对肠道微生物群和转录反应的综合分析揭示了**Arma chinensis**的热耐受机制

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Integrated analysis of gut microbiota and transcriptional responses reveals thermotolerance mechanisms in Arma chinensis

　　刘殿宇|徐文彦|苏志涵|闫晓雨|陈宇|王一辰|刘晨曦
中美生物控制实验室，中国农业科学院植物保护研究所，北京海淀区圆明园西路2号，100193

**摘要**
热应激对昆虫的生理和适应能力有着深远的影响，然而捕食性昆虫的适应机制仍知之甚少。在这项研究中，我们利用综合生理学、微生物组和转录组分析方法，研究了生态上重要的捕食性天敌Arma chinensis对热应激（每天38℃或44℃持续1小时，连续五天）的反应。热应激显著增加了其体重并提高了热耐受性，表现为半数致死时间（LT??）的延长。肠道微生物群分析进一步揭示了温度引起的群落结构变化，在高温胁迫下Priestia和Longimicrobium的丰度显著升高。转录组测序鉴定出121个关键的热响应基因，包括热休克蛋白（Hsps）以及与蛋白质稳态、DNA修复和代谢重编程相关的基因。加权基因共表达网络分析（WGCNA）表明CRYAA是一个核心枢纽基因。综合分析结果显示特定微生物类群与宿主转录反应之间存在显著关联。这些发现为理解Arma chinensis在热应激下的综合适应策略提供了全面的见解，并为提高生物控制剂的热耐受性提供了潜在的分子和微生物标记。

**1. 引言**
热应激是一种常见的非生物因素，对昆虫的生理、行为和适应能力有深远影响。短期亚致死性的热暴露可诱导昆虫产生热硬化现象，从而提高其对后续极端环境的耐受性和存活率（LT50）（Gerken等，2015；Leroi等，1994）。这一过程通常涉及能量储备（如脂质和糖原）的动员和重新分配，导致体重等生理特征的改变，尽管其具体机制因物种而异（Li等，2023；Mesas和Casta?eda，2023）。此外，热应激还会抑制昆虫的摄食、繁殖能力并削弱免疫功能，最终限制其生态适应性（Ma等，2021）。
像Arma chinensis这样的捕食性天敌在农业生态系统中起着关键作用，提供对主要鳞翅目和鞘翅目害虫的不可或缺的生物控制服务（Fu等，2024；Liu等，2025）。它们的杂食性饮食、高代谢需求和独特的生命周期策略与植食性昆虫有显著差异（Cheng等，2025）。这些独特的生态和生理特征表明，捕食性昆虫可能进化出了专门的机制来应对热等环境压力，这些机制可能涉及到分子、生理和共生等多个层面。

在分子水平上，昆虫激活了由热休克蛋白（Hsps）介导的保守应激响应网络（King和MacRae，2025）。可诱导的分子伴侣蛋白（如Hsp70和Hsp90）可防止蛋白质错误折叠，协助多肽折叠并促进受损蛋白质的降解（Banfi等，2025；King和MacRae，2025；Murshid和Theriault，2018）。小热休克蛋白通过结合部分变性的蛋白质来防止其聚集并促进修复（Bakthisaran等，2015；Shih等，2021；Tsvetkova等，2002）。热应激还触发泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径，以清除严重受损的细胞成分，维持体内平衡（Bragoszewski等，2017；Willot等，2023）。此外，热应激下代谢活动的增强会增加活性氧（ROS）的产生，因此需要上调超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化酶来恢复氧化还原平衡（González-Tokman等，2025；Wu等，2020；Zhang等，2014）。对于像Arma chinensis这样的高活性捕食者来说，这种分子防御的能量成本以及在热胁迫下维持氧化还原平衡的需求可能尤为显著，可能需要独特的调控适应。

除了这些机制外，热应激还会引起转录重编程，使代谢转向戊糖磷酸途径，从而增强NADPH的供应，用于抗氧化防御（Liang等，2023）。它还促进细胞周期停滞（Falahati等，2021）并促进DNA损伤修复（McCaw等，2024），同时神经保护性信号通路（如MAPK和JNK）协调整个生物体的响应（Shi等，2025）。
值得注意的是，昆虫的共生微生物群在调节宿主热耐受性方面起着关键作用，其作用远远超出营养支持（Majeed等，2022）。肠道微生物通过合成营养物质、发酵碳水化合物和产生短链脂肪酸等代谢物来发挥作用，这些物质有助于增强肠道屏障的完整性和减轻炎症（Cai等，2024；Liu等，2024；Raza等，2020）。捕食性昆虫的肠道微生物组因富含蛋白质的饮食而与植食性昆虫不同，可能含有具有特殊功能的独特细菌类群，如增强营养供应或解毒作用（Cheng等，2025）。某些共生微生物还参与解毒和竞争性排斥病原体（Coolen等，2024）。越来越多的证据表明，肠道微生物群对昆虫的热耐受性起着至关重要的作用（Heyworth等，2020；Majeed等，2022）。

尽管取得了显著进展，但目前对昆虫热耐受性的了解仍然有限，大多数研究集中在果蝇和蜜蜂等模式物种或农业害虫上。像Arma chinensis这样的捕食性天敌却受到的关注相对较少，这使得我们对其如何将独特的生理特征与分子和微生物共生体结合以抵御热应激的理解存在明显不足。现有研究大多依赖于单组学方法，要么分析宿主的转录反应，要么描述微生物群落，缺乏能够揭示热耐受性背后协调机制的综合分析。这类全面的研究至关重要，但在捕食性天敌方面尤为缺乏。

随着气候变化导致极端高温事件的频发（Meehl和Tebaldi，2004），变温性天敌的生存和生态功能受到严重威胁（Colinet等，2015；Elmoghazy等，2025；Furlong，2017；Kingsolver等，2011）。因此，了解Arma chinensis对高温胁迫的综合适应机制对于深入了解捕食者生物学以及预测其在未来气候条件下的生物控制效果至关重要，也为保护和增强其作用提供了依据。

**2. 材料与方法**
2.1. 昆虫群体
实验用的Arma chinensis群体来自中国农业科学院植物保护研究所中美生物控制实验室长期维持的实验室群体，已连续繁殖超过70代。幼虫和成虫仅以中国栎蚕（Antheraea pernyi）的蛹为食，这些蛹从商业供应商处获取并储存在4℃下以保持新鲜。所有昆虫都在受控的环境条件下饲养：温度26±1℃，相对湿度65±5%，光照周期为16小时光照和8小时黑暗。选择健康、大小均匀且无明显异常的个体用于后续生物测定。
2.2. 热应激处理
由于雌性成虫在种群建立和田间应用中的关键作用，本研究选择了它们。从实验室群体中筛选出刚孵化出的三天大的雌性成虫，分别置于单独的饲养容器中。这些个体每天在38℃或44℃的培养箱中暴露1小时，连续五天。对照组保持在26℃。这种处理方式旨在模拟气候变化背景下日益频繁的短时热浪事件，以探究昆虫不同级别的应激反应。实验期间，相对湿度保持在65±5%，光照周期为16小时光照和8小时黑暗。
2.3. 体重变化和热耐受性评估
为了评估热应激对Arma chinensis雌虫生长的影响，在热处理后测量其体重。每个温度组共评估了140只昆虫。
为了确定热处理后的热耐受性，将接受五天热处理的昆虫先在标准饲养温度26℃下恢复12小时，然后转移到44℃的环境中。每隔30分钟记录一次死亡情况，死亡定义为完全不动的状态，直到所有个体死亡。同样在26℃下保持的对照组也被转移到44℃进行死亡评估。
2.4. 样本收集和16S rRNA扩增子测序
为了研究不同温度条件下Arma chinensis肠道微生物群的变化，由中国上海的Personalbio Biotechnology有限公司进行了16S rRNA扩增子测序，并进行了后续的生物信息学分析。从热处理组和对照组中收集肠道样本，以评估共生细菌组成的变化。
在测序前，从昆虫体内分离肠道组织。由于单只成年昆虫的肠道微生物量极低，通常低于可靠文库构建所需的最低输入量，因此将40只个体的肠道样本合并为一个生物重复样本，每种条件准备三个这样的重复样本。根据我们在标准化饲养条件下长期维持的遗传均质实验室群体，我们预计同龄成虫间的肠道微生物群差异相对较小。解剖前，将角质层浸泡在乙醇中消毒五分钟，然后用无菌超纯水冲洗两到三次。解剖在磷酸盐缓冲盐水中进行。收集的样本立即置于液氮中冷冻并储存在-80℃。

使用Tritol试剂（Invitrogen）按照制造商说明从Arma chinensis样本中提取总RNA。首先使用HiScript III 1st Strand cDNA合成 Kit进行反转录，同时去除基因组DNA（Vazyme Biotech Co。，南京）。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific，型号NC2000）测量RNA浓度，并通过1%琼脂糖凝胶电泳评估质量。这种基于RNA的方法优先针对应激暴露期间具有代谢活性的细菌群落，而基于DNA的方法也会检测到休眠或死亡的细胞。在先前的昆虫研究中已经验证了使用RNA来分析活跃的肠道微生物群的有效性，例如在Spodoptera littoralis上的研究（Chen等，2016），该方法显示RNA测序能更动态地反映微生物群对环境变化的反应。通过关注转录活跃的类群，这种方法可以更准确地评估对热应激作出反应的细菌群落（Chen等，2018；Han等，2025）。

使用通用细菌16S V3–V4引物（表S1）扩增目标区域。PCR反应使用NEB Q5高保真DNA聚合酶进行。每个25微升的反应混合物包含5微升5×反应缓冲液、5微升5×高GC缓冲液、0.25微升Q5聚合酶、2微升10 mM dNTPs、各1微升正向和反向引物（10 μM）、2微升DNA模板和8.75微升双蒸水。PCR程序包括初始98℃变性5分钟，随后是25个循环的98℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸45秒，最后在72℃下延伸5分钟。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分离，然后用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化。使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit准备测序文库。片段大小分布使用Agilent 2100 Bioanalyzer系统和High Sensitivity DNA Kit进行评估，定量使用Quant-iT PicoGreen测定。最后，在Illumina NovaSeq PE250平台上进行配对端测序。
2.5. 转录组分析
热处理后，将Arma chinensis的成虫在标准饲养温度26℃下恢复三小时再进行取样。每个生物样本包含五只个体，每个组准备三个重复样本。样本收集在15毫升离心管中，迅速置于液氮中冷冻并储存在-80℃。在同一温度下保持的昆虫作为对照组。
转录组测序和后续的生物信息学分析由中国上海的Personal Biotechnology有限公司完成。转录组测序是对整个昆虫提取的RNA进行的。通过1.5%琼脂糖凝胶上的电泳评估了RNA的完整性和潜在污染情况。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）测定RNA的浓度和纯度，并利用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）上的RNA 6000 Nano Kit进一步评估了RNA的完整性，以确保所有样本符合下游分析所需的质量标准。文库构建使用了NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit（New England Biolabs）。从至少1微克的总RNA开始，通过Oligo(dT)磁珠富集poly(A)+mRNA，然后在高温下用二价阳离子进行片段化。合成第一条链和第二条链的cDNA，并选择400至500 bp之间的片段。DNA末端腺苷化后，进行接头连接和PCR扩增，随后用AMPure XP磁珠纯化。使用Agilent 2100 Bioanalyzer和高灵敏度DNA Kit评估文库质量，并通过Quantifluor-ST系统上的PicoGreen荧光测定和StepOnePlus仪器上的定量PCR进行文库定量。将标准化后的文库稀释后，在Illumina平台上进行配对末端测序（读取长度为150 bp）。原始测序数据使用fastp v0.22.0处理以去除接头序列和低质量读段。随后使用HISAT2 v2.0将干净的读段与A. chinensis参考基因组对齐。在映射之前构建了参考索引，并以高映射精度将配对末端干净的读段与基因组对齐。

2.6. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）
使用OECloud平台（https://cloud.oebiotech.com）进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。过滤掉表达变异较小的基因，即标准差≤0.2的基因，留下7531个基因用于分析。设置软阈值功率为12来构建邻接矩阵。关键参数包括最小模块大小为30个基因、模块合并切割高度为0.25以及深度分割值为2以控制分支切割的敏感性。利用选定的功率生成了加权共表达网络，并评估了基因模块与感兴趣性状之间的相关性。基于这些相关性，使用Cytoscape v3.8.2中的CytoHubba插件可视化了基因相互作用网络，并识别了选定模块内的候选枢纽基因。

2.7. qRT-PCR验证
进行定量实时PCR（qRT-PCR）以验证从A. chinensis转录组中识别出的热休克蛋白基因的表达情况。雌性昆虫经过高温处理后迅速在液氮中冷冻以备后续分析。按照制造商的说明，使用LanEasy Total RNA Kit从每个温度处理组中提取总RNA，每个组包含五个个体。使用5×SynScript? II RT SuperMix（Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China）合成第一条链cDNA。目标基因扩增的引物是用Primer3软件（v0.4.0；http://fokker.wi.mit.edu/primer3/）设计的，其序列见表S1。定量PCR在Applied Biosystems QuantStudio 5实时PCR系统上进行。每个20 μL的反应混合物包含2 μL的cDNA模板、10 μL的1×Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen Biotechnology, Shanghai, China）、各0.4 μL的正向和反向引物以及7.2 μL的无核酸酶水。热循环条件包括：初始步骤为95°C 30秒，随后是40个循环的95°C变性3秒和60°C退火/延伸20秒。所有反应都进行了三次技术重复和四次独立生物学重复。通过熔解曲线分析检查潜在的引物二聚体形成。使用A. chinensis的GAPDH基因作为内参，并使用2^-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平（Livak和Schmittgen，2001）。

2.8. 统计分析
所有实验数据均以平均值±标准误差（SE）表示。每个实验至少进行了三次独立重复。数据分析和图表制作使用GraphPad Prism 9和Microsoft Excel。生存曲线使用log-rank（Mantel–Cox）测试进行比较。肠道微生物群数据使用Kruskal–Wallis秩和测试进行分析。数据正态性使用Shapiro–Wilk-test进行评估，方差同质性使用Levene’s test进行评估。组间比较使用非配对Student’s t-test进行。显著性水平定义如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

3. 结果
3.1. 短期热应激后A. chinensis雌性的体重增加和热耐受性增强
经过五天的短期热应激后，A. chinensis雌性的体重显著高于对照组（图1A）。一致地，44°C下的热耐受性显著提高，表现为半数致死时间（LT??）从对照组的86.25分钟分别增加到热应激组的120.00分钟和108.33分钟（图1B）。
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图1. 温度处理和生物学表现：(A) 短期热应激方案。不同颜色代表不同的温度处理：CK（26°C）、HT38（38°C）和HT44（44°C）；(B) 经过五天热处理后以及致命温度测试前的A. chinensis体重，以平均值±SEM（n=3）表示。使用非配对Student’s t-test确定统计显著性：p<0.05, p<0.01, p<0.001；(C) 44°C下经过温度处理后A. chinensis雌性的存活率和半数致死时间（LT??）。使用Log-rank（Mantel–Cox）测试分析显著性：p<0.05, p<0.01, p<0.001。

3.2. 短期热应激下A. chinensis雌性的肠道微生物群分析
高通量测序生成了共计745,994个原始16S rRNA序列。经过修剪、组装和嵌合体去除后，保留了702,934个高质量序列。随后通过FrameBot校正和去除单倍体，得到最终数据集702,274个序列（表S2）。在95%相似性阈值下，鉴定出669个操作分类单元（OTUs），涵盖15个门、26个纲、46个目、70个科、94个属和120个种（表S3）。对30个最丰富的OTUs的分类分析显示，在门水平上，大多数属于Bacillota、Pseudomonadota、Actinomycetota和Bacteroidota。在属水平上，前十名 taxa包括Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Neisseria、Veillonella、Citrobacter、Serratia、Campylobacter和Priestia（图2A）。这些细菌群可能有助于A. chinensis的热耐受机制。
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图2. 短期热应激下A. chinensis雌性的活跃肠道微生物群分析。为了克服微生物生物量的低水平，每个重复实验合并了40个个体的肠道样本（每组n=3）。从cDNA中衍生出微生物谱型以反映转录活跃的群落。(A) 前30个操作分类单元（OTUs）的系统发育树和热图。条形颜色表示门级别的分类，分支颜色代表属级别的分类；(B) 前10个细菌门的相对丰度；(C) 前20个细菌属的相对丰度；(D) 基于Bray–Curtis差异性的主坐标分析（PCoA）；(E) 基于Bray–Curtis距离的非度量多维缩放（NMDS）；(F) 热应激下差异丰富共生细菌的Venn图；(G) 显示两个高温处理组之间共享的前30个OTUs的属级别丰度的气泡图；(H) 差异丰富OTUs的MetagenomeSeq结果。x轴表示按分类顺序排列的OTUs，y轴显示-log10(调整后的P值)。圆圈大小对应相对丰度；彩色圆圈表示按门分类的显著上调OTUs，灰色环代表非显著OTUs，红色背景突出显示的10个最丰富的属；(I) 使用PICRUSt2进行的微生物群落的KEGG功能预测。
社区结构分析显示，在门级别上，16S rRNA测序鉴定出Bacillota、Actinomycetota、Pseudomonadota和Bacteroidota sebagai主要分类单元（图2B）。其中，Bacillota、Pseudomonadota和Actinomycetota在处理组和对照组中都占主导地位。热应激后，Pseudomonadota和Actinomycetota的相对丰度下降，而Bacillota在HT38组中下降但在HT44组中增加。这些变化表明温度处理影响了门级别的微生物群落组成和丰度（图2B）。在属级别，鉴定出的taxa包括Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Neisseria等（图2C）。温度也改变了这一分类等级下的微生物组成和丰度。Veillonella和Streptomyces的相对丰度在热应激后增加，而Bifidobacterium、Pantoea、Bacteroides和Rubrobacter的丰度下降。大多数属在两种温度处理下显示出不同的响应：Enterococcus、Citrobacter、Campylobacter、Desulfomicrobium、Haemophilus和Porphyromonas在HT38组中最丰富，而Neisseria、Serratia、Priestia和Longimicrobium在HT44组中占优势。这些发现表明A. chinensis的肠道微生物群在温度变化时存在显著差异（图2C）。
基于Bray–Curtis差异性的主坐标分析（PCoA）和非度量多维缩放（NMDS）用于评估组间微生物群落组成的差异。PCoA在PCo1（28.6%）和PCo2（18.7%）上清晰地分隔了对照组和热应激组（图2D）。NMDS显示对照组和热应激组有明显的聚类，应力值低于0.2，支持了排序的稳健性（图2E）。
为了识别与高温应激下A. chinensis热耐受性相关的关键共生细菌，进行了差异肠道微生物群分析。Venn图分析显示，在对照组和高温处理组之间检测到669个OTUs。其中，89个OTUs在所有组间共享。对照组（26°C）包含324个独特的OTUs，而HT38组和HT44组分别包含358个和312个独特的OTUs，突出了对照组和热应激昆虫之间显著的微生物多样性（图2F）。
分析两个热应激组之间共享的OTUs显示HT44组中Priestia的丰度显著增加（图2G）。使用MetagenomeSeq，为每个处理组鉴定出差异丰富的taxa。在HT38组中，显著改变的属包括Bifidobacterium、Arthrobacter、Latilactobacillus、Veillonella、Wolbachia、Sphingomonas、Pantoea和Haemophilus，属于Actinomycetota、Bacillota和Pseudomonadota，其中Veillonella的丰度最高。在HT44组中，差异丰富的属主要是Priestia、Lactococcus、Streptococcus、Longimicrobium、Neisseria和Pantoea，属于Bacillota、Gematimonadota和Pseudomonadota，其中Priestia的丰度最高（图2H）。
使用PICRUSt2和KEGG途径注释对共生微生物群进行了功能预测。结果显示，A. chinensis的肠道微生物群在代谢途径、蛋白质修复过程和信号转导途径中富集，这些功能可能有助于增强宿主的热耐受性（图2I）。

3.3. 短期热应激下A. chinensis雌性的转录响应
为了进一步研究A. chinensis热耐受性的分子机制，对来自高温处理组（HT38和HT44）和对照组的成年雌性个体的整个身体进行了RNA测序。每个样本产生了38,571,392到56,549,862对端干净读段（表S4）。Q30值介于95.82%到96.15%之间，GC含量介于38.4%到42.6%之间，证实了转录组数据的高质量。读段映射到参考基因组的总体比率介于70.47%到80.93%之间，证明了转录组分析的可靠性和准确性（表S4）。聚类分析（图3A）和主成分分析（PCA，图3B）进一步揭示了对照组和高温处理组之间的明显转录响应模式。
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图3. 短期热应激下A. chinensis雌性的转录响应：(A) 基因表达谱的热图；(B) 基因表达数据的主成分分析（PCA）；(C) 差异表达基因（DEGs）的火山图；(D) DEGs的Venn图；(E) 两个高温处理组之间共有的DEGs的表达水平圆形热图；(F) HT38处理组中DEGs的KEGG途径富集；(G) HT44处理组中DEGs的KEGG途径富集。图(F)和(G)中用红色突出显示的途径在两个高温处理组中普遍富集。
差异表达分析确定在38°C处理组中有248个显著差异表达的基因（DEGs），其中179个上调基因和69个下调基因。在44°C处理组中，检测到1035个DEGs，包括720个上调基因和315个下调基因（图3C）。两个高温处理组之间共有172个DEGs（图3D），其中152个一致上调，19个一致下调（图3E）。基因注释显示，在38°C下上调的差异表达基因（DEGs）主要与蛋白质稳态维持相关，包括热休克蛋白（Hsp70、Hsp90以及辅助伴侣蛋白AHSA1）、小热休克蛋白（CRYAA、CRYAB）、泛素介导的蛋白质降解途径（SHPRH、RAD18）、DNA损伤响应与修复（MDC1、Clspn、SHPRH、RAD18、CHD7）、细胞骨架组织（Rock2、unc45b）、RNA代谢和基因表达调控（Drosha、Utp6），以及参与 lipid代谢和溶酶体降解的关键代谢基因（FASN、XDH）（表S5）。在44°C的压力下，除了保守的细胞维持机制（如蛋白质稳态、基因组完整性和细胞骨架组织）外，参与解毒（例如CYP450酶）、应激激酶信号传导（MAP3K15）、代谢重编程（ELOVL、IDH2）、神经发育（DSCAM2、Slit）和视觉功能（ninaC）的基因也显著上调（表S6）。KEGG富集分析表明，HT38组表现出以内质网（ER）蛋白质处理和快速免疫炎症激活为特征的响应模式，突显了清除错误折叠蛋白质和抵御病原体的急性应激反应（图3F）。相比之下，HT44组展示了一种系统的适应策略，其特征是增强免疫反应、代谢重编程（包括能量储备利用和氨基酸代谢），以及激活与存活相关的信号通路（如PI3K-Akt），从而促进多维度的稳态恢复（图3G）。这两种处理都依赖于Th17/IL-17炎症轴和ER质量控制机制，强调了它们在热适应中的关键作用。

3.4. 对雌性A. chinensis中关键耐热相关基因的筛选
使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）来研究转录响应与环境温度之间的复杂相互作用。在构建共表达网络过程中，高度相关的基因被聚类成不同的模块，共得到18个带有颜色的模块（图4A）。为了评估表型特征（温度组和体重）与模块之间的相关性，计算了特征与模块特征基因（MEs）之间的相关系数——这些特征基因由每个模块的第一主成分表示。四个候选模块与温度和体重显著相关（*：p < 0.05，图4B）。其中，黑色模块与热应激呈正相关，而鲑鱼色、绿色和午夜蓝色模块则呈负相关。体重与鲑鱼色、绿色和午夜蓝色模块显著负相关（图4B）。黑色模块中连接性最高的枢纽基因被鉴定为Alpha-crystallin A链（CRYAA）（表S7）。

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图4. 对雌性A. chinensis中关键耐热相关基因的筛选：(A) 加权共表达网络中基因的层次聚类树状图。上部显示了基于加权相关系数得出的差异矩阵（DissTOM）的基因聚类树。下部显示了基因在各个模块中的分布，每种颜色代表一个不同的模块。通过DynamicTree Cut方法识别的模块被标出，且紧密相关的模块被合并（合并的Dynamic行），代表后续分析中使用的最终模块；(B) 模块-特征关系热图。每一行对应一个模块特征基因（ME）。第一列代表实验组（数值分别表示CK = 26，HT38 = 38，HT44 = 44），第二列代表每种处理下的体重。每个单元格显示了特征基因（ME）与特征之间的相关系数及其对应的p值（括号中）。蓝色和红色分别表示负相关性（–1）和正相关性（+1）；(C) 候选模块中基因显著性（GS）与模块成员身份（MM）的散点图。每个点代表分配给相应模块的基因；(D) 维恩图显示了WGCNA黑色模块中的基因与两个高温处理组中共上调差异表达基因（DEGs）之间的重叠；(E) 通过整合WGCNA和DEG分析识别的关键耐热基因的表达水平热图；(F) 关键耐热基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。节点的重要性按最大团中心性（MCC）排序，重要性由红色、黄色和蓝色表示。

基因显著性（GS）被计算出来以评估基因与温度处理组之间的相关性，而模块成员身份（MM）量化了基因与其相应模块之间的关联强度。对于四个候选模块，计算了GS和MM之间的皮尔逊相关系数。值得注意的是，黑色模块中的基因散点图显示出接近线性的趋势，斜率接近1，表明GS和MM之间存在强烈的正相关性（cor (GS, MM) = 0.56，p < 0.05；图4C）。这表明黑色模块中的基因与所关注的特征和模块本身之间存在高度一致的关系。相比之下，鲑鱼色、绿色和午夜蓝色模块的GS和MM之间存在显著负相关（图4C）。此外，这三个模块与体重密切相关，表明它们的基因可能在功能上与体重因热而发生的改变有关。总的来说，这些发现强调了黑色模块作为热应激稳健转录特征的可靠性。

为了进一步识别与A. chinensis耐热性相关的关键基因，我们进行了WGCNA中温度正相关黑色模块中的2898个基因与两个高温处理组共上调的152个差异表达基因（DEGs）的交集分析。该分析确定了121个上调的耐热相关基因（图4D）（表S8）。其中，23个编码热休克蛋白，包括11个Hsp20、9个Hsp70和3个Hsp90基因（表S9）。其余基因参与了维持细胞稳态的基本过程，如蛋白质折叠和修饰、细胞骨架组织以及DNA损伤修复（图4E）。这些基因可能是A. chinensis热响应分子网络的重要组成部分。使用STRING数据库，我们接下来基于这些关键耐热基因的人类同源物构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用Cytoscape识别了这个网络中的核心基因（图4F）。结果显示，热休克蛋白家族成员——Hsp20、Hsp70和Hsp90——在短期热应激适应中占据中心位置。此外，如Dnajc3、GluProRS和AHSA1等基因也被发现是对热响应的重要贡献者。

通过DEG和WGCNA分析确定为耐热性关键成员的热休克蛋白基因家族（Hsp20、Hsp70和Hsp90）使用定量实时PCR（qRT-PCR）进行了验证。尽管与转录组测序结果相比观察到了一些小差异，但整体表达模式是一致的（图5）。

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图5. 通过实时PCR和转录组FPKM值测量的雌性A. chinensis中关键耐热相关Hsp基因的表达水平。垂直轴表示来自实时PCR和RNA-seq FPKM值的log10转换表达水平。圆形条形图分为三个部分，分别代表三个代表性的Hsp基因：Hsp20、Hsp70和Hsp90。不同的处理用蓝色、橙色和红色表示。使用非配对学生t检验确定处理组和对照组之间的统计差异。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

3.5. 转录组和肠道微生物群的整合分析
进行了Spearman相关性分析，以评估从热响应网络中识别出的前10个关键耐热相关基因（包括热休克蛋白家族成员以及Dnajc3、GluProRS和AHSA1）与最丰富的20个细菌属之间的关联。结果发现Priestia和Longimicrobium的丰度与Hsp基因及其他关键热响应基因的表达水平之间存在显著正相关（图6）。这种一致的关联模式突显了肠道微生物群重塑与宿主转录重编程在热适应过程中的潜在协调。

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图6. 热应激下宿主基因与肠道细菌属之间的Spearman相关性分析。X轴代表前20个微生物属，Y轴显示关键耐热相关基因。红色表示正相关，蓝色表示负相关。星号表示统计显著性：*：p < 0.05，**：p < 0.01。

4. 讨论
4.1. 生理适应：体重增加和耐热性增强
通过结合生理学、微生物组学和转录组学的综合方法，本研究系统地阐明了雌性A. chinensis对短期热应激的适应策略。结果表明，短暂的热暴露显著增强了耐热性，并伴随着体重的增加。与许多昆虫在热应激下常见的体重减轻和发育延迟（Abdel-Hady等人，2021年；CaraDonna等人，2018年）不同，本研究发现A. chinensis在短期高温暴露后体重显著增加。这种非典型的反应可能代表了一种积极的适应策略。一个合理的解释是，A. chinensis增强了其能量储备——如脂质和糖原——以应对可能反复出现的热挑战，从而为能量密集型的细胞应激反应提供所需的底物，包括大量合成热休克蛋白（HSPs），以及维持基本的生理功能。我们的转录组数据间接支持了这一假设，显示在热应激下关键基因（如FASN、ELOVL）和代谢重编程基因（如IDH2）的上调，这可能有助于积累能量储备（如脂质）（表S5、S6）。这种潜在的代谢转变可能使昆虫为持续应激的高能量成本做好准备。这种解释与果蝇的研究结果一致，研究表明热适应可以提高能量代谢效率（Mesas和Casta?eda，2023年）。然而，作为捕食性昆虫，A. chinensis可能会表现出更明显的反应，这需要进一步研究其潜在的生理调节机制。我们认识到，未来的研究需要直接测量能量储备（如甘油三酯、糖原）以验证这一解释。尽管如此，体重同时增加和耐热性的增强强烈表明这种生理调整是适应反应的关键组成部分，而不是非特异性的病理效应。在其他暴露于短期轻微应激的昆虫中也报告了类似的有益反应（Sun等人，2022年），这表明这可能是某些昆虫类群中的保守适应策略。选择38°C和44°C作为热强化温度是基于初步的生存实验和对捕食性昆虫耐热性的现有文献（Meng等人，2022年）。这些温度被选为代表不同的应激水平：38°C引起适度的热强化而不导致高死亡率，而44°C代表接近耐受上限的严重热挑战。这种实验设计捕捉到了层次化的应激反应，与热休克蛋白研究中的既定方法一致，包括在Bombyx mori中进行的研究，这些研究描述了在不同程度热应激下Hsp基因的差异表达（Iqbal等人，2025年）。

4.2. 微生物群落动态和潜在的功能作用
本研究证实，A. chinensis的肠道微生物群落结构对温度变化非常敏感，这种现象也在其他昆虫中得到记录，如Bombyx mori（Shahila Ismail等人，2023年；Sun等人，2017年）和Diaphorina citri（Jiang等人，2021年）。为了可靠地捕捉这些群体层面的变化，我们采用了混合采样策略并结合基于RNA的测序方法，该方法优先针对应激期间的代谢活跃微生物群。我们的分析显示，在44°C压力下，A. chinensis表现出明显的响应，特别是Bacillota门中特定属的显著富集，尤其是Priestia。作为能够形成孢子的革兰氏阳性细菌，如Priestia具有内在的抗逆性（Onyango等人，2020年）。我们假设它们在热应激下的选择性富集可能为宿主提供多种保护效益。这些效益可能包括通过生理稳健性维持肠道微生态稳定，并可能通过合成营养素（如维生素、必需氨基酸）或特定代谢物（如肌苷和醋酸）来调节宿主应激信号和能量代谢（Han等人，2024年）。这些推断的功能作用与PICRUSt2预测的高温条件下的代谢途径富集一致。因此，A. chinensis肠道微生物反应的一个关键方面可能不仅在于分类群的转变，还在于具有特殊功能潜能的分类群的选择性保留或富集，特别是那些参与营养合成的分类群，从而促进有助于宿主耐热性的互利互动。这样的功能适应模型在多种生物系统对环境压力的响应中越来越受到认可（Junker等人，2025年）。值得注意的是，尽管我们的分析主要关注通过混合采样得到的群体层面的响应，并稳健地识别出了一些核心的热响应变化，例如在高温压力下Priestia和Longimicrobium的数量增加，但检测到一些通常与脊椎动物微生物组相关的低丰度属（例如Neisseria、Veillonella、Haemophilus和Streptococcus）值得进一步研究。虽然这些属不太常见，但偶尔也会在昆虫肠道中被报道。例如，Neisseria在昆虫模型中已被研究过（Girgis和Christodoulides，2023年），而在用于人类食用的黄粉虫中也发现了与Haemophilus相关的序列（Stoops等人，2016年）。在我们实验室之前的一项研究中，通过对A. chinensis及其亲缘的植食性物种Halyomorpha halys的微生物群进行表征（Cheng等人，2025年），在类似的饲养条件（包括以Antheraea pernyi蛹为基础的饮食）和测序协议下，也检测到了这些属。它们在独立实验中的一致性表明，这些低丰度分类群可能是实验室菌群微生物环境中的一个稳定背景成分，可能来源于饮食或饲养环境。重要的是，在这两项研究中，它们的相对丰度都较低，而核心的热响应变化主要集中在与脊椎动物污染无关的分类群上。因此，这项研究的主要结论是基于那些表现出明显处理特异性响应的不同丰度分类群得出的。未来的研究需要整合靶向方法，如qPCR或基于培养的分离技术，以确认这些低丰度分类群的起源和功能意义，并调查热适应微生物群在压力后的恢复过程以及基于DNA的定量分析，这对于全面理解这些动态的生态学意义至关重要。

A. chinensis对热应激的转录组响应呈现出一种明显的温度依赖性层次结构模式。需要注意的是，我们的转录组数据来自整个昆虫，虽然捕捉到了系统的整体响应，但可能会稀释来自特定组织（如肠道或脂肪体）的信号。在38℃的压力下，响应主要集中在典型的细胞防御机制上，包括HSP介导的蛋白质稳态、泛素化依赖的蛋白质降解和DNA修复——这些过程在果蝇（Gruntenko等人，2021年）和Tribolium castaneum（Xiong等人，2019年）等昆虫中高度保守。这表明，在中等程度的热应激下，A. chinensis优先采用了一种高效且经济的策略来减轻损伤并维持必要的细胞功能，这是一种在昆虫中广泛保守的分子响应（Horowitz，2016年）。相比之下，在44℃的更严重压力下，响应出现了显著扩展，表现为全系统的重组，同时仍然保持了核心的细胞防御机制。代谢重编程基因的上调表明能量来源和膜脂质组成的变化，以满足增加的能量需求并在热应激下保持膜流动性（Mallard等人，2018年；Mesas和Casta?eda，2023年）。解毒基因如CYP450s和应激激酶（包括MAP3K15）的激活反映了生物体努力减轻由热应激引起的次级氧化损伤（Shi等人，2025年；Wang等人，2021年）。特别值得注意的是，与神经发育和视觉功能相关的基因的上调。这些变化被解释为宿主自主的、系统性的适应性重组的一部分，可能是为了在严重的热胁迫下维持关键行为（如猎物定位、导航），从而将分子变化与潜在的生态适应性结果联系起来。为了超越差异表达基因的列表，识别与耐热性特征共同变化的核心基因模块，我们应用了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。这种方法通过识别基因共表达网络中与特定特征最相关的功能模块，克服了传统差异表达分析的局限性（Li等人，2025年）。一个关键发现是识别出黑色模块，它与耐热性有显著的正相关性，以及其中心基因CRYAA（α-晶体蛋白A）。作为一种小分子热休克蛋白，CRYAA不仅表达在眼部组织中，而且在昆虫中还作为一种重要的应激响应蛋白，提供强大的蛋白质聚集保护（Bakthisaran等人，2015年；Tsvetkova等人，2002年）。它作为中心基因的角色突显了其在共表达网络中的核心调节作用，强调了其对维持A. chinensis蛋白质稳态的关键贡献。这一点与其他生物体中的已知功能一致（Bakthisaran等人，2015年）。总体而言，从中等压力下的集中细胞修复到严重压力下的全面系统重组，转录策略的转变强调了A. chinensis在应对不同强度的压力时的显著可塑性和适应性，这与生物体适应环境挑战的更广泛原则一致（Horowitz，2016年；Kordas等人，2022年；Salachan和S?rensen，2022年）。WGCNA的整合进一步确定了CRYAA作为网络的核心枢纽，为未来在该生态重要捕食者中验证耐热机制提供了优先目标。此外，对关键耐热相关基因与微生物谱型之间的相关性分析显示，Priestia和Longimicrobium的丰度与宿主Hsp基因的表达之间存在显著的正相关（图6）。解读这些整合相关性时需要谨慎：它们展示了在生物体层面的统计关联，而不是直接因果关系或协同调控的证据。观察到的联系可能源于对热应激的平行、独立响应，或者可能反映了微生物-宿主之间的相互作用。例如，微生物代谢物可能提供营养或信号支持，促进宿主的能量密集型应激响应，包括Hsp合成，这种机制在其他系统中也有报道（Majeed等人，2022年）。相反，宿主经历良好调节的应激反应可能会创造一个有利于特定细菌定植的细胞内环境（Onyango等人，2020年）。虽然A. chinensis中这种相互作用的具体性质尚待确定，但相关变化识别出Priestia和Longimicrobium以及关键的宿主基因模块（如CRYAA和Hsps）作为未来机制研究的重点目标。实验方法如抗生素匮乏、无菌饲养或靶向基因干扰对于测试这些关联是否代表了这种捕食者热适应的基本、功能整合成分至关重要，正如应激生物学综合模型中所假设的那样（Cai等人，2024年；Cai等人，2024年）。

本研究提供了关于A. chinensis对热应激的整合生理、分子和微生物响应的初步见解，同时也指出了未来工作的明确方向。一个主要限制是微生物组-转录组关联的关联性，这需要通过抗生素操作、无菌饲养或靶向细菌定植等实验来验证因果关系。此外，仅关注雌性昆虫和受控的实验室条件促使未来的研究需要探讨性别特异性响应以及基于野外条件的验证，以评估其生态相关性。为解决这些空白，优先的研究方向应包括：（1）通过RNAi或CRISPR/Cas9对候选基因（包括CRYAA和关键Hsps）进行功能验证；（2）分离和功能测试关键微生物分类群（如Priestia），以评估其在耐热性中的直接作用；（3）多代研究以评估热适应性的遗传性。从应用的角度来看，识别出的分子标记和微生物目标为潜在提高耐热性提供了基础框架——而非已验证的解决方案。最终，将这些发现转化为提高A. chinensis在气候变暖条件下野外表现的可靠策略将取决于首先确定观察到的关联背后的因果机制。

通过整合多组学分析，本研究系统地阐明了雌性A. chinensis对短期热应激的响应，涵盖了生理、微生物和转录组层面。结果表明，高温暴露显著增强了体重和耐热性，同时肠道微生物群也发生了显著的结构变化。值得注意的是，Priestia和Longimicrobium等属的丰度与热休克蛋白基因的表达之间存在正相关，表明微生物动态与宿主在热应激下的转录重编程之间存在潜在联系。转录组分析进一步确定了关键通路，包括Hsp表达、蛋白质修复和代谢重编程，以及核心基因CRYAA、HSP70、HSP90和AHSA1。这些发现加深了我们对捕食性天敌整合热响应机制的理解，并为未来的研究奠定了基础。识别的微生物和遗传靶点为后续的机制研究和旨在增强A. chinensis耐热性的潜在策略提供了依据。

**作者贡献声明**
Dianyu Liu：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法论、调查、正式分析、数据管理。
Zhihan Su：调查、数据管理。
Wenyan Xu：调查、数据管理。
Xiaoyu Yan：调查、数据管理。
Yichen Wang：调查、数据管理。
Yu Chen：调查、数据管理。
Chenxi Liu：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法论、资金获取、概念构思。

**资助**
本研究得到了澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）[拨款编号2024082216]的支持。该资助机构在研究的设计、执行、解释或撰写过程中没有任何作用。