够追溯到认证参考材料，所有这些都需要大量的财务和后勤投资（Magnusson 和 ?rnemark, 2014）。实际上，这些过程在环境监测预算中往往没有得到足够的重视，这解释了许多有前景的分析平台仍局限于学术研究环境，未能达到常规监测或法律执行所需的监管稳健性水平。6.3. 对水资源管理和保护的潜在影响将非酶促氧化生物标志物系统地纳入环境监测计划有可能显著提升水资源管理和保护策略，尤其是在受到多重人为压力影响的生态系统中。这些生物标志物能够在群体层面影响显现之前检测到水生生物的亚致死生理变化，为实施有针对性的纠正措施提供了关键的时间窗口（Valavanidis et al., 2006; Leprêtre et al., 2022）。当与地理信息系统 (GIS) 和实时分析平台集成时，生物标志物数据可以转化为动态的环境风险地图。这些工具促进了科学家、政策制定者和公众之间的沟通，增强了透明度并促进了基于证据的决策（Viarengo et al., 2007; Gabriel et al., 2020）。这种方法不仅有助于优先考虑高风险区域进行干预，还支持对污染控制措施效果的持续评估，从而促进适应性管理和长期生态系统韧性。然而，为了让这些工具在公共政策中产生系统性影响，监管框架必须明确承认生物标志物证据在环境许可、影响评估和损害补偿过程中的有效性。未来的进展不仅取决于方法论的改进，还依赖于环保机构在如何解释生物标志物阈值以及如何将其纳入法律和管理决策方面提供更清晰的指导（Suter等人，2017年；经合组织，2019年）。7. 结论 本综述表明，非酶性氧化应激生物标志物——TBARS、蛋白质羰基（PC）和谷胱甘肽（GSH）——是检测水生环境中亚致死污染效应的高度敏感且生物学上具有重要意义的工具，支持了对淡水、河口和海洋生态系统的环境评估。然而，它们的广泛应用仍受到一些持续存在的挑战的制约，包括实验室间差异、缺乏生态学依据的参考范围以及方法论标准化不足。除了这些操作层面的挑战外，本综述也具有一定的固有限制。现有文献在实验设计、分析程序、生物模型和研究的环境基质方面存在很大的异质性。这种差异性使得研究之间的直接比较变得复杂，并可能影响不同物种和生态系统中共性生物标志物反应的普遍性。此外，大多数研究是在实验室或半控制条件下进行的，而很少有研究评估这些生物标志物在多种环境压力因素同时作用下的表现。解决这些限制需要立即采取协调一致的行动。应优先采用统一的分析方案，实施严格的质量保证和质量控制（QA/QC）框架，并采用综合的多生物标志物方法，而不是依赖单一指标。虽然新兴的分析技术和便携式平台在扩大空间和时间覆盖范围方面具有很大潜力，但由于在复杂环境基质中的验证不完全以及缺乏监管认可，它们在常规污染监测程序中的应用仍然受到限制。目前，TBARS、PC和GSH应作为证据权重框架中的补充指标来使用，而不是作为独立的诊断终点。它们能否完全融入环境监测和决策过程，最终将取决于大规模、协调一致的努力，以实现方法论的统一、特定基质的验证和正式的监管认可。如果这些条件得到满足，非酶性氧化应激生物标志物有可能从辅助工具发展成为下一代水污染监测和环境管理策略的核心组成部分。

CRediT 作者贡献声明：
Maira Lima：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法论、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Rosa Freitas：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、验证、监督、方法论、概念化。
Lucas Nunes：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、方法论。
Thiago Matos：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、方法论。
Ricardo Coutinho：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、项目管理、资金获取。
Lohengrin Fernandes：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法论、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。