证据表明，蜗牛 Bullinus truncatus 的微生物群更多地受到宿主遗传背景的影响，而不是环境因素。该蜗牛是血吸虫属（Schistosoma）物种的中间宿主

《Molecular Ecology》：Evidences That Host Genetic Background More Than the Environment Shapes the Microbiota of the Snail Bulinus truncatus, an Intermediate Host of Schistosoma Species

　　摘要

微生物群作为宿主生理的基本调节因子，塑造了生态相互作用和进化轨迹。然而，野生种群中微生物群多样性和结构的决定因素——尤其是宿主遗传和环境背景的各自作用——仍知之甚少。在这项研究中，我们使用多因素方法调查了淡水蜗牛Bulinus truncatus（人类和动物血吸虫寄生虫的关键中间宿主）中的这些影响。我们开发了31个新的微卫星标记来解析塞内加尔九个地点的群体遗传结构。然后，我们采用宏条形码方法来分析单个蜗牛的细菌微生物群，并通过环境DNA来表征每个地点的环境细菌群落。我们还测量了贝壳大小并进行了吸虫感染状态的分子诊断，以评估其他潜在的贡献因素。通过距离矩阵的多变量回归（MRM），我们量化了蜗牛群体遗传、特定地点的环境细菌群落、空间模式和感染状态如何影响微生物群组成。我们的分析表明，蜗牛的地理分布和群体遗传结构决定了Bulinus truncatus的微生物群组成，而环境细菌群落的作用较弱但仍然显著。相比之下，贝壳大小和吸虫感染状态对微生物群结构没有显著影响。值得注意的是，仍有相当一部分变异无法解释，这表明可能存在其他生态或内在因素的影响。这些结果加深了对自然种群中微生物群决定因素的理解，并突显了宿主遗传、环境和微生物群落之间的复杂相互作用。

1 引言

“微生物群”包括与宿主相关的所有微生物，现在被广泛认为是在生物体生物学的各种方面中起关键作用的因素，涵盖了发育、生理、繁殖、行为和免疫表型（Liberti和Engel 2020；Daisley等人2020；Yuan等人2021；Davidson等人2024）。因此，微生物群部分影响着宿主及其之间生物相互作用的生态和进化（Sharon等人2010；Henry等人2021；Lange等人2023）。尽管最近努力了解影响宿主微生物群的因素，但在自然宿主种群中识别和理解微生物群组成和结构的生态和进化决定因素仍然是一个重大的科学挑战。自然环境中宿主的微生物群组成和结构特别复杂，取决于多种环境和宿主遗传因素（Benson等人2010）。一方面，微生物群部分由一些必需或兼性的共生体组成，这些共生体通常通过母系遗传从一个宿主世代传递到另一个世代（Funkhouser和Bordenstein 2013）。它们的进化历史与其共同进化的宿主一致，在宏观进化和微观进化时间尺度上导致了系统共生（Kohl 2020；Dapa等人2023）。这些微生物构成了“核心微生物群”，无论环境条件如何，这些物种始终与宿主相关（Risely 2020）。因此，宿主微生物群的组成和结构预计部分受到与宿主生态和进化相关的随机（例如，扩散、漂变）和确定性（例如，选择）过程的共同影响（Benson等人2010；Furman等人2020；Hayashi等人2024）。另一方面，构成宿主微生物群的大多数微生物是暂时的，在宿主整个生命周期中从环境中获得的。这一点在一些鳞翅目昆虫物种中得到了很好的说明，这些昆虫缺乏常驻的微生物群，通常从宿主植物或环境微生物群中获得细菌群落（Montagna等人2016；Phalnikar等人2018；Minard等人2019；Liu等人2020）。此外，包括环境中存在的自由生活微生物群落（Díaz-Sánchez等人2018）和非生物因素（例如，温度、pH值）在内的几个环境生物因素可以影响宿主微生物群的组成，这反过来又可以改变宿主的生物学特性（Bernardo-Cravo等人2020）。换句话说，宿主的生态（例如，行为、饮食）也影响其微生物群（Archie和Tung 2015；Kennedy等人2020）。因此，预计来自同一遗传池并在不同环境中建立的生物体会携带不同的微生物群落（Berg等人2016）。因此，要理解影响宿主微生物群的因素，就需要考虑宿主建立的生态背景和宿主种群的遗传背景。然而，令人惊讶的是，很少有研究专门调查生物体的遗传多样性和其环境在塑造自然宿主微生物群方面的相对贡献，并得出不同的结论。例如，Suzuki及其合作者发现，野生家鼠（Mus musculus domesticus）种群的肠道微生物群结构可以通过从广泛的外显子基因组数据集计算出的宿主种群之间的遗传距离来很好地预测，而不是通过不同的环境条件，包括温度和饮食（Suzuki等人2019）。相反，加州田鼠（Microtus californicus）种群在两个最近分化的谱系之间的接触带上的肠道微生物群结构最好用宿主的地理分布来解释，而不是谱系分化，这表明环境对田鼠肠道微生物群结构有很强的影响（Lin等人2020）。同样，Rothschild等人（2018）发现，1046名健康个体的遗传背景在决定个体肠道微生物群方面作用较小，而住房、饮食和身体测量等环境因素可以解释一些个体间微生物群的变异性（Rothschild等人2018）。最后，在Nematostella vectensis海葵模型中，Fraune等人表明环境和遗传都在塑造微生物群方面起作用，且这些元素之间复杂地相互联系（Fraune等人2016）。鉴于这些研究，微生物群的遗传或环境决定因素的相对重要性可能取决于物种和/或具体情境。Bulinus truncatus是几种吸虫物种的主要中间宿主，包括非洲人类尿路血吸虫病的病原体Schistosoma haematobium（Toledo和Fried 2014）。它也是Schistosoma bovis的主要中间宿主，这是一种在非洲广泛分布的牲畜寄生虫，导致牛血吸虫病，具有重要的兽医和经济影响（Demlew和Tessma 2020）。这种蜗牛物种能耐受广泛的非生物条件，具有较高的被动扩散能力，并能够自我受精（Jarne等人1993）。因此，这种物种在非洲广泛分布，有时数量很多，并且能够在包括河流、湖泊、（临时）池塘和水库在内的多种淡水生态系统中建立（Tumwebaze等人2022）。由于其能够在不同环境中繁殖的能力，这种物种成为探索蜗牛遗传和环境因素对其微生物群多样性和结构相对影响的宝贵模型。旨在表征与自然蜗牛种群相关微生物群落的生态研究最近蓬勃发展，尤其是在与疾病传播相关的淡水蜗牛中（Li等人2023）。基于不依赖培养的分子方法，Van Horn等人展示了从野外收集的三种淡水扁卷螺中的高度多样化的肠道微生物群落。其中两种蜗牛物种是几种寄生虫的中间宿主，包括导致人类血吸虫病的复殖吸虫属（Van Horn等人2012）。同样，Huot等人证明，Planorbidae家族中的七个物种和菌株表现出与宿主菌株密切相关的特定核心细菌组成。这种细菌组成与宿主系统发育高度一致，从而揭示了系统共生的模式（Huot等人2020）。更近期，McCann等人表明，Galba truncatula的微生物群在两个地理和生态上不同的地点建立的自然种群之间有所不同，这突显了与这种蜗牛物种相关的细菌群落组成的自然多样性（McCann等人2024）。然而，这种自然种群中的微生物群多样性是由蜗牛的遗传背景还是环境因素驱动的，仍有待完全阐明。如果淡水蜗牛的微生物群在与相关病原体的传播中起重要作用，正如Portet等人（2021；Clec'h等人2022）所提出的那样，那么研究自然多样性、这些群落的结构以及田间塑造这些群落的因素就至关重要。在这里，我们利用高通量测序技术来识别和评估生态和宿主遗传因素在塑造淡水蜗牛B. truncatus自然种群相关微生物群方面的相对贡献。我们表征了塞内加尔北部九个淡水水生地点B. truncatus全身微生物群的多样性和结构，该地区是S. haematobium和S. bovis的流行地区（Léger等人2020）。基于31个新开发的微卫星标记，我们使用基因分型-测序方法表征了每个蜗虫宿主的遗传背景。我们还测量了蜗牛的贝壳大小，并使用16S吸虫宏条形码检测方法检查了每个蜗虫体内是否存在吸虫（Douchet等人2022）。我们还表征了与每个研究的淡水地点相关的水生细菌群落，并将其作为B. truncatus种群建立生态背景的代理。我们使用这些互补的数据集来识别塑造自然种群中B. truncatus相关微生物群的主要因素。

2 材料与方法

2.1 野外样本采集

野外采样于2022年2月在塞内加尔河流域的旱季进行（图1）。我们关注了九个S. haematobium传播的自然地点，这些地点之前已报告学龄儿童中尿路血吸虫病的患病率（Senghor等人2022）。这些地点在生态背景和B. truncatus的数量上有所不同（Douchet等人2024）。六个传播地点位于Ndiawara、Ouali Diala、Dioundou、Fonde Ass和Khodit村庄附近，这些地点都位于塞内加尔河中游支流“le Doue”沿岸。沿“le Doue”河的地点在水生植物覆盖、基质大小和人工基质（例如，塑料）的数量上有所不同，尽管我们没有量化这些变量。另一个传播地点位于Guia村庄附近，也位于中游谷地，由一条从“le Doue”河引水的灌溉渠组成。这条渠中的水流缓慢，植被覆盖（底部和表面）丰富。两个传播地点位于Mbane和Saneinte村庄附近，位于Guiers湖东岸。Mbane地点的植被覆盖适中，深度迅速增加，而Saneinte地点的水深较浅，植被稀少，有许多（半）暴露的人造基质（例如，塑料容器、轮胎）。一个传播地点位于Lampsar村庄附近，位于下游谷地，是塞内加尔河三角洲的一个入口（表S1）。这个地点由一个被密集水生植被环绕的缓坡海滩组成。所有这九个地点都经常有人类活动（例如，洗衣服、洗碗和洗澡），并且被认为是S. haematobium的传播地点。这些地点的图片见图S1。

2.1.1 野外环境样本采集

在每个地点，我们首先过滤了从水面到岸边水-沉积物界面的水（即最大深度20厘米）。我们使用了0.45微米网眼的过滤胶囊（Waterra USA Inc.），并通过电动水泵进行过滤，如Douchet等人（2022）之前描述的那样。过滤一直进行到过滤胶囊堵塞为止，并收集最终的过滤体积。我们认为，直到胶囊堵塞的过滤可以标准化所有样本中收集到的颗粒数量，并最大化DNA检测。过滤完成后，将过滤胶囊中的水分倒出，加入50毫升Longmire溶液（100 mM Tris、100 mM EDTA、10 mM NaCl、0.5% SDS、0.2% sodium azide（Sahu等人2025），剧烈摇晃，然后在室温下保存在黑暗中，直到用于环境DNA（eDNA）提取。在Khodit以外的每个地点，通过使用与eDNA采样相同的0.45微米过滤胶囊过滤1.5升商业泉水，获得了一个技术性的野外阴性对照，按照相同的保存协议进行处理（即，在过滤胶囊中的水分耗尽后加入50毫升Longmire溶液）。

2.1.2 野外蜗牛样本的采集和保存

在eDNA采样之后，我们手动收集了所有遇到的水生蜗牛，使用滤网在目标水体沿岸10到30米长的地带清理水生植被，持续约30分钟到1小时。在完成分类鉴定（根据Mandahl-Barth 1962年的鉴定关键）后，每个采样点最多提取了17只不发光的B. truncatus个体。这些个体在70°C下加热1分钟后，使用消毒过的镊子从壳中取出，并分别保存在含有70%乙醇的无菌1.5 mL试管中。每次取样后，镊子都会用DNA AWAY溶液进行消毒。从壳中提取蜗牛身体的过程是为了避免微生物（包括细菌）对DNA的污染。每个壳体长度和宽度都使用卡尺测量到小数点后一位（详见表S2和图S2）。总共准备了124只蜗牛。

2.2 从eDNA样本和B. truncatus蜗牛中提取DNA

所有PCR前的步骤，包括DNA提取和PCR混合物的制备，都在无菌条件下进行。每使用一次后，都会用10%的漂白剂、70%的乙醇、DNA AWAY溶液进行消毒，并暴露在紫外光下20分钟。水过滤物中的总eDNA提取方法参照了Douchet等人的研究（Douchet et al. 2022）。简而言之，每个过滤胶囊中的Longmire缓冲液被均分到三个50 mL的试管中。对于野外阴性对照（即泉水过滤液），每个过滤胶囊中的Longmire溶液被收集到一个50 mL的试管中。然后将试管中的沉淀物离心20分钟，转速为16,000 × g，并丢弃上清液。随后从每个试管的沉淀物中收集了适量的样本（少于1克，如协议中所建议）。因此，每个胶囊中的总eDNA被重复提取三次。这种策略使我们能够捕获与该物种相关的各种微生境中的样本，同时确保分子工作流程的重复性。离心后，在过滤阴性对照中未观察到沉淀物。对于这些样本，在去除上清液后，保留了500 μL的Longmire溶液并重新悬浮，然后与其他样本一起处理。这样共处理了35个样本（即每个eDNA样本重复提取三次，每个采样点一个野外阴性对照，Khodit除外，详见图S3）。这35个样本的总eDNA使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（Qiagen）根据制造商的指南进行提取，使用MagNA Lyser以7000 × g的速度进行物理裂解30秒。从124只蜗牛壳中提取的总基因组DNA使用DNeasy 96 Blood and Tissue试剂盒（Qiagen）根据制造商的指南进行提取。在提取过程中还添加了两个对照样本。蜗牛被鉴定为B. truncatus是通过基于特定引物扩增的分子诊断工具确定的，该工具最初是用于检测水样中的B. truncatus eDNA（Blin et al. 2023），最近也被应用于蜗牛样本（Douchet et al. 2024）。

2.3 B. truncatus蜗牛的感染状态和基因分型

2.3.1 B. truncatus蜗牛的感染状态

通过Trem_16S_F1（GACGGAAAGACCCCRAGA）和Trem-16S_R2（CRCCGGTYTTAACTCARYTCAT）这两个16S胆虫代谢条形码（Douchet et al. 2022）来诊断124只蜗牛体内是否存在发育中的胆虫。DNA提取物被稀释至1/100，以减少PCR抑制因子，从而限制PCR假阴性的发生。PCR反应按照标准条件进行（Douchet et al. 2022）。在这一步筛选之后，使用阳性样本的DNA模板进行了新的PCR，并将其发送到Bio-Environment平台（法国Perpignan Via Domitia大学）进行代谢条形码测序，以鉴定蜗牛宿主体内可能发育的胆虫及可能的共感染情况。在该平台上，使用Illumina Nextera索引试剂盒和Q5高保真度DNA聚合酶（New England Biolabs）构建了个体文库。索引后的PCR产物使用SequalPrep平板（ThermoFisher）进行标准化，并在MiSeq仪器上使用v2化学试剂进行双端测序（2 × 250 bp）。获得的序列按照Douchet et al.（2022）的方法进行处理，并在NCBI数据库中进行分子鉴定。当OTUs的覆盖度≥97%且与参考序列的同源性≥99%时，将其分配到特定物种；当覆盖度≥97%且同源性≥96%时，将其分配到属级别。未达到这些阈值的OTUs则根据174个参考序列的成对遗传距离使用聚类方法分配到更高的分类等级。

2.3.2 微卫星开发与基于序列的微卫星基因分型

使用B. truncatus的基因组（GenBank访问号GCA_021962125.1，Young et al. 2022）进行微卫星发现，选出了96对适用于多重PCR的引物对（详见附录S1）。多重PCR扩增和测序文库的构建方法详见附录S2。

2.3.3 遗传分析

初步分析后，从最初开发的96个微卫星标记中选择了31个，以避免使用质量不佳或具有缺失遗传数据的标记。使用SPAGeDi软件（v. 1.5d；Hardy and Vekemans 2002）计算了每个采样点的遗传多样性描述性统计指标，包括平均等位基因数、平均等位基因丰富度（基于采样点获得的基因型最小数量N = 5计算）、平均预期（He）和观察到的（Ho）杂合度以及平均Fis。接下来使用SPAGeDi软件（v. 1.5d；Hardy and Vekemans 2002）计算了每个采样点之间的Nei遗传标准距离Ds（Nei 1978）和Fst值（表S3）。根据获得的Ds值，我们使用‘adegenet’ R包（Jombart 2008）中的10,000次置换方法进行了Mantel测试，以检验采样点之间的潜在隔离模式。还使用了采样点之间的成对（Fst/(1—Fst)值进行了类似的Mantel测试分析。

2.4 细菌群落的测序和代谢条形码分析

根据Illumina的两步PCR协议，准备了总共198个细菌16S代谢条形码文库，包括来自124只蜗牛的DNA提取物、70个（每个采样点的三次提取物各重复一次的35 × 2个eDNA样本）和16个技术性野外阴性对照（每个对照重复一次），以及4个阴性PCR对照（milliρ水）（表S4）。我们针对16S rDNA基因的V3-V4环区，使用了341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）引物（Klindworth et al. 2013），并结合了通用的Illumina接头。第一次PCR使用Q5 High-Fidelity 2× Master Mix（New England BioLabs）进行，最终体积为25 μL，其中包含2 μL的模板DNA。PCR程序包括在98°C下的30秒变性步骤，随后是32个循环，每个循环包括6秒的变性步骤、30秒的退火步骤和8秒的延伸步骤，最后是60秒的最终延伸步骤。我们使用5 μL的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检查扩增子的质量和完整性。剩余的20 μL样本被发送到Bio-Environment平台（法国Perpignan Via Domitia大学）。文库使用Illumina Nextera索引试剂盒和Q5高保真度DNA聚合酶（New England BioLabs）进行构建。索引后的PCR产物使用SequalPrep平板（ThermoFisher）进行标准化，并在MiSeq仪器上使用v2化学试剂进行双端测序（2 × 250 bp）。从测序获得的原始代谢条形码数据使用R（版本2023.0.0 + 386）和基于‘dada2’包（v. 1.28.0）的流程在IFB（法国生物信息学研究所）云平台上进行处理。简而言之，该流程包括从获得的测序读数中去除引物（max.mismatch = 1）、修剪和过滤读数质量（minLen = 150, maxN = 0, maxEE = c (3, 3), truncQ = 2）、去噪、合并成对读数（maxMismatch = 0）、构建Amplicon Sequence Variant（ASV）表以及去除过程中产生的潜在嵌合序列（method = ‘consensus’）。使用Ribosomal Database Project（RDP）分类器（Wang et al. 2007）和Silva_train_set及silva_species_assignment 138.1数据集（Quast et al. 2012）对过滤和清洗后的ASV进行分类学分配。去除了真核生物、线粒体和叶绿体序列，以及不属于‘Bacteria’界的ASV。最后，将获得的ASV序列表与分类数据库和样本元数据矩阵合并，用于后续分析，使用了‘phyloseq’ R包（v. 1.22.3）（McMurdie and Holmes 2013）。从整个数据集中过滤掉了丰度低于0.005%的ASV（Bokulich et al. 2013），以考虑可能的测序错误。整个phyloseq对象使用‘transform_sample_count’函数转换为相对丰度。然后使用‘phyloseq’ R包的‘prune_taxa’函数去除了丰度较低的Taxa。为了评估潜在的污染影响，通过设置过滤器来去除每个样本中丰度低于0.1%的ASV（Karstens et al. 2019）。为了进一步评估潜在的污染，我们将PCR阴性对照中检测到的ASV与生物样本中的ASV进行了比较。构建了两个Phyloseq对象：一个用于四个PCR阴性对照，另一个用于B. truncatus样本。所有在阴性对照中存在的ASV（其分类学信息详见表S5）被筛查是否也存在于B. truncatus样本中。对于每个共享的ASV，我们比较了其在生物样本和对照样本中的读数丰度，以评估其存在是否与低水平背景污染一致（见图S4A）。同样的比较方法也应用于环境样本（见图S4B）。为了评估样本间的测序深度是否令人满意，使用‘ggrare’自定义函数生成了稀释曲线。根据ASV计数最低的样本（即5000，见表S6），通过‘rarefy_even_depth’函数（phyloseq package）进行随机子采样，对每个样本的丰度进行了归一化。我们选择对数据进行稀释，以便更准确地了解B. truncatus群体中最丰富的微生物群落。这种方法旨在最小化低丰度Taxa可能引入的噪声。因此，我们的分析突出了各群体间共享的核心微生物群，同时可能低估了较少见的Taxa的丰度。有关清洁步骤期间每个样本的读数计数，请参见表S6。

2.5 统计分析

2.5.1 环境和与蜗牛相关的细菌群落的多样性以及B. truncatus核心微生物组的特征

根据‘microbiome’ R包（v. 1.22.0）（Lahti and Shetty 2012）中的方法，评估了与环境基质和B. truncatus蜗牛相关的细菌群落的多样性，使用的是ASV的绝对数量和Shannon及Simpson多样性指数。使用‘stats’ R包（v. 4.3.0）（R Core Team 2023）计算了这些 alpha-多样性指数在样本类型（即蜗牛与eDNA样本）和采样点之间的Kruskal-Wallis非参数检验。随后使用‘dunnTest’（FSA R包；v. 0.9.5）进行了成对多重比较（即Dunn检验，Dunn 1964），并根据Benjamini-Hochberg方法（Benjamini and Hochberg 1995）调整了得到的p值。为了检查蜗牛的大小是否会影响其微生物群的alpha多样性，我们使用lmer函数（lme4 R package；Bates et al. 2015）运行了线性混合效应模型，以ASV的数量作为因变量，蜗牛壳的长度（或宽度）作为解释变量，并将采样点作为随机因子。为了可视化与B. truncatus相关的十大最丰富门类，我们在门级别汇总了分类等级，并根据总体相对读数丰度选择了10个最丰富的Taxa。使用‘phyloseq’包（McMurdie and Holmes 2013）中的‘transform_sample_counts’函数对相对丰度进行了归一化。使用‘microbiome’包（Lahti and Shetty 2012）中的‘plot_composition’函数生成了代表采样点平均组成的条形图。手动整理了门类的身份，并将其映射到相应的ASV上进行图形显示。对于自然环境中B. truncatus的核心微生物组（即所有个体中共享的最稳定细菌群落部分），我们遵循了既定的指南（Neu et al. 2021）。核心微生物群在家族水平上使用R包‘microbiome’中的‘core_members’函数进行了评估（Lahti和Shetty 2012），并将检测参数设置为0，流行率参数设置为90%。

2.5.2 确定 structuring 环境和蜗牛细菌群落的因素
为了研究环境样本和B. truncatus蜗牛中细菌群落的潜在结构，我们使用了‘ecodist’包（版本2.1.3）中的‘pco’函数进行了主坐标分析（PCoA）（Goslee和Urban 2007）。使用‘phyloseq’ R包中的‘distance’函数进行了成对Jaccard和Bray-Curtis指数计算。基于这些贝塔多样性指数，我们进行了置换多元方差分析（PERMANOVA），以测试：1- 水生细菌群落（即来自eDNA样本的）与蜗牛相关细菌群落（即微生物群）之间的差异。我们考虑了采样地点作为额外的解释变量，以及采样地点和样本性质（即环境与蜗牛）之间的可能交互作用。2- 吸虫感染状态（所有吸虫物种合并）对B. truncatus微生物群贝塔多样性的影响。在这里，我们也考虑了采样地点作为额外的解释变量，以及采样地点和感染状态之间的交互项。PERMANOVA是使用‘vegan’ R包中的‘adonis2’函数进行的（Oksanen等人2022），并将置换次数设置为10,000。我们研究了蜗牛壳大小是否影响该站点蜗牛微生物群的贝塔多样性。为此，我们进行了一系列部分Mantel测试，以评估壳大小绝对差异矩阵与微生物群贝塔多样性（Jaccard和Bray-Curtis指数）之间的相关性，同时独立考虑了每个站点中个体蜗牛之间的遗传距离。这些部分Mantel测试是使用‘vegan’ R包中的‘mantel的部分’函数进行的（Oksanen等人2022）。p值是根据Benjamini和Hochberg方法调整的（Benjamini和Hochberg 1995）（表S7）。为了评估环境细菌群落和蜗牛的遗传背景对整个蜗牛微生物群的相对影响，我们使用了四个成对矩阵，包括每个采样站点之间的地理距离矩阵、每个采样站点上环境细菌群落之间计算的Jaccard指数、与B. truncatus个体相关的细菌群落之间计算的Jaccard指数，以及蜗牛宿主之间的Nei遗传距离。为了确保四个矩阵的维度可比，我们使用‘phyloseq’ R包中的‘subset_samples’函数丢弃了15个样本。这一步导致了两个102*102维度的矩阵。基于这些矩阵，我们对地理距离和每个采样站点上计算的环境细菌群落之间的Jaccard指数进行了伪重复，以将它们转换为相同的维度。我们对距离矩阵进行了多重回归（MRM），将来自B. truncatus个体之间细菌群落的Jaccard距离矩阵作为因变量，并使用了三个矩阵作为解释变量：每个站点上细菌群落之间的Jaccard距离（在个体水平上伪重复）、个体之间的Nei遗传距离以及站点之间的欧几里得地理距离（也在个体水平上伪重复）。这种MRM分析是使用‘ecodist’ R包中的‘MRM’函数进行的，这种多重回归测试的显著性是基于9999次置换来评估的。这种方法还通过使用‘vegan’ R包中的‘mantel’函数对这些四个矩阵进行了一系列Mantel测试，并使用自定义函数将矩阵相互绘制出来。

3 结果
3.1 不同站点之间B. truncatus的丰度、大小和感染状态
总共在九个采样站点中收集了124只B. truncatus蜗牛（平均=14只，最小=5只，最大=17只，表S1）。每个站点的平均蜗牛壳大小从Dioundou的3.30毫米到Saneinte的8.01毫米不等（表S2）。总体吸虫感染率从0%（Dioundou、Mbane、Saneinte）到29.4%（Fonde Ass）不等（表S1）。鉴定出了九种吸虫。除了S. haematobium和Schistosoma bovis外，我们还发现了Orientocreadium batrachoides、两种未鉴定的Haematolochus属物种和Petasiger属物种，以及两种Paramphistomoidea属和两种Diplostomoidea属物种。在来自所有站点的18只受感染的蜗牛中，有7只是共感染的（Ndiawara有1只；Ouali Diala有3只；Guia有1只；Khodit有1只；Lampsar有1只）。

3.2 不同采样站点之间B. truncatus的遗传多样性和结构
共有110只蜗牛在31个新开发的微卫星标记处得到了完整的基因型鉴定（表1）。其余样本的DNA浓度或质量不足以进行基于测序的可靠基因型鉴定。根据这些个体基因型，我们发现遗传多样性很低，且站点之间的遗传多样性变化也不大。等位基因丰富度（Ar）从Dioundou的2.13到Mbane的2.75不等，观察到的杂合度（Ho）从Ndiawara和Saneinte的0.38到Guia和Mbane的0.41不等（表1）。除了位于Guiers湖上的两个站点Mbane和Saneinte外，所有站点的近交系数（Fis）都不为零。站点之间的成对Ds遗传距离从Ndiawara和Dioundou之间的0.0019不等，这两个站点都位于Doué河沿岸，相距约4.8公里；而Ouali Diala（Doué河）和Lampsar之间的距离为0.4354，相距约160.3公里。观察到的站点之间的遗传分化遵循隔离距离模式（Mantel r=0.76；p值=0.0001，图S5）。表1. 基于本研究中开发的31个微卫星标记，每个采样站点的B. truncatus的遗传多样性统计。Na：等位基因数量；Ar：等位基因丰富度；He：基因多样性（Nei 1978）；Ho：观察到的杂合度；Fis：个体间基因拷贝随机化10,000次后的Fis p值。

3.3 环境和蜗牛相关细菌群落的多样性及B. truncatus蜗牛核心微生物群的表征
环境中的细菌群落在各个站点之间的alpha多样性相同，除了Lampsar站点的alpha多样性较低（无论使用哪种指数，即物种丰富度、Shannon指数、Simpson指数）（图S6）。此外，除了Lampsar站点外，B. truncatus的微生物群的多样性低于水生细菌群落，当考虑到ASV丰富度（Kruskall-Wallis卡方=91.13；p值<0.001）、Shannon多样性指数（Kruskall-Wallis卡方=95.32；p值<0.001）和Simpson指数（Kruskall-Wallis卡方=97.41；p值<0.001）时也是如此（图S6）。我们发现不同采样站点之间的B. truncatus微生物群平均alpha多样性指数存在显著差异（所有p值<0.05，表S8和图S7A）。成对事后测试显示了站点特定的alpha多样性差异（见表S9–S11）。根据我们的线性混合效应模型，没有证据表明蜗牛的壳大小影响其微生物群的alpha多样性（ASV的数量），即使考虑了长度（t值=-1.598；p值=0.113）或宽度（t值=-0.757；p值=0.451）。使用Shannon指数也得出了类似的结果。此外，我们没有发现受感染和未受感染蜗牛之间的alpha多样性存在显著差异（所有p值>0.05，表S12和图S7B）。在整个样本中发现了30个细菌门，包括环境DNA和蜗牛中的细菌，其中18个（即60%）同时存在于eDNA和蜗牛样本中，12个（即40%）仅存在于环境中（图S8）。在环境样本中鉴定出的10个最丰富的门中，有7个也存在于蜗牛微生物群中（图2）。在B. truncatus中发现的三个门是Patescibacteria、Deinococcota和Fusobacteriota，它们在总体蜗牛中的相对丰度分别排名第第四、第五和第九（图2A）。仅存在于环境样本中的三个门是Verrucomicrobiota、Desulfobacterota和Acidobacteriota，它们在所有环境样本中都有发现，并且在总体站点中的相对丰度分别排名第第六、第九和第十（图2B）。图2（在图查看器中打开）
（A）来自九个不同站点的B. truncatus微生物群中十个最丰富门的相对丰度。（B）来自九个不同站点的环境样本中十个最丰富门的相对丰度。（C）在9个研究站点中，B. truncatus蜗牛核心微生物群的细菌组成在家族水平上的分布。Proteobacteria在所有采样站点的B. truncatus微生物群中占主导地位，其次是Bacteroidota和Firmicutes，它们的相对丰度在站点之间有所不同（图2A）。通过考虑至少出现在90%的蜗牛中的细菌家族，对B. truncatus的核心微生物群在家族水平上进行了表征。核心微生物群由6个家族组成，这些家族在蜗牛中总共识别出了134个家族，尽管它们的相对丰度有所不同（图2C）。这些家族包括Chitinophagaceae（占核心微生物群读数的73.3%）、Oxalobacteraceae（3.3%）、Sphingomonadaceae（2.4%）、Weeksellaceae（14.1%）和Flavobacteriaceae（3.2%）。

3.4 确定 structuring 环境和蜗牛细菌群落的因素
3.4.1 B. truncatus 蜗牛的微生物群与环境细菌群落的不同
基于从54个环境样本和118只B. truncatus个体（最初为124只，但在稀释过程中有所丢失）中表征的微生物群，我们发现与整个B. truncatus相关的总微生物群与环境中存在的细菌群落不同。Bulinus truncatus和环境样本在第一个轴上聚类成两个不同的组，这解释了总方差的18.27%（图3）。对于每个矩阵（即蜗牛和环境），样本然后根据采样站点在第二个轴上聚类，这解释了总方差的6.36%（图3）。这样的差异通过PERMANOVA分析得到了证实，该分析表明样本类型（即B. truncatus蜗牛和环境样本）的效应显著（F值=50.5；p值<0.001）以及采样站点的效应显著（F值=6.81；p值<0.001）。基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析也得出了类似的结果（样本性质：F值=106.3；p值<0.001；站点：F值=11.17；p值<0.001；图S9）。
主坐标分析（PCoA）图显示了基于每对样本之间获得的成对Jaccard距离分布的环境样本（三角形）和B. truncatus蜗牛相关的（点）细菌群落沿两个第一个PCoA轴的分布。

3.4.2 B. truncatus 蜗牛的微生物群在地理上是结构化的，部分是由它们的遗传背景和地理距离驱动的，在较小程度上是由环境驱动的
基于从B. truncatus微生物群获得的Jaccard距离矩阵进行的主坐标分析（PCoA）的前两个轴解释了总方差的17.38%（9.85%和7.53%）。我们的PERMANOVA分析支持采样站点对B. truncatus微生物群结构的影响（F值=6.09；p值<0.001，图4）。使用成对Bray-Curtis距离也得到了类似的结果（F值=9.71；p值<0.001，图S10）。相反，我们没有发现B. truncatus的感染状态对蜗牛微生物群的贝塔多样性有影响，无论是基于Jaccard距离（图4）还是基于Bray-Curtis距离（所有p值>0.05，表S13和图S10），即使考虑了采样站点的影响也是如此。基于我们在站点级别进行的一系列部分Mantel测试，我们也没有发现B. truncatus的大小差异对蜗牛微生物群的贝塔多样性有影响（表S7）。
主坐标分析（PCoA）图显示了根据原始采样站点（见颜色图例）和基于分子诊断的感染状态的B. truncatus蜗牛的细菌群落，沿两个第一个PCoA轴分布（根据每对样本之间计算的成对Jaccard相似性指数）。每个着色的小点代表来自给定采样站点的一个蜗牛宿主。大点是对于吸虫分子诊断呈阳性的蜗牛宿主。中等大小的点是来自每个采样站点的蜗牛细菌群的质心。每条线代表样本与来自每个采样站点的蜗牛细菌群的质心之间的连接。根据基于距离矩阵的多变量回归（MRM）以及我们的一系列相关性测试（图5），能够解释B. truncatus微生物群在个体层面之间计算出的平均Jaccard指数的变量，按重要性排序分别为：在个体层面伪重复的地点之间的地理距离（r = 0.37；p值 = 0.0001）、个体之间的Nei遗传距离（r = 0.17；p值 = 0.0001），以及在个体层面伪重复的地点层面之间计算出的水生细菌群落的平均Jaccard指数（r = 0.07；p值 = 0.008）。图5在图形查看器中打开。图中的散点图显示了细菌群落距离（由成对Jaccard相似性指数确定）作为地理距离的函数，涵盖了环境样本（A）和B. truncatus蜗牛（B）。B. truncatus蜗牛微生物群差异的散点图（由Jaccard指数确定）作为基于31个微卫星位点的B. truncatus个体之间的Nei遗传距离的函数（C）。图中包括最佳拟合蓝线以突出显示趋势。

4 讨论
4.1 B. truncatus自然种群中微生物群的组成
4.1.1 B. truncatus中的细菌群落比环境样本中的细菌群落具有更低的阿尔法多样性
我们的研究结果提供了关于与B. truncatus自然种群相关的微生物群组成的新见解。总体而言，B. truncatus的微生物群落多样性低于周围淡水环境中的细菌群落。这一点在某种程度上是预料之中的，因为从环境中收集的细菌群落包括自由生活的细菌、由所有与淡水栖息地相关的生物释放的细菌，以及在eDNA采样过程中可能被捕获的与淡水微生物相关的细菌（例如藻类、无脊椎动物）（Mikhailov等人2019；Gendron等人2019；Sadeghi等人2021）。此外，宿主微生物群通常被认为是环境细菌群落的子样本，这是由于宿主内在特性导致的过滤作用（Reese和Dunn 2018；Mazel等人2018；Suzzi等人2023）。特别是，宿主构成了一个生态位，其适宜性在很大程度上受到宿主免疫系统的影响，免疫系统作为选择压力，促进某些有益细菌的生长，同时抑制潜在病原体并维持微生物群的平衡（Belkaid和Harrison 2017）。与此一致的是，在B. truncatus所有样本中表现最显著的10个细菌门中有7个也存在于周围的水生环境中。最近对其他淡水蜗牛（包括Ampullaceana balthica和Galba truncatula）的研究也描述了蜗牛微生物群的阿尔法多样性低于环境细菌群落（Herlemann等人2024；McCann等人2024）。在我们的案例中，由于eDNA是沿着水柱收集到水-沉积物界面，因此观察到的环境样本和B. truncatus之间细菌群落的丰富度差异可能更加明显，从而提供了样本点处环境细菌群落的广泛视图。尽管全局测试表明站点之间存在显著差异，但事后比较显示只有Mbane站点与其他三个站点（Guia、Saneinte和Lampsar）有显著差异，其中MBane的阿尔法多样性低于这些站点。MBane与Saneinte之间的特别低的阿尔法多样性很值得注意，因为这两个站点仅相隔3.2公里，并且位于Guiers湖的同一直线上。在我们的研究中，没有明显的技术因素（例如测序覆盖度的差异）或测量到的生物因素（例如宿主大小、宿主遗传多样性）能够单独解释这种模式。例如，这两个站点在可用食物资源方面的生态差异可能是解释这种差异的一个因素，尽管我们在野外没有收集这些信息。实际上，研究表明，除了宿主的生理特征外，饮食多样性（外源微生物多样性）也会影响肠道微生物群的阿尔法多样性（Reese和Dunn 2018）。在湖泊尺度上进行更详细的生态因素研究可能有助于更好地理解这些结果。
4.1.2 B. truncatus自然种群中的微生物群组成
我们观察到，在所有采样点中，Proteobacteria、Bacteroidota和Firmicutes是B. truncatus微生物群中的优势门类，这与之前对许多不同动物的研究结果一致（McCann等人2024；Shi等人2024；Yuan等人2025）。在这些门类中，Bacteroidota和Firmicutes在蜗牛体内的丰度相对较高，超过了它们周围的水生环境中的丰度。这些门类因其在营养代谢、发酵和宿主免疫中的作用而被广泛认可（Huot等人2020；McCann等人2024；Yuan等人2025）。特别是Bacteroidota的普遍存在可能反映了宿主对生理压力的反应，例如寄生虫感染（McCann等人2024）。相比之下，尽管蓝细菌（Cyanobacteria）和放线菌（Actinobacteria）在其周围栖息地中数量较多，但在蜗牛肠道生态系统中的代表程度较低，这突显了蜗牛肠道生态系统的选择压力（Herlemann等人2024）。这些模式支持这样的观点：微生物群的组成反映了生态暴露、宿主生理和历史关联的综合作用，这与在B. straminea中的发现相似，其中微生物群似乎会随着栖息地的变化而变化（Yuan等人2025）。在家族水平上，B. truncatus的“共同”核心微生物群包括属于Bacteroidota门的Chitinophagaceae、Weekselaceae和Flavobacteriaceae，以及属于Proteobacteria门的Oxalobacteraceae、Sphingomonadaceae和Moraxellaceae。有趣的是，Proteobacteria、Bacteroidota和Firmicutes之前已经在最初来自西班牙并在实验室中维持了几代的B. truncatus样品中被检测到（Huot等人2020）。特别是Flavobacteriaceae（Bacteroidota）和Sphingomonadaceae（Proteobacteria）是这种实验室饲养的西班牙B. truncatus菌株和这里研究的塞内加尔北部所有自然B. truncatus种群共有的家族。这些细菌很可能对B. truncatus的发展具有重要功能。相反，一些细菌家族，尤其是Chitinophagaceae，在这里研究的B. truncatus自然种群中相对丰富，但在之前研究的西班牙B. truncatus实验室菌株的微生物群中却不存在或丰度较低（Huot等人2020）。Chitinophagaceae家族的名字表明它们能够分解环境中的几丁质，主要存在于土壤和水生沉积物中（Lim等人2009；Madhaiyan等人2015）。在自然条件下，B. truncatus以难消化的食物资源为食，包括碎屑、腐烂的大型植物和丝状藻类，因此可能需要一个高度多样化的微生物群来进行消化（Madsen 1992；Van Horn等人2012）。在这方面，实验室种群的食物资源复杂性降低（例如，有机洗过的生菜）也可能解释了选择压力的减弱以及某些参与蜗牛消化的细菌类群的丢失。或者，虽然不是唯一的原因，我们在塞内加尔的B. truncatus野外种群与西班牙实验室菌株之间观察到的核心微生物群的差异可能是由共同进化过程驱动的，这部分是由于B. truncatus种群的进化历史；在西班牙建立的种群可能已经与塞内加尔的种群分离了很长时间。这一最新假设意味着，B. truncatus种群的遗传结构受到了其进化历史的影响，这正是我们的研究在塞内加尔北部所展示的结果。

4.2 自然B. truncatus蜗牛微生物群的结构因素
我们的结果显示，B. truncatus的微生物群在地理上具有很好的结构，尽管它们展示的“距离-衰退”模式不如水生细菌群落那么明显。自由生活的细菌群落通常显示这种模式，尽管这种关系的稳健性可能因生态背景和地理尺度而异（Clark等人2021）。尽管导致这种“距离-衰退”模式的因素仍有争议，但普遍认为这至少是由于细菌群落的扩散受限和环境的异质性造成的（Green和Bohannan 2006；Sadeghi等人2021）。我们认为，我们研究中观察到的水生细菌群落的“距离-衰退”模式的强度源于生态异质性和地点之间的地理距离紧密相关，较接近的地点属于相同的生态系统（例如Guiers湖、Le Doué河）。这里观察到的B. truncatus微生物群的较不明显的“距离-衰退”模式与Herlemann等人对北欧淡水蜗牛A. balthica进行的类似地理尺度研究结果一致（Herlemann等人2024）。正如作者在他们的模型中所建议的，我们可以假设B. truncatus为它们的相关细菌创造了更加均匀的环境，与B. truncatus和水生细菌群落所在的环境的异质性不同。另一个非排他的假设是，B. truncatus微生物群的结构由其他主导因素决定，特别是某些特定于B. truncatus种群的进化因素。在这方面，MRM分析显示，B. truncatus宿主之间的遗传距离也解释了它们相关微生物群的贝塔多样性（尽管程度稍低），这表明B. truncatus种群的进化历史也影响了微生物群的结构，这一点受到迁移和漂变的强烈影响，如通过观察到的强烈IBD（隔离度）模式所示。因此，虽然蜗牛物种与其微生物群之间的系统共生已经在物种间水平上得到记录（Huot等人2020；Schols等人2023），但我们认为系统共生也可能发生在物种内水平。B. truncatus种群中观察到的强烈IBD模式是预期的，并且与之前在非洲不同国家对该物种进行的遗传研究结果相符。早期基于同工酶或有限数量微卫星的研究表明，自然B. truncatus种群中的自交现象很常见（Njiokou等人1993；Jarne等人1994）。另一方面，B. truncatus种群经常经历灭绝和重新殖民的波动阶段，这些阶段随着湿季和干季的交替而发生，极大地塑造了这一物种的（有时是临时的）栖息地。这些灭绝和重新殖民事件通常由少数自我受精的个体引起，这解释了即使在地理上接近的种群之间也观察到的低遗传多样性和遗传分化（Njiokou等人1993；Maes等人2022）。基于本研究中新开发的31个微卫星标记，我们没有发现自交的明确证据，而在地理上接近的种群之间观察到的低遗传分化值表明这些种群之间的基因流不容忽视，且随着地理距离的增加而减弱。我们通过所有研究地点都是永久性的水生栖息地，并且B. truncatus种群全年都存在这一事实来解释这些结果。这限制（但并未完全排除）了临时种群灭绝的可能性，并允许种群在人口统计上发展，从而减少了遗传漂变的影响，并可能促进了交叉受精。此外，Le Doué河中的水流肯定促进了地理上接近的种群之间的基因流，这也解释了这些种群之间观察到的较低遗传分化。另一方面，尽管不是唯一的原因，我们在塞内加尔的B. truncatus野外种群与西班牙实验室菌株之间观察到的核心微生物群的差异可能是由B. truncatus种群的进化历史共同驱动的共进化过程的结果；在西班牙建立的种群可能已经与塞内加尔的种群分离了很长时间。这一最新假设意味着，B. truncatus种群的遗传结构受到其进化历史的影响，这正是我们在塞内加尔北部所见的结果。

4.2 自然B. truncatus蜗牛微生物群的结构因素
我们的结果显示，B. truncatus的微生物群在地理上结构良好，尽管它们展示的“距离-衰退”模式不如水生细菌群落那么明显。自由生活的细菌群落通常显示这种模式，尽管关系的稳健性可能因生态背景和地理尺度而异（Clark等人2021）。虽然导致这种“距离-衰退”模式的因素仍有争议，但普遍认为这至少是由于细菌群落的扩散受限和环境的异质性造成的（Green和Bohannan 2006；Sadeghi等人2021）。我们认为，我们研究中观察到的水生细菌群落的“距离-衰退”模式的强度源于生态异质性和地点之间的地理距离密切相关，较接近的地点属于同一生态系统（例如Guiers湖、Le Doué河）。这里观察到的B. truncatus微生物群的较不明显的“距离-衰退”模式与Herlemann等人对北欧淡水蜗牛A. balthica进行的类似地理尺度研究结果一致（Herlemann等人2024）。正如作者在他们的模型中所建议的，我们可以假设B. truncatus为它们的相关细菌创造了更均匀的环境，与B. truncatus和水生细菌群落所在的环境的异质性不同。另一个非排他的假设是，B. truncatus微生物群的结构由其他主导因素决定，特别是某些特定于B. truncatus种群的进化因素。在这方面，MRM分析显示，B. truncatus宿主之间的遗传距离也解释了它们相关微生物群的贝塔多样性（尽管程度稍低），这表明B. truncatus种群的进化历史，该历史受到迁移和漂变的强烈影响，如观察到的强烈IBD（隔离度）模式所示，也是B. truncatus微生物群结构的重要因素。因此，虽然蜗牛物种与其微生物群之间的系统共生已经在物种间水平上得到记录（Huot等人2020；Schols等人2023），但我们认为系统共生也可能发生在物种内水平。B. truncatus种群之间观察到的强烈IBD模式是预期的，并且与之前在非洲不同国家（包括塞内加尔）对该物种进行的遗传研究结果相符。早期基于同工酶或有限数量微卫星的研究表明，B. truncatus自然种群中的自交现象很常见（Njiokou等人1993；Jarne等人1994）。另一方面，B. truncatus种群经常经历灭绝和重新殖民的波动阶段，这些阶段随着湿季和干季的交替而发生，极大地塑造了这一物种的（有时是临时的）栖息地。灭绝和重新殖民事件通常由少数自我受精的个体引起，这解释了即使在地理位置接近的种群之间也观察到的低遗传多样性和遗传分化（Njiokou等人1993；Maes等人2022）。基于本研究中新开发的31个微卫星标记，我们没有发现自交的明确证据，而在地理上接近的种群之间观察到的低遗传分化值表明这些种群之间存在不可忽视的基因流，随着种群之间的地理距离增加，这种基因流趋于减弱。我们通过所有研究地点都是永久性的水域栖息地，并且可能全年都有B. truncatus种群存在这一事实来解释这些结果。这限制（但并不完全排除）了临时种群灭绝的可能性，并允许种群在人口统计上发展，从而减少了遗传漂变的影响，并可能促进了交叉受精。此外，Le Doué河中的水流肯定促进了地理上接近的种群之间的基因流，这也解释了这些种群之间观察到的较低遗传分化。在这方面，值得注意的是，在Guia运河中建立的种群与Le Doué河连接，与Le Doué河沿岸建立的种群相比，遗传分化更高。同样，Guiers湖岸边的采样点仅相距3.2公里，风力产生的表面流动很可能促进了这两个种群之间的基因流。相反，在地理上相距较远的种群之间观察到了较高的遗传分化值，这与基于10,750个SNP在相同地区记录的B. truncatus种群遗传模式一致（Maes等人2022）。综合来看，B. truncatus种群之间的地理距离、B. truncatus种群的遗传结构以及在较小程度上的当地水生细菌群落并不能完全解释B. truncatus微生物群的结构。这至少部分可能是由于采样偏差造成的，因为每个地点收集的蜗牛数量不等。实际上，较小的样本量可能会降低等位基因频率估计的准确性，从而增加Nei遗传距离的方差。然而，这一效应在我们的数据集中似乎较为有限，这一点从Ndiawara和Dioundou两个地理位置相近但样本量不同的种群之间观察到的最小遗传距离可以得到证明。就微生物群而言，每个地点的蜗牛数量减少理论上可能会低估α多样性，从而降低地点间的差异性。不过，在我们的数据中并未检测到这样的系统偏差。因此，我们认为不均衡的采样努力对我们得出的结论影响可以忽略不计。另一种解释可能是，本研究中可能忽略了其他生态因素，这些因素肯定在塑造B. truncatus的微生物群方面起到了作用。例如，较低的遗传分化和较小的地理距离显然无法解释在Guiers湖沿岸的两个地点（Saneinte和Mbaine）建立的B. truncatus种群之间的巨大差异。此外，由于这两个地点的环境细菌群落非常相似，这一因素也不太可能解释这两种B. truncatus种群之间的微生物群差异。更一般地说，当控制了B. truncatus的种群遗传学特征和地点间的地理距离后，水生细菌群落结构对蜗牛微生物群结构的解释作用很有限。这至少有两个方面是出乎意料的。首先，我们可能预期一些环境细菌会通过多种途径转移到B. truncatus体内，包括在蜗牛进食时被摄入或定植于蜗牛的外部组织中。实际上，大多数淡水蜗牛都是食碎屑的，或者以生物膜为食，因此为不同环境细菌提供了定植并最终在蜗牛胃肠道内建立的机会（Madsen 1992；Van Horn等人2012；Kivistik等人2023）。水生细菌群落对B. truncatus微生物群的影响较小，这进一步支持了B. truncatus具有筛选特定细菌的功能。这种筛选效应可能部分取决于B. truncatus谱系的遗传背景，从而限制了偶尔与B. truncatus相关的环境细菌群落之间的差异。需要强调的是，我们在这里关注的是B. truncatus的整体微生物群，而不仅仅是肠道微生物群。如果仅关注这些组织，可能会发现环境细菌群落与B. truncatus肠道微生物群之间有更好的一致性。事实上，我们确实发现了几种既存在于环境中也存在于B. truncatus体内的细菌门类。最后，作为生物环境的一部分，蜗牛体内发育中的吸虫并未显著影响B. truncatus的微生物群。大多数受感染的个体携带的细菌群落与未感染的同种个体相似。由于我们没有确定感染阶段（显性感染 vs. 未显性感染），我们无法评估受感染的蜗牛携带吸虫的时间长短。然而，Portet等人通过实验证明，吸虫感染可以在实验室饲养的蜗牛中引起短暂的菌群失调，随后几天或几周内逐渐恢复到基线状态（Portet等人2021）。这表明我们研究中的某些受感染的B. truncatus可能已经感染了足够长的时间，使其微生物群得以恢复。相反，那些微生物群与未感染蜗牛不同的少数受感染个体可能代表的是最近发生的感染，在恢复之前。或者，这些具有不同微生物群的个体可能曾经暴露于吸虫，但由于免疫原因不兼容，从而触发了免疫反应，导致了短暂的菌群失调（Schols等人2025）。由于未评估感染阶段和兼容性，这些解释仍然只是假设性的。最后，由于我们分析了整个蜗牛的微生物群，我们也对B. truncatus蜗虫及其潜在感染寄生虫的微生物群进行了测序，因此可能会发现不同感染吸虫种类导致的微生物特征差异，正如Salloum及其同事在受到四种不同吸虫感染的泥蜗牛Zeamantus subacarinatus中所观察到的（Salloum等人2023）。然而，由于我们研究中观察到的感染率较低，我们可能没有足够的结果来稳健地探索感染状态与B. truncatus微生物群组成之间的联系，这意味着我们可能错过了这些信号。除了这些生物学和方法学上的考虑之外，我们还评估了低水平污染对我们测序数据的潜在影响。在阴性对照中检测到的一小部分ASVs也出现在蜗牛和环境样本中（图S4）。它们在不同样本和对照中的相对丰度有所不同，有些ASVs在对照中更丰富，而有些在生物样本中更丰富——这种模式与基于扩增子的微生物组研究中常见的低水平背景污染一致。因为这些ASVs没有显示出一致的污染特征，且它们的存在并未改变主要群落模式，因此被保留在数据集中。

5 结论

我们的研究揭示了B. truncatus自然种群微生物群的明显地理结构，这一结构最好用B. truncatus种群的地理和遗传结构来解释。这表明B. truncatus种群的进化轨迹在塑造其微生物群方面起着重要作用。这呼吁进一步的研究，以探讨可能影响宿主微生物群组成的基因组决定因素。然而，值得强调的是，来自遗传和地理上相近的B. truncatus种群之间的一些显著差异仍然无法解释，这表明一些未被探索的生态因素或宿主的生理特征（如年龄或适应性）也可能影响该物种的微生物群。在这些生态因素中，我们发现周围水生环境中的细菌群落以及宿主体内发育的吸虫的存在并没有影响宿主微生物群的整体结构。为了识别在生态尺度上影响自然蜗牛种群微生物群的潜在环境因素，对与宿主种群相关的微生物群以及宿主所在环境的微生物群进行额外的时间监测可能是一个有价值的方法。这需要对与蜗牛水生生态系统相关的环境参数进行深入表征。对于B. truncatus来说，应该针对那些经历高时间环境波动的栖息地（如临时池塘）中的种群进行研究。更一般地说，在具有重要季节性环境变化的温带地区进行此类时间监测研究将有助于更好地理解影响淡水腹足类微生物群的潜在环境因素。最后，还需要进一步研究遗传和环境变量之间的相互作用，以具体评估宿主微生物群的可塑性，从而更好地理解环境、宿主及其微生物群之间的内在关系。

作者贡献

O.R.、P.D.、B.G.和M.J.J.负责研究设计。O.R.、P.D.、B.S.和J.B.进行了野外工作。M.J.J.和P.D.进行了实验室工作。O.L.和E.C.开发了微卫星数据集。M.J.J.、P.D.、O.R.、E.T.和T.L.参与了数据分析。M.J.J.、O.R.和P.D.撰写了初稿，所有作者都参与了修订工作。O.R.和B.G.监督了整个项目。

致谢

我们衷心感谢Bio-Environment平台（UPVD，奥克西塔尼大区，CPER 2007–2013 Technoviv，CPER 2015–2020 Technoviv2）以及Jean-Fran?ois Allienne、Margot Doberva和Michèle Laudié在图书馆准备和测序方面的支持。微卫星的开发和基因分型是在PGTB（doi: 10.15454/1.5572396583599417E12）进行的，得到了Zoé Compagnie、Adline Delcamp和Erwan Guichoux的帮助。这项研究部分得到了欧洲和发展中国家临床试验伙伴关系（EDCTP2）计划（TMA2018CDF-2370）的支持，该计划得到了欧盟的资助。它还得到了法国食品、环境和职业健康与安全局（PNRES 2019/1/059 Molrisk）和奥克西塔尼大区的支持（Schistodiag计划）。这项研究得到了LabEx CeMEB的支持，这是ANR“未来投资”计划（ANR-10-LABX-04-01）的一部分，并在“卓越实验室（LABEX）”TULIP（ANR-10LABX-41）的框架内进行。此外，它还得到了MICROVECT项目（RIVOC奥克西塔尼大区关键项目，蒙彼利埃大学）的支持。开放获取出版物的资金由COUPERIN CY26提供。

这项工作得到了MICROVECT项目（RIVOC奥克西塔尼大区关键项目，蒙彼利埃大学）；欧洲和发展中国家临床试验伙伴关系（EDCTP）计划以及法国食品、环境和职业健康与安全局的支持。该研究是在“卓越实验室（LabEx）”TULIP（ANR-10-LABX-41）和LabEx CeMEB（ANR-10-LABX-04-01）的框架内进行的。资助者在研究设计、数据收集与分析、出版决定或手稿准备方面没有发挥作用。

利益共享声明：该项目获得了塞内加尔Nagoya办公室的授权，允许使用遗传资源（授权编号：001339，日期为2021年11月15日，参考编号：V/L du 28 octobre 2021），由塞内加尔国家公园管理局批准。

伦理声明

该项目已获得塞内加尔国家伦理委员会（CNERS）的批准（协议编号：00061/MSAS/CNERS/SP）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究生成的所有数据，包括原始序列文件、处理后的OTU表格、元数据和补充的大表格，都可以在Dryad数字存储库中找到：https://doi.org/10.5061/dryad.v6wwpzh5d。