膳食中的螺旋藻和黑孜然补充剂可以缓解尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）在极端高温环境下的应激反应

《Aquaculture and Fisheries》：Dietary spirulina and black cumin supplementation mitigate extreme warm temperature stress in Nile tilapia, Oreochromis niloticus

　　苏迈亚·宾特·艾莎 | 马德·贾基乌尔·伊斯兰 | 莎米·阿克特·米米 | 萨布丽娜·阿克特·舒利 | 塔斯尼亚·伊斯兰·奥迪蒂 | 马德·卡比尔·侯赛因 | 基扎尔·艾哈迈德·苏蒙 | 马德·沙贾汉 | 马德·沙阿兰 | 哈鲁努尔·拉希德
孟加拉国农业大学渔业管理系，迈门辛，2202，孟加拉国

**摘要**
全球气候变化导致近地表温度升高，这对依赖池塘的水产养殖系统构成了重大挑战，因为这些系统在控制极端高温方面能力有限。本研究旨在探讨在鱼饲料中添加螺旋藻（Spirulina platensis）和黑孜然（Nigella sativa）种子是否能够缓解极端高温带来的压力。实验中，鱼被分别喂食对照组饲料或添加了1%螺旋藻（SP 1%）、2%螺旋藻（SP 2%）、0.75%黑孜然种子（BC 0.75%）或1%黑孜然种子（BC 1%）的饲料，持续35天，随后在28°C的温度下暴露于极端高温（34°C）环境中15天。研究评估了鱼的生长表现、血液生化指标、肠道组织结构以及卵巢发育情况。结果显示，在两种温度下，喂食添加了螺旋藻和黑孜然的鱼组的最终体重、体重增长率和特定生长率显著更高（P < 0.05），同时饲料转化率也有所降低。在高温暴露期间，添加了这些成分的鱼组的血清总蛋白水平显著升高（P < 0.05），而SGPT、甘油三酯和尿素水平则较低。血液学参数（包括红细胞、白细胞、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白含量）在添加了这些成分的鱼组中保持得更好，而在对照组中则出现了明显下降。肠道组织学观察发现，喂食SP 2%和BC 1%饲料的鱼的绒毛长度、宽度、面积和杯状细胞数量显著增加。卵巢发育也得到了改善，添加了这些成分的鱼组的卵细胞成熟度更高，卵细胞直径更大；而对照组鱼则出现了卵巢畸形和未成熟卵细胞增多现象。总体而言，饲料中添加螺旋藻和黑孜然种子有效缓解了由高温引起的压力，并提高了尼罗罗非鱼的生理适应能力。

**1. 引言**
气候变化被广泛认为是21世纪最紧迫的环境问题。《气候风险指数》第16版明确指出，气候变化的影响已无法在任何大陆或地区被忽视。然而，极端天气事件对某些国家的影响尤为严重，这些国家更容易受到损害（Eckstein等人，2020年）。与气候相关的压力因素包括降雨模式的变化、蒸发量增加和干旱趋势、极端高温和低温事件、海平面上升以及海洋酸化（Ahmed等人，2019年；Tran等人，2022年）。因此，野生鱼类和水产养殖系统中的鱼类都面临着热应激（Islam等人，2020b年）。其中，温度是影响鱼类生理、生长和发育的主要非生物因素（Islam等人，2020b年；Islam等人，2024b年；2022年）。作为变温动物，温度的变化直接影响鱼类的生理、生长和繁殖（Chowdhury等人，2010年）。当温度超出鱼类的适宜范围时，它们的生理活动会增加，更容易患病，最终可能导致死亡（Das等人，2004年；Fu等人，2018年；P?rtner & Farrell，2008年；Verhille等人，2016年）。生长、组织形态学和血液学参数是评估鱼类热应激的重要指标（Islam等人，2021b年；Phrompanya等人，2021年）。鱼类在各种环境压力（包括温度）下的生理状态通常通过血液学指标进行评估（Affonso等人，2002年；Sadiqul等人，2016年；Salam等人，2015年；Shahjahan等人，2019年；Sharmin等人，2015年）。血细胞在鱼类的免疫防御中起着重要作用，因此监测血细胞的特征有助于研究人员了解生理应激反应的原因（Long等人，2015年）。血清生化指标（如血清葡萄糖、总蛋白和谷丙转氨酶SGPT）也与鱼类的温度应激有关（Islam等人，2020b年，2022年；Liu等人，2016年）。

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是仅次于鲤鱼的养殖和消费量第二大的淡水鱼类，其特点是在热带和亚热带条件下都能成功养殖（FAO，2020年）。由于对人工饲料的需求较低（Ogello等人，2014年）、适应水质和环境变化的能力强（Singha等人，2021年）、生产周期短（Islam等人，2021b年）、没有肌肉间的骨骼（Moesch等人，2016年）以及对大多数病原体的高抵抗力（Al-Deriny等人，2020年；Foysal等人，2020年；Naiel等人，2021年），这种鱼类在全球范围内得到广泛养殖。然而，由于其集约化养殖方式，罗非鱼容易受到多种压力因素的影响，包括热浪压力（Bao等人，2018年）。尽管尼罗罗非鱼能耐受较宽的温度范围（25-30°C），但超出理想温度范围的水温会影响其生长、繁殖和免疫力（Dawood等人，2020年；El-Sayed，2020年，第348页）。此外，当水温达到或超过32°C时，尼罗罗非鱼的产卵会停止（Hossan等人，2013年）。因此，找到适当的缓解措施以帮助鱼类在压力和热浪事件中存活至关重要。

有多种方法可以减轻夏季高温对鱼类的不利影响，包括覆盖池塘、加深池塘、使用替代物种和养殖方法，以及改变养殖地点和持续时间（D'Abramo & Slater，2019年；Slater等人，2018年）。此外，在饲料中添加功能性成分并实施营养管理措施可能有助于减轻水产养殖鱼类的温度压力（D'Abramo & Slater，2019年；Hassaan等人，2019年；Herrera等人，2019年）。草药等物质被认为可以通过特定或非特定途径刺激免疫系统，增强动物的防御能力（Vallejos-Vidal等人，2016年）。天然产物如草药提取物、微藻和酵母具有抗氧化、抗应激、促进生长和刺激免疫的作用，被认可为增强动物免疫防御系统的有效成分。它们作为鱼类饲料中的环保成分（Ayd?n，2021年），与商业替代品相比具有较低的副作用和成本效益（Harikrishnan等人，2003年；Kim等人，2002年；Supamattaya等人，2005年）。这些产品可以以多种形式添加到饲料中，包括整株植物或部分（叶子、根或种子）提取物，或与益生元和其他免疫刺激剂混合使用（Hai，2015年）。许多植物或其副产品含有酚类、多酚类、生物碱、醌类、萜类、凝集素和多肽成分，可作为抗生素、免疫预防剂和饲料添加剂的替代品（Harikrishnan等人，2011年）。将药用植物作为天然无害物质用于水产养殖具有巨大潜力，可以替代合成化合物（Chang，2000年）。

药用植物及其衍生物因其富含生物活性化合物（如多酚类、类胡萝卜素、黄酮类、生物碱和精油）而被越来越多地认为是有效的水产饲料添加剂（Farsani等人，2019年；Ming等人，2012年；Sarkar等人，2021年）。研究表明，在饲料中添加植物来源的色素、提取物和植物化学物质可以显著提高多种鱼类的生长表现、饲料效率、消化酶活性和营养利用效率（Ahmadifar等人，Kalhor等人，2022年；Mashhadizadeh等人，2024年）。这些化合物还能通过刺激吞噬活性、溶菌酶产生、呼吸爆发、补体活性和免疫球蛋白水平来增强先天性和适应性免疫反应（Ahmadifar等人，Mohammadzadeh等人，2022年；Van Doan等人，2022年）。此外，药用植物添加剂通过上调超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等酶的活性，减轻生物和非生物压力条件下的氧化损伤（Ahmadifar等人，2019年，2021年）。总体而言，使用药用植物及其衍生物提供了一种可持续且环保的方法，可以增强鱼类的健康、疾病抵抗力和生产力，同时减少对抗生素和合成化学物质的依赖（Ahmadifar等人，2021年；Harikrishnan等人，2022年）。

螺旋藻（Spirulina platensis）属于蓝绿藻家族，富含抗氧化化合物（如β-胡萝卜素、藻蓝蛋白、生育酚、超氧化物歧化酶、藻胆蛋白、类胡萝卜素和多糖）。这些化合物在清除自由基、增强鱼体色素、生长和免疫力方面具有重要作用（Nakagawa & Montgomery，2007年）。除了抗氧化剂外，螺旋藻还含有高比例的蛋白质（高达70%）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、维生素（尤其是B12）和矿物质（锌、镁、锰、硒和铁）（Simsek等人，2007年）。由于没有纤维素细胞壁，螺旋藻易于消化（de Morais等人，2010年；Karkos等人，2011年），并且已被发现可以增强细胞免疫反应（Watanuki等人，2006年）并促进红细胞和白细胞的生成（Liu等人，1991年），从而通过增强吞噬活性来提高免疫力（Duncan & Klesius，1996年）。研究表明，添加螺旋藻可以改善鱼类的生长表现、饲料利用率、肠道微生物群、体化学分析、血液生化和血液学指标、消化酶活性以及抗氧化和免疫刺激特性（Eissa等人，2024年；Rana等人，2024年；Zahan等人，2024年）。黑孜然（Nigella sativa）种子富含维生素、矿物质和多种活性化合物，包括抗氧化剂（如百里醌和二百里醌）、黄酮类、甾醇、生物碱和不饱和脂肪酸（尤其是棕榈酸、油酸和亚油酸），因此被认为具有多种健康促进作用（Cetin等人，2008年）。这些种子及其衍生物对人类和动物的健康具有治疗潜力，具有抗寄生虫、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗糖尿病和保肝作用（Altunoglu等人，2017年；Arici等人，2005年；Aycan等人，2018年；Halder等人，2021年；Hussein等人，2002年；Lutterodt等人，2010年；Salem & Hossain，2000年）。此外，研究表明，添加黑孜然可以改善鱼类的生长表现和免疫力（Dey等人，2020年）。将这些副产品添加到饲料中不仅为行业提供了替代饲料成分，还具有经济优势和健康益处（Ayd?n，2021年）。

由于螺旋藻和黑孜然具有药用特性，它们有可能作为免疫刺激剂，缓解夏季极端高温引起的鱼类应激反应。多项研究表明，添加1.0%-5.0%的螺旋藻和0.25%-2.5%的黑孜然种子对鱼类具有普遍的益处（Adel等人，2016年；Ayd?n，2021年；Bekta?等人，2018年）。多项研究探讨了螺旋藻和黑孜然种子对鱼类健康多个方面的影响，包括生长表现、饲料利用率、酶活性、血液学参数、血清生化参数、免疫力和疾病抵抗力（Abdalla等人，2014年；Awad等人，2022年；Dey等人，2020年；Elabd等人，2020年；Mahmoud等人，2018年；Velasquez等人，2016年；Youssif等人，2020年）。然而，关于这些成分如何共同对抗温度引起的应激，针对尼罗罗非鱼的综合研究仍不足。因此，本研究旨在实验性地评估添加了螺旋藻和黑孜然的饲料在尼罗罗非鱼暴露于极端高温环境中的保护作用。

**2. 材料与方法**
2.1. 实验饲料制备
先前的研究表明，添加1.0%-5.0%的螺旋藻和0.25%-2.5%的黑孜然种子对鱼类的生长表现、抗氧化能力、免疫调节和应激抵抗力具有积极作用。基于这些发现，我们选择了适量、营养安全且成本效益高的添加水平，以避免饲料适口性问题或营养失衡。干燥的螺旋藻由孟加拉国的Energaia有限公司提供，黑孜然种子则从当地市场采购（ACI Pure Black cumin seed，ACI有限公司，孟加拉国）。收集的饲料成分使用研磨机（Kiam Jar Mixer Grinder，Kiam Metal Industries有限公司）进行粉碎。将干燥的螺旋藻和黑孜然种子加入鱼饲料中，制备了四种饲料。将粉碎后的螺旋藻和黑孜然种子浸泡在70%的乙醇中并摇晃2-3分钟，然后均匀喷洒到1公斤的商业颗粒饲料（Tilapia grower feed，New Hope Feed Mill Bangladesh有限公司）上，并风干至乙醇完全蒸发，之后储存在4°C条件下备用。根据AOAC（1995）标准分析了测试饲料的近似成分（表1）。不含任何添加剂的饲料称为“对照组”。此外，基础饲料还分别添加了1%和2%的螺旋藻以及0.75%和1%的黑孜然种子，分别称为“SP 1%”、“SP 2%”和“BC 0.75%”、“BC 1%”饲料。

**表1.**实验饲料的配方和营养成分。饲料组成

| 饲料 | 控制组 (%) | SP 1% | SP 2% | BC 0.75% | BC 1% |
|------------|---------|---------|---------|---------|
| 鱼粉 | 19.76 | 19.76 | 19.76 | 19.76 |
| 大豆粕 | 19.76 | 19.76 | 19.76 | 19.76 |
| 黄玉米 | 25.69 | 25.69 | 25.69 | 25.69 |
| 小麦麸 | 25.69 | 24.69 | 23.69 | 24.69 |
| 鱼油 | 3.95 | 3.95 | 3.95 | 3.95 |
| 矿物质混合物 a | 2.68 | 2.68 | 2.68 | 2.68 |
| 维生素混合物 b | 2.47 | 2.47 | 2.47 | 2.47 |
| 螺旋藻 | 1.02 | - | - | 0.75 |

**近似分析（基于干物质）**

| 参数 | 控制组 | SP 1% | SP 2% | BC 0.75% | BC 1% |
|------------|---------|---------|---------|---------|
| 水分 | 12.96 | 11.87 | 15.96 | 11.37 |
| 粗蛋白 | 40.90 | 41.86 | 38.03 | 40.33 |
| 粗脂 | 10.17 | 9.07 | 9.35 | 11.25 |
| 灰分 | 5.78 | 6.23 | 6.56 | 5.88 |
| 碳水化合物 | 6.89 | 7.45 | 6.78 | 7.25 |
| NFE | 23.30 | 23.52 | 23.32 | 23.92 |

**注：** 总碳水化合物 = 100 - (粗蛋白 + 粗脂 + 灰分)。

**a** 矿物质混合物（El Bardeny公司），每0.25公斤含有：铁30,000毫克；锰60,000毫克；锌50,000毫克；铜4,000毫克；钴100毫克；碘300毫克；硒100毫克。

**b** 维生素混合物，每0.25公斤含有：（A）10,000,000国际单位；（D3）2,200,000国际单位；（E）10,000毫克；（K3）1,000毫克；（B1）1,000毫克；（B2）5,000毫克；（B6）1,500毫克；（B12）10,000毫克；泛酸10,000毫克；烟酸30,000毫克；叶酸1,000毫克；生物素50,000毫克；胆碱氯化物600,000毫克。

**2.2. 鱼类采集和实验设计**

从孟加拉国Mymensingh的Sharnalata Agro Fisheries有限公司的商业养鱼场采集了幼年尼罗罗非鱼（体长（10.2 ± 1.06厘米，体重（8.5 ± 0.94克）），并在一个有效容积约为1000升的塑料池中适应15天。适应期间，每天喂食两次（上午9:00和下午4:00），使用商业饲料（Tilapia grower feed，New Hope Feed Ltd，孟加拉国）直至饱腹。适应期结束后，将180条鱼随机分配到十五个有效容积约为80.0升、水温28摄氏度的塑料水箱中。适应15天后，再次记录鱼的体重和体长。从第二天开始，在环境温度（28摄氏度）下喂食测试饲料，持续35天。然后，所有组的鱼都暴露在模拟的极端高温（34摄氏度）下15天。为了诱导极端温度压力，水温以每天约1摄氏度的速度逐渐升高，直到达到所需温度。在极端高温条件下持续7天后，保持34摄氏度（图1）。实验期间，每天抽走鱼粪和未使用的饲料以维持水质。整个研究过程中保持连续充气。每天上午9:00和下午4:00喂食两次，直至饱腹。处理补充饲料时非常小心，以避免任何潜在的交叉污染。实验方案遵循孟加拉国Mymensingh农业大学动物福利和伦理委员会的规定。为了维持最佳水质，控制以下参数：溶解氧（DO）> 6.0毫克/升，氨（NH3）< 0.05毫克/升，硝酸盐（NO3?）和亚硝酸盐（NO2?）< 0.2毫克/升。此外，每周更换50%–60%的温度调节海水，以防止氮废物的积累。所有实验程序均符合欧盟指令2010/63/EU关于动物实验的规定，并得到孟加拉国Mymensingh农业大学动物研究伦理委员会的批准。

**2.3. 生长参数的测量**

测量了每条鱼的最终长度和重量。计算了形态测量值和与生长相关的参数，如净体重增加、体重增加百分比（%）、特定生长率（SGR）、饲料转化率（FCR）、肝体指数（HSI）、内脏体指数（VSI）和生殖腺体指数（GSI）（Islam等人，2020b；Islam等人，2020b）：

- 体重增加（克）= [(最终体重 - 初始体重)]
- 体重增加百分比（%）= [(最终体重 - 初始体重) / 初始体重] × 100
- 特定生长率（SGR%）= (W2 - W1) / T × 100
其中，W1 = 初始体重，W2 = 最终体重，T = 喂食天数
- 饲料转化率（FCR）= 干饲料摄入量（克）/ 湿体重增加（克）
- 肝体指数（HSI）= 肝脏重量（克）/ 体重（克）× 100
- 内脏体指数（VSI）= 内脏重量（克）/ 体重（克）× 100
- 生殖腺体指数（GSI）= 生殖腺重量（克）/ 体重（克）× 100

**2.4. 取样**

在开始热应激之前（喂食测试饲料35天后）和热应激暴露15天后，从每个重复组的水箱中随机收集三条鱼。取样前，用过量的三卡因甲磺酸盐（MS-222，50毫克/升）麻醉鱼。在5分钟内完成血液取样以减少处理压力。通过尾部穿刺使用无菌非肝素化注射器获取血液样本，并让其凝固30分钟。在4摄氏度下以4000转/分钟的速度离心15分钟后获取血清样本（Eppendorf Centrifuge HERMLE Z216 MK）。血清样本在冰上保存，以便在同一天测量生理生化参数。

**2.5. 血液样本分析**

使用自动血液分析仪（Biogen-5500，半自动化学分析仪）测量血清参数，如总蛋白、甘油三酯、血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶（SGPT）和尿素。对于血液学研究，从每条鱼的尾部静脉中抽取200微升血液。整个抽血过程每条鱼用时不到1分钟，以防止血液凝固。收集的血液转移到含有40微升抗凝剂（乙二胺四乙酸，EDTA，20 mM）的灭菌Eppendorf管中。如果在取样过程中遇到困难或在实验室检查时发现血块，则丢弃血液样本。使用自动血液分析仪（Mythic 18，血液学分析仪）测量血液参数，如红细胞计数、白细胞、血红蛋白浓度、红细胞比容值、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板。使用葡萄糖测量仪（Wister葡萄糖计）测量血糖水平（毫克/分升）。

**2.6. 组织形态学研究**

从收集血液的同条鱼中收集肠道和卵巢组织。收集后立即将这些组织样本固定在Bouin液中24小时，然后在4摄氏度下储存于70%酒精中直至分析。按照标准协议，使用逐渐增加的酒精浓度对固定组织进行脱水处理。随后，将组织包埋在蜡中，切片厚度为5微米，并用二甲苯去除蜡。之后，用苏木精和伊红对切片进行染色。用光学显微镜（HumaScope ClassicLED）观察切片，并用AmScope（型号：MU 1003）拍照。

**2.7. 统计分析**

使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）分析生长参数数据，随后进行Tukey-HSD事后检验。所有数据以平均值±标准差（SD）表示。采用双因素方差分析（Two-way MANOVA）并进行Tukey-HSD事后检验，以确定测试的生化参数、卵巢和肠道参数之间的统计差异。进行主成分分析（PCA）和判别分析，以评估温度应力对测量参数的总体影响。使用前三主成分的标准化分数生成双坐标图，这些主成分解释了最大的方差。处理组之间的差异在P < 0.05时被认为是显著的。

**3. 结果**

**3.1. 生长表现和个体适应性**

在28摄氏度下暴露35天后，喂食添加了螺旋藻（SP）2%和黑孜然籽（BC）0.75%、SP 1%和BC 1%的饲料的鱼，其最终体重（FBW）、体重增加（WG）和特定生长率（SGR）显著高于喂食对照饲料的鱼（P < 0.05）。喂食对照饲料的鱼的饲料转化率值显著高于其他添加组（P < 0.05）；然而，喂食SP 2%添加饲料的鱼的饲料转化率最低（FCR）。特别是内脏体指数（VSI）和肝体指数（HSI），喂食SP 2%和BC 0.75%添加饲料的鱼显著高于对照组，其中喂食BC 0.75%的鱼显示出最高的HSI值（表2）。相反，在34摄氏度下暴露15天后，喂食SP 2%然后是SP 1%、BC 0.75%和BC 1%添加饲料的鱼，其最终体重、体重增加和体重增加百分比显著高于对照饲料（P < 0.05）。BC 0.75%和BC 1%饲料的特定生长率（%天?1）相似，但显著高于SP 1%；SP 2%的特定生长率最高。特别是VSI和HSI，喂食BC 0.75%添加饲料的鱼显著高于对照组，其中喂食SP 2%的鱼显示出最高的生殖腺体指数（GSI）。总体而言，喂食SP和BC添加饲料的鱼的生长表现和饲料利用率显著优于对照组（P < 0.05）。

**表2. 不同饲料补充剂下尼罗罗非鱼的生长指标（平均值±标准差）**

| 温度 | 处理组 | 控制组 | SP 1% | SP 2% | BC 0.75% | BC 1% |
|------|------------|-----------|-----------|-----------|-----------|
| 初始体重（克） | 57.34 ± 10.38a | 58.46 ± 6.62a | 57.57 ± 7.74a | 60.88 ± 9.32a | 59.88 ± 7.45a |
| 最终体重（克） | 74.44 ± 5.98a | 83.63 ± 5.06b | 91.72 ± 8.16c | 82.90 ± 9.84b | 90.30 ± 7.35bc |
| 28摄氏度 | | 74.44 ± 5.98a | 83.63 ± 5.06b | 91.72 ± 8.16c | 90.30 ± 7.35bc |
| 34摄氏度 | 89.21 ± 13.90a | 96.40 ± 9.77ab | 97.74 ± 7.88b | 97.38 ± 7.16b | 95.58 ± 5.99b |
| 体重增加（克） | 19.85 ± 2.40a | 25.22 ± 3.08ab | 34.15 ± 8.43c | 22.02 ± 2.64a | 30.41 ± 9.76b |
| 34摄氏度 | 34.61 ± 6.55a | 37.94 ± 8.27b | 40.17 ± 8.5bc | 36.51 ± 9.96ab | 35.71 ± 6.96b |
| 体重增加百分比（%） | 36.84 ± 6.64a | 43.96 ± 8.89bc | 61.77 ± 5.42c | 36.87 ± 6.90a | 52.56 ± 13.54b |
| 34摄氏度 | 63.27 ± 12.33a | 65.85 ± 15.32ab | 73.67 ± 13.76b | 62.61 ± 14.87a | 61.00 ± 12.43a |
| SGR（%/天） | 0.54 ± 0.08a | 0.63 ± 0.11ab | 0.88 ± 0.13c | 0.54 ± 0.09a | 0.72 ± 0.12b |
| 34摄氏度 | 0.54 ± 0.12a | 0.55 ± 0.12a | 0.58 ± 0.11ab | 0.63 ± 0.10b | 0.63 ± 0.10b |
| FCR | 0.64 ± 0.07d | 0.50 ± 0.06bc | 0.41 ± 0.18a | 0.57 ± 0.07cd | 0.45 ± 0.17b |
| 34摄氏度 | 0.62 ± 0.12b | 0.64 ± 0.13b | 0.58 ± 0.10a | 0.56 ± 0.10a | 0.57 ± 0.08ab |
| VSI | 3.14 ± 0.60a | 3.43 ± 0.56a | 3.76 ± 0.92a | 3.64 ± 0.60a | 3.74 ± 0.93a |
| 34摄氏度 | 2.89 ± 2.06a | 2.82 ± 0.79a | 3.12 ± 0.54b | 3.33 ± 0.57c | 3.29 ± 0.59c |
| HSI | 1.22 ± 0.19a | 1.17 ± 0.53a | 1.39 ± 0.50a | 2.15 ± 0.74b | 1.50 ± 0.34a |
| 34摄氏度 | 0.76 ± 0.39a | 0.88 ± 0.29a | 0.79 ± 0.36a | 1.05 ± 0.29b | 0.78 ± 0.26a |
| GSI | 1.30 ± 0.10b | 1.30 ± 0.10b | 1.30 ± 0.20c | 1.80 ± 0.30c | 2.10 ± 0.20c |
| 34摄氏度 | 0.30 ± 0.10a | 1.20 ± 0.30b | 1.30 ± 0.20b | 0.50 ± 0.30a | 0.50 ± 0.20aa |

**注：** 同一行中带有不同上标的值具有显著差异（p ≤ 0.05）。

**3.2. 血清生化参数的变化**

在28摄氏度下，喂食SP 1%添加饲料的鱼表现出显著较低的甘油三酯水平（P < 0.05）。然而，在极端高温暴露15天后，各饲料组之间没有显著差异，尽管喂食BC 0.75%添加饲料的鱼倾向于表现出较高的甘油三酯水平。总体而言，与在28摄氏度下维持相同饲料的鱼相比，所有处理组的甘油三酯含量在极端高温暴露后均下降（图2 A）。在无压力期间（28摄氏度），喂食对照、SP 1%和SP 2%添加饲料的鱼的尿素含量显著低于喂食BC 0.75%和BC 1%饲料的鱼（P < 0.05）。然而，在极端高温暴露15天后（34摄氏度），所有饲料组的鱼的尿素水平显著下降（图2 B）。在28摄氏度下（无压力）时，喂食所有测试饲料的鱼的血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶（SGPT）没有饲料影响。然而，在高温暴露结束时，喂食SP 1%、SP 2%和BC 0.75%添加饲料的鱼的SGPT含量显著降低（图2 C）。喂食SP 1%和对照饲料的鱼的总蛋白（TP）水平显著降低（P < 0.05），而喂食SP 2%、BC 0.75%和BC 1%添加饲料的鱼的TP水平显著升高（P < 0.05）。在极端高温暴露15天后，喂食SP 1%、SP 2%、BC 0.75%和BC 1%饲料的鱼的TP水平显著升高（图2 D）。甘油三酯、尿素、SGPT和总蛋白显示出显著变化（P < 0.05），并且明显受到压力持续时间和暴露温度的影响（表3）。

**图2. 在28摄氏度下喂食测试饲料35天的尼罗罗非鱼（无压力）和在34摄氏度下极端高温暴露15天后的血清生化参数。A. 甘油三酯（毫克/分升）；B. 尿素（毫克/分升）；C. SGPT（U/L）；D. 总蛋白（克/升）。数值以三次重复的平均值（平均值±标准差，n = 6）表示。每个取样日，不同字母的条形表示测试饲料之间的统计显著差异（P < 0.05）。**

**表3. 在不同温度和饲料条件下饲养的尼罗罗非鱼测量参数的双因素方差分析（Two-way MANOVA）结果。概率值（p）< 0.05被认为是显著的。**

| 温度 | 处理组 | 饲料 | 温度 | DF | DF（误差） | F统计量 | p值 | Π2（部分） | DF | DF（误差） | F统计量 | p值 | Π2（部分） |
|------|------------|-----------|-----------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|
| 血液学参数 | | | | | | | | | | | |
| WBC | 150 | 136 | 55.52 | 0.000 | 0.965 | 450 | 232 | 5.000 | 0.949 | 450 | 270 | 0.881 | 0.956 |
| RBC | 150 | 286 | 60.09 | 0.097 | 0.054 | 450 | 0.719 | 0.054 | 450 | 2.319 | 0.070 | 0.157 |
| HGB | 150 | 242 | 10.12 | 0.046 | 450 | 1.790 | 0.054 | 450 | 2.319 | 0.070 | 0.157 |
| HCT | 150 | 79 | 40.00 | 0.007 | 0.138 | 450 | 0.001 | 0.299 | 450 | 0.004 | 0.262 |
| MCH | 150 | 32 | 0.078 | 0.061 | 450 | 1.997 | 0.109 | 0.004 | 0.249 |
| MCHC | 150 | 73 | 80.00 | 0.000 | 0.596 | 450 | 0.000 | 0.802 | 450 | 0.004 | 0.249 |
| RDWC | 150 | 23.9 | 0.000 | 0.323 | 450 | 41.49 | 0.000 | 0.769 | 450 | 62.30 | 0.000 | 0.833 |
| RDWS | 150 | 78.9 | 50.00 | 0.000 | 0.612 | 450 | 46.72 | 20.000 | 0.789 | 450 | 12.155 | 0.000 | 0.493 |
| PLT | 150 | 0.11 | 10.74 | 0.002 | 450 | 6.74 | 10.000 | 0.350 | 450 | 16.32 | 0.000 | 0.566 |
| 卵母细胞直径 | 150 | 10.96 | 0.002 | 0.180 | 450 | 10.87 | 0.000 | 0.465 | 450 | 21.86 | 0.000 | 0.636 |
| 细胞核周围阶段 | 150 | 24.52 | 10.000 | 0.329 | 450 | 4.417 | 0.000 | 0.261 | 450 | 18.09 | 0.000 | 0.591 |
| 早期阶段 | 150 | 4.55 | 0.038 | 0.083 | 450 | 51.03 | 0.000 | 0.803 | 450 | 25.55 | 0.000 | 0.672 |
| 成熟阶段 | 150 | 36.88 | 0.000 | 0.425 | 450 | 9.10 | 0.000 | 0.421 | 450 | 55.82 | 0.000 | 0.817 |
| 血清代谢物 | 150 | 150 | 128 | 0.000 | 0.750 | 450 | 25.019 | 0.000 | 0.667 | 450 | 8.756 |
| 甘油三酯 | 150 | 460 | 121 | 0.000 | 0.902 | 450 | 78.79 | 0.000 | 0.387 | 450 | 1.642 | 0.178 |
| 尿素 | 150 | 305 | 86.72 | 0.000 | 0.984 | 450 | 15.21 | 10.000 | 0.549 | 450 | 3.977 |
| SGPT | 150 | 127 | 10.000 | 0.718 | 450 | 145 | 20.000 | 0.921 | 450 | 84.085 |
| 卵母细胞成熟度 | 150 | 150 | 0.79 | 0.016 | 450 | 10.53 | 0.000 | 0.457 | 450 | 10.241 |
| 早期阶段 | 150 | 10.69 | 0.002 | 0.176 | 450 | 9.609 | 0.000 | 0.435 | 450 | 3.164 |
| 细胞核周围阶段 | 150 | 52.16 | 0.000 | 0.511 | 450 | 1.49 | 0.219 | 0.106 | 450 | 22.55 | 0.000 | 0.643 |
| 细胞核染色质 | 150 | 1.17 | 0.284 | 0.023 | 450 | 7.86 | 0.000 | 0.386 | 450 | 22.837 |
| 肠道形态 | 150 | 180 | 57.70 | 0.000 | 0.419 | 480 | 28.148 | 0.000 | 0.585 | 480 | 7.236 |
| VA | 180 | 51.35 | 0.000 | 0.391 | 480 | 15.58 | 0.000 | 0.438 | 480 | 14.869 | 0.000 | 0.426 |
| CD | 180 | 201 | 267.29 | 0.000 | 0.770 | 480 | 16.60 | 10.000 | 0.454 | 480 | 3.118 |
| GC | 180 | 25.89 | 0.000 | 0.245 | 480 | 28.59 | 0.000 | 0.588 | 480 | 20.346 |
| MANOVA结果（Wilks' lambda, λ） | 183 | 372 | 72.865 | 0.000 | 0.997 | 213 | 23.2 | 123.4 | 72.1 | 29.7 | 20.0 | 0.939 |

**3.3. 血液学参数的变化**

**3.1. 红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞比容（HCT）**

在热应激开始前一天，红细胞（RBC）计数不受任何测试饲料的影响。然而，在极端热应激的第15天，喂食SP 1%添加饲料的鱼的RBC水平显著高于喂食对照饲料的鱼（图3 A）。对于白细胞（WBC）计数，在28摄氏度下热应激前的值，喂食BC 1%饲料的鱼显著低于喂食对照饲料的鱼。相比之下，在34摄氏度下热应激的第15天，喂食BC 0.75%和BC 1%饲料的鱼的WBC计数显著高于喂食对照、SP 1%和SP 2%饲料的鱼（图3 B）。在无压力喂食期间，红细胞比容（HCT）水平没有显著的饲料效应。然而，在热应激后，喂食SP 2%、BC 0.75%和BC 1%饲料的鱼的HCT升高（图3 C）。关于血红蛋白浓度（HGB），在热应激前，喂食SP 2%、BC 0.75%和BC 1%饲料的鱼的值最初较高。在极端热应激的第15天，喂食SP 1%饲料的鱼的HGB水平显著高于喂食对照饲料的鱼（图3 D）。所有四个参数都显著受到饲料、温度暴露以及它们之间相互作用的影响（表3）。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）在28°C条件下喂食测试饮食35天（无压力）以及在34°C极端高温环境下暴露15天后的血液学参数（有压力）。A. 红细胞（数量/mm3）；B. 白细胞（数量/mm3）；C. 血细胞比容（%）；D. 血红蛋白（g/dL）。数值以三次重复实验的平均值±标准差表示（n = 6）。在每个采样日，不同字母标记的条形图表示测试饮食之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。

3.3.2. MCV、MCH和MCHC的变化
在无压力喂养试验期间，喂食SP 2%饮食的鱼的红细胞平均体积（MCV）较高，但这种差异没有统计学意义。然而，在暴露于极端高温后，喂食对照饮食的鱼的MCV低于喂食其他四种补充饮食的鱼（图4 A）。喂食35天后，任何测试饮食对平均红细胞血红蛋白（MCH）均无显著影响。尽管如此，喂食SP 2%饮食的鱼的MCH显著高于其他处理组（图4 B）。对于平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC），喂食SP 1%饮食的鱼的值显著高于其他饮食组（图4 C）。MCV、MCH和MCHC的值受到饮食和温度的显著影响（表3）。

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图4. 尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）在28°C条件下喂食测试饮食35天（无压力）以及在34°C极端高温环境下暴露15天后的血液学参数。A. MCV（fL）；B. MCH（pg）；C. MCHC（g/dL）。数值以三次重复实验的平均值±标准差表示（n = 6）。在每个采样日，不同字母标记的条形图表示测试饮食之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。

3.3.3. RDWC、RDWS和PLT的变化
在无压力喂养试验结束时，喂食含有BC 0.75%和1%补充剂的饮食的鱼的红细胞分布宽度-变异系数（RDWC）显著高于喂食对照和其他两种饮食的鱼（P < 0.05）。相比之下，在热应激试验结束时，喂食SP 1%和2%饮食的鱼的RDW-CV显著高于其他三种测试饮食（图5 A）。对于红细胞分布宽度-标准差（RDW-SD），在无压力喂养试验结束时，喂食所有四种补充剂的饮食的鱼的值显著高于喂食对照饮食的鱼（P < 0.05）。然而，在暴露于极端高温后，喂食SP 2%饮食的鱼的RDW-SD显著高于其他四种处理组（图5 B）。关于血小板计数（PLT），喂食所有四种补充剂的饮食的鱼的值显著高于对照组（图5 C）。RDWC、RDWS和PLT的值受到饮食处理、温度条件及其交互作用的显著影响（表3）。

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图5. 尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）在28°C条件下喂食测试饮食35天（无压力）以及在34°C极端高温环境下暴露15天后的血液学参数。A. RDWC（%）；B. RDWS（fL）；C. PLT（数量/mm3）。数值以三次重复实验的平均值±标准差表示（n = 6）。在每个采样日，不同字母标记的条形图表示测试饮食之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。

3.4. 组织形态学变化
3.4.1. 肠道组织形态学的变化
在35天的喂养试验后，接着是15天的34°C极端高温暴露期间，观察到了许多组织学指标的变化，如绒毛长度（VL）、绒毛宽度（VW）、绒毛面积（VA）、壁厚度（TW）、黏膜皱褶（MF）、隐窝深度（CD）和杯状细胞（GC）的数量（图6，图7）。在28°C条件下喂养35天期间，喂食螺旋藻和黑孜然籽补充剂的鱼的VL和VA显著较高（P < 0.05）。然而，在喂食BC 0.75%补充剂的鱼中，该值显著更高（图8A和B）。在28°C喂养试验期间，CD值未受到任何测试饮食的影响。值得注意的是，在极端高温暴露结束时，喂食所有测试饮食的鱼的CD值显著增加（图8 C）。相比之下，在35天喂养结束时，喂食四种测试饮食的鱼的TW值显著高于对照组。在35天喂养结束时，喂食BC和SP补充剂的鱼的MF和GC值显著高于其他处理组（图8E和F）。肠道形态受到饮食和温度及其交互作用的显著影响（表3）。

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图6. 在28°C温度下，喂食螺旋藻和黑孜然籽补充剂的尼罗罗非鱼肠道的组织形态学变化。（a）对照组（C），（b）SP 1%，（c）SP 2%，（d）BC 0.75%，（e）BC 1%。（CD）隐窝深度。

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图7. 在34°C温度下，喂食螺旋藻和黑孜然籽补充剂的尼罗罗非鱼肠道的组织形态学变化。（a）对照组（C），（b）SP 1%，（c）SP 2%，（d）BC 0.75%，（e）BC 1%。（CD）隐窝深度；（GBs）杯状细胞；（TW）壁厚度；（VA）绒毛面积（VL）绒毛长度；（VW）绒毛宽度；（MF）黏膜皱褶。

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图8. 尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）在28°C条件下喂食不同饮食35天（无压力）以及在34°C极端高温环境下暴露15天（有压力）后的肠道形态。A. VL；B. VA；C. CD；D. TW；E. MF；F. GC。数值以三次重复实验的平均值±标准差表示（n = 6）。在每个采样日，不同字母标记的条形图表示测试饮食之间存在统计学上的显著差异（P < 0.05）。

3.5. 卵巢的组织形态学变化
卵巢发育根据生理、形态和组织学标准分为不同的发育阶段。成熟阶段根据Matsuyama和Matsuyama（1982年）、Shinkafi等人（2011年）以及Das等人（2023年）描述的关键特征进行划分。本卵巢组织形态学研究中发现的阶段包括染色质核阶段（CN）、核周阶段（PN）、未成熟阶段（PM）和成熟阶段（M）（图9）。

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图9. 在不同温度（34°C和28°C）下，喂食螺旋藻和黑孜然籽的尼罗罗非鱼卵巢的组织形态学变化。（A）28°C对照组；（B）SP 1%；（C）SP 2%；（D）BC 0.75%；（E）28°C下的BC 1%；（F）34°C对照组；（G）SP 1%；（H）SP 2%；（I）34°C下的BC 0.75%；（J）34°C下的BC 1%：显示卵巢的成熟（M）、未成熟（PM）、核周（PN）和染色质核（CN）阶段。

3.5.1. 卵母细胞发育阶段的百分比（%）
在35天的喂养试验结束时，喂食BC和SP补充剂的鱼的CN频率百分比低于喂食对照饮食的鱼，尽管这些差异并不总是具有统计学意义。在15天的极端高温暴露结束时，喂食BC 0.75%、1%和SP 1%的鱼的CN频率显著高于喂食对照饮食的鱼（图10 A）。在28°C喂养35天结束时，喂食SP 1%补充剂的鱼的PN频率显著较高（P < 0.05）。在15天的极端高温暴露结束时，喂食BC 0.75%和SP 2%补充剂的鱼的PN频率显著较高（图10 B）。在28°C喂养35天结束时，喂食BC 0.75%和SP 1%补充剂的鱼的PM频率显著较高（图10 C）。卵巢发育的PM和M阶段受到饮食、温度暴露及其交互作用的显著影响（表3）。

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图10. 在28°C条件下喂食不同饮食35天（无压力）以及在34°C极端高温环境下暴露15天（有压力）后的尼罗罗非鱼卵母细胞发育。A. 染色质核（CN）；B. 核周（PN）；C. 未成熟（PM）；D. 成熟（M）。数值以三次重复实验的平均值±标准差表示（n = 6）。在每个采样日，不同字母标记的条形图表示测试饮食之间存在统计学上的显著差异（P < 0.05）。

3.5.2. 卵母细胞发育阶段的直径
在28°C喂养35天结束时，喂食BC 1%补充剂的鱼的CN阶段直径显著较低（P < 0.05），其次是SP 1%和BC 0.75%。而在34°C极端高温暴露15天结束时，喂食螺旋藻和黑孜然籽补充剂的鱼的CN阶段直径显著增加（P < 0.05），其中SP 1%补充剂的鱼具有最高的CN阶段直径（图11 A）。在28°C暴露期间，喂食对照饮食的鱼的PN阶段直径显著较低（P < 0.05）。在BC 0.75%、BC 1%、SP 1%和SP 2%补充剂的鱼中，PN阶段直径显著增加，其中SP 1%补充剂的鱼具有最高的PN阶段直径（图11 B）。在34°C暴露15天后，喂食BC 0.75%和SP 2%补充剂的鱼的PN阶段直径显著增加，其中BC 0.75%补充剂的鱼具有最高的PN阶段直径（图11 B）。在28°C喂养35天结束时，PM阶段直径受到饮食、温度暴露及其交互作用的显著影响（表3）。

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图11. 在28°C条件下喂食不同饮食35天（无压力）以及在34°C极端高温环境下暴露15天后的尼罗罗非鱼卵母细胞直径。A. 染色质核（CN）；B. 核周（PN）；C. 未成熟（PM）；D. 成熟（M）。数值以三次重复实验的平均值±标准差表示（n = 6）。在每个采样日，不同字母标记的条形图表示测试饮食之间存在统计学上的显著差异（P < 0.05）。

3.5.3. 卵巢组织形态的畸形
本研究中观察到的尼罗罗非鱼卵巢的组织形态学变化表明，高温（34°C）导致卵巢发生改变，出现形状不规则、空泡化以及成熟卵母细胞数量减少等畸形（图12）。

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图12. 高温（34°C）下暴露的尼罗罗非鱼卵巢的畸形。（A）、（C）卵母细胞形状不规则；（B）成熟卵母细胞减少，空泡化。

3.6.测量参数之间的相关性及判别分析（DCA）结果

在白细胞（WBC）、红细胞（M）、血细胞比容（HCT）、总蛋白（TP）、甘油三酯、血浆蛋白（PN）、红细胞分布宽度（RDWS）和尿素（图13）之间观察到了强烈且正的相关性。判别分析（DCA）的生物图显示了实验组之间的清晰分离和分组（图14）。前两个典型函数（函数1和函数2）解释了每个饮食组90%的变异性和分类（分离）正确性（图14）。

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图13. 在35天喂养试验后，尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）在测试饮食下以及随后15天34°C极端高温暴露期间的测量参数之间的相关性。

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图14. 典型判别函数（DCA）：各组的百分比值代表分类的正确性。DCA表示在28°C饲养后，随后在34°C下，食用测试饮食的鱼类的生化参数的贡献。

4. 讨论

鱼类与其环境紧密互动，这使得它们对极端气候条件非常敏感。极端温度事件显著影响鱼类的生理、代谢、生长和整体生产力（Islam等人，2020a，Islam等人，2024b，Islam等人，2021a）。这些气候事件增加了寻找缓解措施的需求，以确保全球水产养殖的可持续性。因此，研究人员致力于开发新的饲料，以帮助鱼类克服由于快速温度变化而产生的生理压力（Islam等人，2021b；D'Abramo & Slater，2019）。本研究的结果强调了含有螺旋藻和黑孜然籽的膳食补充剂在极端升温事件期间增强鱼类生理和表现的有效性。

研究发现，食用含有螺旋藻和黑孜然籽的膳食补充剂的鱼类生长表现得到提升。与观察到的血液生理状态的改善一致，食用含有螺旋藻和黑孜然籽的饮食的鱼类与对照组相比，表现出显著增强的生长和体况表现。这些改善可能归因于补充剂的抗氧化和抗菌特性（Yilmaz等人，2012），这些特性促进了肠道健康并提高了消化效率和营养吸收（Ayd?n，2021；Bekta?等人，2018；Islam等人，2024a，Islam等人，2024b）。有趣的是，在34°C下的最终体重比在28°C下的鱼类更高。这一观察结果可以由尼罗罗非鱼这种温水鱼类的温度依赖性代谢反应来解释。随着温度在其耐受范围内升高，鱼类的代谢率、食欲和饲料摄入量都会增加。在短期34°C暴露期间，对照组鱼类可能经历了暂时的代谢刺激，导致饲料消耗量增加和体重略有增加。然而，这种明显的生长优势并未伴随着饲料效率或生理稳定性的提高，这从较高的饲料转化率（FCR）值、恶化的血液学和生化指标以及严重的卵巢畸形中可以看出。血清蛋白水平在调节代谢和运输外源性和内源性代谢物方面起着关键作用。在本研究中，发现含有螺旋藻的膳食补充剂能够提高血清总蛋白水平，其中含有2%螺旋藻、0.75%黑孜然籽和1%黑孜然籽的组别观察到了略高的值。这种效应可能归因于螺旋藻和黑孜然籽的抗氧化特性，这些特性有助于增强尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的免疫能力和整体健康（Abu-Elala等人，2016；Bermejo等人，2008）。与这些发现一致，Akbary等人（2018）和Simanjuntak等人（2018）的研究表明，不同浓度的Ulva rigida和Spirulina platensis的甲醇提取物改善了平头鲻鱼（Mugil cephalus）和巨型罗非鱼（Osphronemus gouramy）的血清总蛋白和生化反应。同样，将S. platensis及其提取物添加到尼罗罗非鱼（O. niloticus）和鲟鱼（Huso huso）的饮食中也被证明可以提高血清总蛋白和球蛋白水平（Yeganeh & Adel，2019；Zeinab等人，2015）。在热应激下，鱼类的血清甘油三酯水平往往会下降，这可能是由于身体在热应激期间将甘油三酯作为能量来源（Islam等人，2020a，Ming等人，2012）。在本研究中，接受对照饮食的鱼类在极端高温暴露下表现出升高的甘油三酯水平，这可能是由于它们激活用于糖异生和糖酵解的脂解途径的能力降低（Islam等人，2020a，Islam等人，2020b）。有趣的是，在食用含有1%和2%螺旋藻以及1%黑孜然籽的饮食的鱼类中，甘油三酯水平最低，这表明这些补充剂在极端温暖压力下能够提供额外的能量。螺旋藻补充剂还被证明可以降低幼年鲟鱼（H. huso）（Adel等人，2016）和珊瑚鳟鱼（Yu等人，2018）的甘油三酯水平。同样，黑孜然籽补充剂也降低了普通鲤鱼（Cyprinus carpio）的甘油三酯水平（Ayd?n，2021；Yousefi等人，2021）。

尿素是动物体内的含氮代谢物，作为一种减少氮毒性的机制。血液尿素浓度的变化可能是评估肾单位功能的一个良好指标（Perrault等人，2017）。在本研究中，极端高温暴露后，血清尿素含量增加。这可能是由于温暖的热应激对肾单位造成的损伤（Dawood等人，2022）。相反，食用螺旋藻膳食补充剂的鱼类在极端高温暴露下的尿素水平降低。这种效应可能与螺旋藻的抗氧化特性有关，这些特性有助于调节肝脏和肾脏功能，减轻热应激的损害（Abdel-Daim等人，2020）。黑孜然籽的肝脏保护活性和强大的抗氧化效果也可能解释了黑孜然籽补充剂组血清尿素水平的降低，因为这些因素有助于调节肝脏酶（Mahboub等人，2022）。血清谷氨酸丙酮酸转氨酶（SGPT）是评估应激下鱼类肝脏损伤的可靠生物标志物（Coppo等人，2016）。在极端高温暴露后，食用对照饮食的鱼类观察到的SGPT水平升高可能是由于通过转氨作用增加氨基酸的动员以产生能量（Enes等人，2006；Kumar等人，2009）。当肝细胞受损时，转氨酶会泄漏到血液中，导致SGPT活性升高（Chatterjee等人，2010）。相比之下，食用含有1%螺旋藻和0.75%黑孜然籽的饮食的鱼类SGPT水平显著降低，其中含有2%螺旋藻的组别水平最低。这表明螺旋藻和黑孜然籽中的生物活性化合物提供了肝脏保护（Hassaan等人，2021；Tiwari等人，2019）。

在鱼类中，白细胞（WBCs）在细胞免疫和抵抗传染病方面起着重要作用（Whyte，2007）。据推测，急性热应激会影响免疫系统功能，这解释了应激早期WBCs的增加，随后略有下降（Bao等人，2018）。Huang等人（2016）也报告了类似的结果，他们发现Prenant（Schizothorax prenati）在热应激后非特异性免疫能力下降。这解释了我们实验中观察到的WBC水平降低。在本研究中，极端高温暴露显著降低了食用含有螺旋藻和黑孜然籽补充剂的鱼类的WBC水平（Khatun等人，2015）。这可能是由于测试成分中的生物活性成分激活了造血组织（Cocan等人，2018；Davis等人，2008；Tort，2011）。在本研究中，极端高温暴露期间，对照组鱼类的红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血细胞比容（HCT）水平显著低于食用测试饮食的组别，表明存在热应激。对照组RBC和HCT的减少可能是由于受损RBC的吞噬作用增加或由于热应激导致RBC收缩（Atwood等人，2003），可能与极端热条件下的造血功能受损有关（Islam等人，2020b）。相反，食用含有螺旋藻（1%和2%）和黑孜然籽（0.75%和1%）补充剂的鱼类显示出显著更高的RBC、HCT和HGB水平，表明在极端温暖暴露期间应激减轻。RBC的增加可能归因于测试补充剂中的生物活性化合物，这些化合物增强了免疫功能（Islam等人，2020b；Jeyaprabha等人，2020；Joshua & Zulperi，2020）。

在15天的极端高温暴露结束后，食用对照饮食的鱼类平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白（MCH）值显著低于补充剂组。这表明发生了红细胞巨幼症和血红蛋白血症（Burrells等人，2001；Ford，2013）。食用含有1%和2%螺旋藻或0.75%黑孜然籽的饮食的鱼类显示出更高的MCV水平，其中含有1%黑孜然籽的饮食的鱼类MCV最高。关于MCH，含有1%螺旋藻、0.75%黑孜然籽和1%黑孜然籽的饮食显示出更高的水平，其中含有2%螺旋藻的饮食的鱼类MCH最高。红细胞分布宽度（RDWS和RDWC）被认为是反映各种生理损伤的生物标志物，特别是在心血管系统中（Casillas和Smith，1977）。这些损伤可能与应激暴露引起的氧化增加有关（Su等人，2014）。在极端温暖暴露期间，食用对照饮食的鱼类比食用螺旋藻和黑孜然籽补充剂的鱼类观察到更低的RDWS和RDWC值。螺旋藻和黑孜然籽中的生物活性成分的抗氧化特性可能减少了鱼类的氧化应激，从而减少了红细胞的损伤，并帮助它们更好地应对极端热事件引起的应激（Dabeek & Marra，2019；Islam等人，2024a）。

在本研究中，食用对照饮食的鱼类在温暖应激期间测得的葡萄糖含量较高，表明它们需要额外的能量（Islam等人，2020b）。在高温应激的初始阶段，血清葡萄糖含量急剧增加。肌肉和肝脏中的葡萄糖与血清葡萄糖保持动态平衡。当鱼类受到热应激时，这些肌肉和肝脏中的葡萄糖来源被迅速动员，以维持这种动态平衡（Bao等人，2018）。相反，在温暖暴露期间，食用含有螺旋藻和黑孜然籽的饮食的鱼类观察到较低的葡萄糖水平；这表明能量利用效率较高。螺旋藻和黑孜然籽的抗氧化和保护作用归因于它们所含的活性抗氧化成分，如C-藻蓝蛋白、β-胡萝卜素、矿物质、维生素、蛋白质、碳水化合物和脂质（Abdel-khalek等人，2015）。

本研究的结果表明，向尼罗罗非鱼（O. niloticus）添加螺旋藻和黑孜然籽的膳食补充剂显著提高了它们的生长表现和饲料利用率。这些有益效果可能归因于螺旋藻和黑孜然籽的化学组成。据报道，螺旋藻含有多种功能和生物活性成分，包括维生素、矿物质、类胡萝卜素和亚油酸，使其成为最健康的食品添加剂之一（Rosas等人，2019）。黑孜然籽也富含维生素、矿物质和活性化合物，如抗氧化剂（thymoquinone和dithymoquinone）（Elkamel和Mosaad，2012）、黄酮类、甾醇、生物碱和不饱和脂肪酸，使其成为有益健康的食品（Cetin等人，2008）。Shalata等人（2021）展示了在尼罗罗非鱼（O. niloticus）饮食中添加S. platensis的膳食补充剂的有益效果及其对生长表现的改善，这与当前结果一致。SP 1%和BC 0.75%组的生长表现和饲料利用率优于对照组。

本研究证明，向尼罗罗非鱼（O. niloticus）添加螺旋藻和黑孜然籽的膳食补充剂通过增加绒毛长度、宽度、面积、隐窝深度、壁厚度、黏膜褶皱和杯状细胞数量改善了肠道形态——这些都是健康肠道功能的关键因素。食用2%螺旋藻和1%黑孜然籽的鱼类表现最佳。这些发现与Islam等人（2021a）和Jahan等人（2021）的研究结果一致，因为更好的绒毛结构可以增强营养吸收，从而改善鱼类的生长和饲料摄入量（Khojasteh, 2012; Pirarat et al., 2011）。在34°C时，对照组的绒毛面积相比28°C有所减少，而在补充了螺旋藻和黑孜然的组中则有所增加，这可能是由于螺旋藻中的保护性化合物和黑孜然种子的抗氧化作用（Hannan et al., 2021）。螺旋藻和黑孜然的补充还增加了产生黏液的杯状细胞的数量，这些黏液有助于保护胃肠道（McGuckin et al., 2011）。通过直接酶测定（例如蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶）的进一步研究将提供更多的机制见解。高温会影响新陈代谢、发育和繁殖等生理过程，通常会导致繁殖性能下降（Mahmoud et al., 2020; Shahjahan et al., 2013, 2017）。此外，高温还会引起性腺退化并降低性激素水平（Okuzawa & Gen, 2013; Pankhurst & Munday, 2011; Rahman et al., 2019）。在这项研究中，评估了不同卵细胞阶段的组织形态学参数，包括百分比频率、直径和畸形情况。在34°C时，不同卵巢阶段的频率显著低于28°C时的频率。水温度在生态范围内的变化会极大地影响卵巢的发育速度（Watanable et al., 1995）。尼罗罗非鱼（O. niloticus）的产卵量会随着水温的升高而逐渐减少（Faruk et al., 2012）。这表明我们实验中观察到的卵细胞频率的变化是由于温度差异造成的。研究还显示，与对照组相比，补充了螺旋藻和黑孜然的鱼卵巢成熟度更好。螺旋藻添加到鱼饲料中可以提高产卵成功率以及鱼苗的质量，这主要归功于其脂质含量，特别是n-6脂肪酸（Mazorra et al., 2003）。在整个实验过程中，喂食螺旋藻补充剂的鱼产卵量比喂食对照饲料的鱼更多。喂食螺旋藻和黑孜然补充剂的鱼卵巢状况的改善可能是由于其中的脂质、脂肪酸和蛋白质成分，这些成分有助于缓解温度压力。在34°C时，成熟卵细胞的直径显著小于28°C时的直径。Panda等人（2022）观察到，当水温升高到34°C时，尼罗罗非鱼（O. niloticus）的性腺会缩小，类似地，本研究中卵细胞直径的减小也可能是由于温度压力（Duponchelle et al., 2000; Vazzoler & Menezes, 1992）。在这项研究中，28°C时，喂食螺旋藻和黑孜然的鱼的成熟卵细胞直径明显大于对照组。螺旋藻的高蛋白质含量有助于卵巢发育，提高配子质量，并改善繁殖率（Spieler et al., 1977）。观察到的较大卵细胞直径可能是由于补充饲料中的蛋白质成分促进了卵细胞的更好成熟（Biabani Asrami, Sudagar, Yousefi Siahkalroodi, & Mazandarani, 2020）。本研究的组织形态学观察显示，在28°C时未经处理的雌性尼罗罗非鱼（O. niloticus）的卵巢发育正常。然而，在34°C时，观察到了卵细胞形状不规则、空泡化和成熟卵细胞减少等畸形现象，这可能是由于温度压力造成的。已知水温会影响性腺发育，高温会对卵细胞的大小和成熟产生负面影响（Hermelink et al., 2011; King et al., 2003; Miranda et al., 2013）。Panda等人（2022）也报告了在高于30°C的温度下饲养的鱼的性腺会缩小。高温可以通过下丘脑-垂体-卵巢轴的内分泌机制干扰性腺活动，正如在红鲷鱼中观察到的那样（Martínez et al., 2017; Okuzawa & Gen, 2013）。本研究中观察到的卵巢畸形可能是由于高温破坏了内分泌系统，导致激素失衡（Watanabe et al., 1995）。在34°C时，喂食螺旋藻和黑孜然补充剂的鱼的这些畸形现象有所减少。这些保护作用可能与螺旋藻（例如藻蓝蛋白、类胡萝卜素）和黑孜然（例如百里酚醌）中存在的生物活性化合物的抗氧化、抗炎和细胞保护特性有关（Ayd?n, 2021; Bekta? et al., 2018; Mahmoud et al., 2018; Mohanty & Samanta, 2018）。药用植物，如螺旋藻和黑孜然种子，在水产养殖实践中具有刺激食欲、促进生长和调节免疫系统的潜力（Y?lmaz et al., 2012; Zaki et al., 2012; Gabriel et al., 2015; Abdel-Tawwab et al., 2018）。本研究中观察到的卵巢畸形恢复可能是由于这些补充剂的抗氧化、抗炎和减压特性，它们有助于支持免疫系统。

**5. 结论**
极端温度事件会显著降低鱼类的生长性能和生理机能。研究发现，饲料中添加2%的螺旋藻和1%的黑孜然可以在一定程度上提高尼罗罗非鱼（O. niloticus）的生长、繁殖、免疫力和生理表现。由于螺旋藻和黑孜然种子的抗氧化特性，它们有助于减少热应激引起的氧化损伤，从而帮助鱼类应对温度引起的压力。黑孜然种子中的主要生物活性成分百里酚醌在缓解压力方面发挥了关键作用。此外，螺旋藻和黑孜然种子中的高脂质含量也有助于缓解卵巢成熟过程中的热应激。这项研究表明，饲料中添加螺旋藻和黑孜然可以帮助鱼类在极端温度压力下更好地生存。这些发现可以为水产养殖行业在应对全球气候变化时开发气候智能饲料提供指导。

**作者贡献声明**
Sumaiya Binte Ayesha：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、数据可视化、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
Md Jakiul Islam：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、验证、方法学、正式分析、概念化。
Most. Shammi Akter Mimi：数据可视化、正式分析。
Mst. Sabrina Akter Sheuly：数据可视化、正式分析。
Tasnia Islam Auditi：数据可视化、正式分析。
Md Kabir Hossain：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、验证、正式分析。
Kizar Ahmed Sumon：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、验证、方法学、正式分析。
Md Shahjahan：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。
Md Shah Alam：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念化。
Harunur Rashid：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证、监督、资金获取、概念化。

**数据可用性声明**
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。

**伦理声明**
所有实验程序均符合孟加拉国农业大学动物研究伦理委员会批准的欧盟指令2010/63/EU关于动物实验的规定（Mymensingh-2202, Bangladesh）。

**科学写作中关于生成式AI的声明**
在写作过程中未使用人工智能。