Comammox Nitrospira在森林景观中的丰度及其对硝化作用的贡献

《Ecosphere》：Comammox Nitrospira abundance and contribution to nitrification in a forested landscape

　　摘要

在陆地生态系统中，硝化作用由NH4+氧化细菌（AOB）和古菌（AOA）介导。目前，我们对生理能力和环境耐受性如何影响它们的群落组成知之甚少，也不清楚这些组成差异又如何反过来影响硝化作用。最近发现的comammox Nitrospira能够将NH4+完全氧化为NO3?，这与AOA和AOB不同，这进一步增加了理解这一过程的复杂性。通过研究一系列北温带森林，我们探讨了NH4+氧化微生物的丰度如何响应NH4+可用性和土壤pH值的共同变化。我们使用定量聚合酶链反应（qPCR）来评估comammox Nitrospira的丰度，并将其与AOA和AOB的丰度进行比较。重要的是，在大多数地点都未检测到comammox Nitrospira的存在，只有在NH4+供应量最大的地方才有所发现；而AOA（10^6拷贝/克）和AOB（10^7拷贝/克）的丰度较低，且分布更为均匀。土壤pH值与comammox Nitrospira的丰度显著相关，呈现出在pH约5.0时达到最大值的单峰分布。在我们研究的森林中，硝化作用这一生物地球化学过程是由AOA、AOB和comammox Nitrospira相对丰度的变化所介导的，从而将群落组成与功能联系起来。

引言

尽管硝化作用是陆地和水生生态系统中一个全球重要的生物地球化学过程，但尽管经过数十年的研究，我们对塑造这一过程所涉及的微生物的组成、多样性和功能的生态因素的理解仍然不完整。例如，人们曾认为氨氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）这两类化能自养细菌分别负责将铵氧化为硝酸盐（即NH4+氧化为NO2?和NO2?氧化为NO3?）的两个步骤，但在多种环境中发现氨氧化古菌（AOA）后，我们不得不重新评估对这一生物地球化学过程的生态理解（K?nneke等人，2005年）。这些古菌在陆地和水生生态系统中的数量可能超过AOB（Leininger等人，2006年），并且由于生理能力的差异，AOB和AOA的组成和丰度会随着环境因素（如NH4+可用性和pH值）的变化而变化（Wen等人，2024年）。由于硝化作用中的限速步骤是NH4+氧化，因此对这些NH4+氧化微生物群落组成的了解对于理解硝化作用的功能具有重要意义（K?nneke等人，2005年；Treusch等人，2005年）。此外，最近发现的Nitrospira A和B类细菌（Daims等人，2015年；van Kessel等人，2015年）的基因组编码了NH4+和NO2?氧化的生化途径，这进一步增加了理解NH4+氧化微生物组成变化如何影响硝化作用生物地球化学过程的复杂性（Daims等人，2015年；Kits等人，2017年）。有几种原因表明，comammox Nitrospira与其他NH4+氧化土壤微生物之间的生理差异会导致它们在环境梯度上的丰度变化，从而改变它们对硝化作用的相对贡献（Qin等人，2024年）。首先，comammox Nitrospira以前未知，但现在发现它们存在于多种陆地和水生环境中（Meng等人，2023年；Xia等人，2018年；Zhao等人，2019年）。基因组和生理学研究表明，comammox Nitrospira对NH4+具有更高的酶亲和力（即更低的Km值），这可能使它们在低NH4+环境中相对于AOA和AOB（具有更高的Km值）具有竞争优势（Palomo等人，2022年；Qin等人，2024年）。虽然pH值是影响AOA和AOB丰度和组成的重要因素（Norman & Barrett，2014年；Prosser & Nicol，2012年；Stempfhuber等人，2015年；Wen等人，2024年），但我们尚不清楚pH值如何影响comammox Nitrospira的环境分布，尤其是在陆地生态系统中。在森林土壤中，这些微生物的数量可能超过AOA和AOB（Hu & He，2017年；Osburn & Barrett，2020年）；然而，我们还不了解NH4+可用性的变化或其他生态因素如何影响它们的丰度及其对硝化作用的贡献。此前，我们记录了一系列形成自然NH4+可用性梯度的森林地点中AOA和AOB的组成和丰度（即净氮矿化），这些地点的土壤pH值也系统性地发生变化（Wen等人，2024年）。利用相同的土壤DNA，我们使用定量聚合酶链反应（qPCR）来确定comammox Nitrospira的丰度，并将其与AOA和AOB的丰度进行比较。我们的目标是确定底物可用性（即NH4+）和土壤pH值这两个已知影响AOA和AOB群落的因素如何影响comammox Nitrospira的出现，相对于它们的NH4+氧化对应物。我们认为它们之间的生理差异会不同地改变它们的丰度，从而改变土壤中NH4+氧化微生物的组成及其对硝化作用的贡献。为了实现这一目标，我们使用了之前确定AOA和AOB丰度和组成的相同地点的土壤DNA（Wen等人，2024年），从而可以直接评估这三种NH4+氧化微生物的丰度如何沿着北温带森林中的NH4+可用性和pH值生态梯度变化。

方法

我们研究了12个森林地点，这些地点形成了自然的净氮矿化（即NH4+可用性）和硝化作用梯度（Wen等人，2024年；Zak等人，1989年）。这些地点的土壤最近形成（约10,000年），位于均匀的沙质冰川沉积物上（90%为沙子），被归类为entic和typic Haplorthods类型；所有地点都经历相同的气候条件（Argiroff等人，2022年；Zak等人，1989年）。我们的研究地点相距不超过50公里，林龄（约100年）和土壤质地（约85%为沙子）相似。为了减少凋落物生化性质的差异，我们选择了靠近Quercus rubra（北方红橡树）个体的地块进行研究（Argiroff等人，2022年；Wen等人，2024年）。2019年5月，在每个地块内采集了6个直径2.5厘米、深度10厘米的土壤芯样，包括Oe和A层，排除了Oi层。收集到的样本被混合后带到密歇根大学进行筛分和手工均质化。我们测定了实验室中的净氮矿化速率、硝化速率和土壤pH值；每个地块的一个子样本被储存在-80°C下以备后续DNA提取。净氮矿化是填充土壤中NH4+池的微生物过程，它为NH4+氧化为NO3?以及植物吸收提供了NH4+。我们认为净氮矿化是一个可靠的NH4+可用性估计指标，因为可提取的NH4+池周转迅速，浓度普遍较低（Zak & Pregitzer，1990年），并且可以被NH4+氧化微生物和植物根系利用。每个地块的混合土壤样本在实验室中进行了28天的好氧培养（Vitousek等人，1982年；Zak等人，1989年）。培养前后使用AQ2 Discrete Analyzer（SEAL Analytical）测量了无机氮（NH4+加NO3?）。净氮矿化计算为最终NO3?加NH4+浓度之间的差值。尽管这些测定值是每个地点的潜在速率，但实验室中的矿化潜力与我们研究地点的实地矿化速率高度相关（Zak等人，1989年）。基于此，我们将这些潜力作为实地NH4+可用性的可靠表示。净硝化速率计算为培养期间可提取NO3?的增加量。土壤pH值使用30克风干土壤和30毫升去离子水的1:1浆液进行测量。为了确定comammox Nitrospira的丰度，我们使用了之前提取的土壤DNA，并用它来确定AOA和AOB的丰度和组成（Wen等人，2024年）。这里，我们使用了针对Nitrospira中amoA A和B分支的引物162F/359R（Fowler等人，2018年），产生了198 bp的扩增子。由于amoA在AOA和comammox Nitrospira中各存在一个拷贝（Fowler等人，2018年），我们用它作为种群大小的代理指标（即丰度）。AOB的基因组可能包含2-3个amoA拷贝，因此在估计其丰度时应予以考虑（Fowler等人，2018年；Palomo等人，2022年）。在qPCR之前，我们扩增、克隆并测序了这些引物纯化的质粒以创建qPCR的标准品。为了计算基因拷贝数，我们使用了这种测序纯化的质粒进行稀释系列实验；拷贝数以土壤干质量为基础报告，并按森林地点和每个地点内的地块进行了平均。所有qPCR扩增都在Agilent Mx3000热循环仪上进行。每个qPCR反应包括10 μL Brilliant III SYBR Green Mastermix（Agilent）、0.3 μL ROX、0.25 μL（10 μM）的每种引物、7.3 μL水和1 μL模板DNA。热循环条件如下：初始加热激活步骤为95°C 3分钟，随后是40个循环，每个循环95°C 15秒和61°C 20秒（修改自Wang等人，2019年）。所有样本和标准品都在三个重复板上运行，最终数据取平均值。模板对照在每个板上重复三次。平均效率为92.2%，R2为0.987。包括标准品和样本在内的熔解曲线分析用于评估扩增特异性。我们测试了两个环境因素对comammox基因拷贝数的影响：净氮矿化和土壤pH值（图1）。我们还使用了Wen等人（2024年）中的AOA和AOB拷贝数，并将其与上述方法生成的comammox基因拷贝数进行了比较。由于地点间的分布高度偏斜，我们使用psych包（Revelle，2024年）计算了每个森林地点的几何平均值。对于comammox基因拷贝的回归分析，只使用了具有正几何平均值的样本。回归分析使用了土壤pH值和氮矿化，以探讨它们对comammox基因拷贝数的影响，但只有pH值与comammox Nitrospira有显著趋势。pH值和comammox Nitrospira之间的最佳拟合关系是一个二次方程，我们用它来计算comammox基因拷贝数随土壤pH值的最大值。可视化和回归分析使用ggplot2（Wickham，2016）进行，图表使用R版本4.2.2（R Core Team，2022）创建。

图1：展示了代表我们环境和生态梯度的12个北方硬木林地的（A）平均pH值、（B）净氮（N）矿化和（C）硝化作用的排名顺序（从低到高）。站点平均值和标准误差是从每个地点的6个样点获得的值计算得出的。净氮矿化和硝化作用是通过实验室培养确定的。该图改编自Wen等人（2024年），用于展示构成本研究基础的铵可用性、硝化作用和pH值的梯度。

结果与讨论

在陆地生态系统中，一群多样的化能自养细菌和古菌介导NH4+的氧化。我们认为，底物摄取效率和土壤pH值耐受性的生理差异会作为环境过滤器，从而在不同NH4+可用性（即净氮矿化）和土壤pH值梯度上不同地改变这些微生物的丰度。在我们之前研究的森林地点（Wen等人，2024年），NH4+的可用性变化了4倍，形成了强烈的NH4+氧化微生物底物可用性梯度（图1A；Wen等人，2024年）。这种模式对净硝化作用有显著影响：当NH4+可用性低时，该过程几乎不消耗NH4+；而当NH4+可用性高时，它消耗了约95%的NH4+；这可以通过比较净氮矿化和硝化作用在图1中观察到。我们研究地点中NH4+可用性的显著增加伴随着AOA和AOB的丰度和群落组成的变化（Wen等人，2024年；图2）。我们在这里呈现的结果表明，相同的因素导致了comammox Nitrospira的差异丰度；在大多数地点它们无法检测到，只有在NH4+可用性高时才高度丰富（10^9拷贝/克土壤）（图1和图2）。

图2：展示了（A）氨氧化古菌（AOA）、（B）氨氧化细菌（AOB）和（C）comammox Nitrospira的丰度排名顺序（从低到高）。AOA和AOB的丰度值取自Wen等人（2024年）。注意y轴上的刻度对于AOA、AOB和comammox Nitrospira有不同的数量级。定量聚合酶链反应（PCR）用于获取每组微生物中氨单氧化酶（amoA）基因的拷贝数。我们使用amoA作为丰度指标，因为它在AOA和comammox Nitrospira中仅以单个拷贝的形式存在；而AOB的基因组可能包含2-3个amoA。在比较这三种生物的基因拷贝数时需要考虑到这一点。在我们的土壤NH4+可用性梯度上，AOA、AOB和comammox Nitrospira的丰度存在显著差异（见图2），这可能是由于它们在利用NH4+方面的生理差异，以及对其他氮源（例如尿素）的偏好不同（Qin等人，2024年）。例如，这些生物的丰度在不同研究地点之间相差几个数量级：AOA的丰度约为10^6拷贝/克土壤，AOB约为10^7拷贝/克土壤，而comammox Nitrospira约为10^9拷贝/克土壤（见图2）。需要注意的是，AOB的基因组中有2-3个amoA拷贝，而其他两种生物只有1个，因此在直接比较这些生物时需要考虑到这一点。重要的是，土壤NH4+的可用性强烈影响了这些生物在这片森林景观中的空间分布（参见图1和图2）。AOB沿着NH4+可用性梯度分布相对均匀，而AOA的丰度较低，只有在NH4+供应充足时才会达到较高水平。这与comammox Nitrospira的丰度形成鲜明对比，后者在大多数地点都不存在，并且仅在NH4+最丰富的地点数量上超过AOA和AOB（见图2）。此外，comammox Nitrospira和AOA的丰度随土壤NH4+可用性的变化而变化；当NH4+供应充足时，两者数量都较多。然而，无论土壤NH4+的可用性如何，AOB的丰度保持相对稳定，并且在NH4+可用性和pH值都较低的情况下，AOB似乎是主导硝化作用的生物（见图2）。这些观察结果表明，AOA、AOB和comammox Nitrospira的丰度差异是导致我们在这片森林景观中记录到的净硝化作用增加的原因（见图1和图2）。我们之前的研究表明，AOA和AOB的组成和丰度受土壤pH值的影响大于NH4+的供应（Wen等人，2024年）。我们很想知道这一生态因素如何影响comammox Nitrospira的丰度。与AOA和AOB类似，土壤pH值对comammox Nitrospira也有显著影响，其丰度在pH 4.0到6.5之间呈现单峰分布（见图3）。二次方程能够最好地拟合comammox Nitrospira的丰度，尽管它只能解释这一关系中相对较小的方差（R^2 = 0.263；p = 0.016）。为了确定comammox Nitrospira达到最大丰度的土壤pH值，我们将最佳拟合二次方程的一阶导数设为零（即斜率为0）。结果发现，comammox Nitrospira的数量在pH 5.3时达到最大值，之后在该值两侧逐渐减少。虽然我们的研究是在野外进行的，但需要通过实验室培养进一步验证我们的观察结果，并确定这些生物的最佳生长pH值。

图3：comammox Nitrospira基因拷贝数与土壤pH值之间的关系。根据最佳拟合模型，comammox Nitrospira的基因拷贝数在pH约5.3时达到最大值。净氮矿化作用与comammox Nitrospira的基因拷贝数没有显著相关性。我们没有发现NH4+的供应量与comammox Nitrospira的丰度之间存在关系；然而，这种统计上的不显著性有些误导。这是因为comammox Nitrospira在NH4+供应梯度上的分布不均匀（见图2C）。例如，虽然NH4+的可用性在各个地点之间相对均匀地增加（见图1B），但comammox Nitrospira的丰度并没有（见图2C）。看来comammox Nitrospira对土壤NH4+的可用性有阈值响应，只有在最高水平的NH4+可用性（109拷贝/克土壤）时，其数量才会超过AOA（106拷贝/克土壤）和AOB（107拷贝/克土壤）。虽然我们无法确定这一现象的生理和生态原因，但这可能是由于这些生物在获取细胞能量所需的底物方面存在竞争差异。有趣的是，由于comammox Nitrospira相对于AOA和AOB具有更强的生理能力，有人推测在寡营养条件下（即NH4+可用性低时），comammox Nitrospira会是更强的竞争者（Li等人，2023年；Palomo等人，2022年；Qin等人，2024年）。然而，我们的野外观察结果与这些预期相反，因为comammox Nitrospira仅在NH4+可用性高时才大量存在（参见图1和图2）。这一观察表明，我们才刚刚开始理解comammox Nitrospira的生理能力和耐受性如何影响其与AOA和AOB以及土壤环境的生态相互作用。这将有助于理解微生物群落的动态如何影响它们所介导的生物地球化学过程。总之，在NH4+最丰富的森林土壤中，comammox Nitrospira可以主导NH4+氧化微生物群落，其数量远远超过AOA和AOB。在我们研究的温带森林中（这些森林广泛分布于北美东部），当NH4+充足且土壤pH值在5.0-5.5之间时，硝化作用主要由comammox Nitrospira介导。我们的结果进一步表明，硝化作用这一生物地球化学过程从根本上是由土壤中NH4+氧化微生物的组成、多样性和功能决定的（Wen等人，2024年）。与大型生物群落一样，生长限制资源的供应、生态相互作用和环境耐受性似乎也以类似的方式塑造了NH4+氧化微生物群落，从而将群落组成与土壤微生物群落的生物地球化学功能联系起来。

作者贡献：
Donald R. Zak构思并设计了这项研究。Rima A. Upchurch优化并进行了comammox基因拷贝数的扩增，进行了生物信息学和统计分析，并可视化了数据。Donald R. Zak起草了手稿，Rima A. Upchurch对早期版本进行了评论并批准了最终版本。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
代码和数据（Zak, 2025）可从Zenodo获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.10553032