苯并三唑类紫外线吸收剂的CYP450代谢计算映射：通过UV-P技术揭示了其生物转化途径、机制及其环境影响

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Computational mapping of CYP450 metabolism for Benzotriazole UV absorbers: Biotransformation pathways, mechanisms and environmental implications demonstrated with UV-P

　　沈乐祖|顾成刚|高正源|范秀丽|杨兴伦|严东云|王尊尧|孙成|何欢|杨少贵|江欣
中国科学院土壤科学研究所土壤与可持续农业国家重点实验室，南京211135，中国

**摘要**
苯并三唑类紫外线稳定剂（BT-UVs）是一类新兴的有机污染物，以其环境中的普遍存在、生物累积性以及对人类健康的毒性影响而闻名。通过细胞色素P450的代谢生物转化是主要的解毒途径，然而BT-UVs的生物转化机制仍是一个关键的知识空白。在P450的酶核心结构（Cpd I）的催化下，利用密度泛函理论（DFT）理论模拟了环境中普遍存在的化合物2-(2′-羟基-5′-甲基苯基)-苯并三唑（UV-P）的生物转化过程。除了Cpd I的区域选择性和两态反应性外，还系统地揭示了多种生物转化途径及其背后的化学机制。总体而言，Cpd I在双重态下的反应性始终高于四重态。从2-羟基处抽取氢原子的反应具有较低的活化能（0.93–1.13 kcal·mol?1）和较高的反应速率（10?1? cm3·molec?1·s?1），而随后通过几乎无障碍的反弹反应在相邻的芳香碳上进行羟基化。芳香族亲电加成在苯环的对位和甲基/羟基取代位点的选择性低于氢原子抽取。与次级环氧化反应相比，亲电加成后的质子穿梭和反弹步骤更有利于羟基化。尽管动力学过程较慢，但在吡啶氮位点的相对有利的氧化作用为这些化合物在生物体内的硝基化产物提供了可能。尽管对多种产物的急性或慢性毒性进行了预测，但建议未来进行多层面的毒理学研究和长期体内监测。毫无疑问，对代谢生物转化的理论见解将为理解BT-UVs的转化命运和毒性复杂性提供机制框架。

**1. 引言**
苯并三唑类紫外线吸收剂（BT-UVs）是一类广泛用于个人护理产品以及工业和农业材料（如涂料、塑料、地膜、有机玻璃、电子设备、合成纤维和橡胶）中的主要光稳定剂（Nakata等人，2009；Ruan等人，2012）。自2023年以来，BT-UVs的全球生产和使用量稳步增加。如今，BT-UVs已成为占据商业市场重要份额的光稳定剂。然而，由于与宿主基质的非共价结合较弱，添加到产品中的BT-UVs容易渗出。大量实验证据表明，BT-UVs在包括地表水、沉积物、废水、室内灰尘和生物体在内的各种环境介质中具有持久性、毒性和普遍性（Kim等人，2012；Lu等人，2017；Montesdeoca-Esponda等人，2021；Nakata等人，2009；Reddy等人，2000；Wick等人，2016；Zhao等人，2024）。海洋水体中BT-UVs的总量为2419 ng·L?1（Montesdeoca-Esponda等人，2021），而2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑（UV-P）在河流沉积物中的浓度高达4300 mg·kg?1（Reddy等人，2000）。通过多种途径（包括饮食摄入、皮肤接触和吸入）的长期暴露已在人类母乳、尿液和血清中得到验证（Kim等人，2019；Lee等人，2015；Mao等人，2024），并引发了包括内分泌干扰和通过芳烃受体（AhR）介导的毒性等一系列有害效应（Kubota等人，2022）。随着AhR介导的途径中脾脏调节T细胞的分化，UV-P还可能进一步诱导免疫调节效应（Kubota等人，2022）。作为新兴的持久性有机污染物，BT-UVs引起了公众和当局的极大关注。

由于疏水性和体内活性酶的催化作用，BT-UVs容易发生生物累积。在白吸盘鱼（White Sucker）的肝组织中检测到高达1500 μg·kg?1的BT-UVs（Lu等人，2017；Nakata等人，2009）。在一项毒代动力学研究中，高达85%的UV-P以葡萄糖醛酸和硫酸盐结合物的形式存在于血液中，而在暴露后48小时内仅有37.2%的剂量通过尿液排出（Fischer等人，2025）。UV-P中的酚羟基易于被直接氧化，这在正常生理条件下可能最小化了I期氧化代谢。当斑马鱼胚胎中的II期酶（包括谷胱甘肽-S-转移酶（gstp1）和UDP-葡萄糖醛酸转移酶（ugt1a）被激活时，细胞色素P450（CYP450）的亚型CYP1A1的活性显著增强（Fent等人，2014）。这种酶的协同诱导受AhR信号通路调控，其中UV-P可作为强效配体（Nagayoshi等人，2015）。越来越多的证据表明BT-UVs易受CYP450酶的生物转化。研究表明，UV-P在人类CYP3A4酶的作用下会发生快速生物转化，并改变其抗雄激素活性，其生物转化会因可诱导的肝外异构体CYP1A1而加速（Zhuang等人，2017）。值得注意的是，BT-UVs的毒理学结果随生物转化而变化。由于新代代谢物的产生，2-(2H-苯并三唑-2-基)-4–6-二戊基苯（UV-328）的抗雄激素活性从17.12 ± 3.00%显著增强至40.73 ± 4.90%，而UV-P的抗雄激素活性则从16.08 ± 0.95%降低至6.91 ± 2.64%（Zhuang等人，2017）。特别是通过同质偶联形成的C-C二聚体代谢物表现出大约60倍的抗雌激素活性抑制效力（Cheng等人，2025）。显然，酶促生物转化在体内的毒理学表达中具有重要意义，而CYP450作为组织和器官中的重要酶超家族，在BT-UVs的氧化转化中起着关键作用（Rendic和Guengerich，2015）。尽管已经通过鉴定多种代谢物（包括主要羟基化形式）详细记录了BT-UVs的生物转化过程（Denghel等人，2019；Fischer等人，2020；Li等人，2024b），但关于生物转化机制和毒理学变化特征的知识仍不清楚。结构相似化合物的相反代谢命运（即UV-328的激活与UV-P的失活）无法仅通过P450活性位点内的分子相互作用来解释（Zhuang等人，2017）。这可能是由于未考虑化合物特异性以及在生物转化过程中中间体的高分辨率分析和实时追踪的巨大挑战。量子化学方法不仅能够解析酶结合所需的电子结构和能量，还为机制探索提供了创新范式（Shaik等人，2010）。结合化合物的电子结构、能量变化和过渡态，量子化学在表征生物转化机制方面已被证明非常有效且成本效益高（Fu等人，2016；Hermano Sampaio Dias等人，2023；Zheng等人，2024）。量子化学计算表明，UV-P通过异构分解、同质偶联和环氧化发生P450酶促生物转化，主要产物为邻苯醌和1H-苯并三唑代谢物（Cheng等人，2025）。然而，关于P450下BT-UVs生物转化机制的深入理解仍需进一步研究，特别是羟基化过程。

**2. 计算方法**
2.1. 结构模型和量子化学计算
细胞色素P450的催化活性位点是指铁血红素结构内部协调的区域。当P450的核心亚铁原卟啉Ⅸ通过电子附着、质子化和与氧的复合被化学激活时，形成的高价铁氧化物复合物（即化合物I，Cpd I）被认为是主要的催化体。本文使用的Cpd I结构模型以C4v位置的铁氧卟啉部分和轴向的-SH硫醇配体为代表，简化表示为Fe??=O2?(C??N?H??)?1(SH)?1（Meunier等人，2004；Shaik等人，2010）。值得注意的是，用硫醇替换Cpd I轴上的半胱氨酸可以简化结构模型并降低计算成本（Shaik等人，2005）。为了简化，卟啉上的甲基、乙烯基和丙酸酯等外围结合残基和取代基未被保留，但仍尽可能地再现了Cpd I的立体化学和电子性质。根据Cpd I的电子构型，卟啉环中的α或β电子在前线分子轨道A??中的自旋取向可能与反键轨道（即Fe(3dxz/3dyz)和O(2px/2py)原子之间的πxz*/πyz*）平行或反平行（de Visser和Shaik，2003；Ogliaro等人，2000）。因此，考虑了Cpd I的低自旋（LS）和高中自旋（HS）两种简并自旋态，以研究其与UV-P的不同反应性。根据过渡态理论（TST），与反应物和产物或中间体单方面连接的能量较高的过渡态对反应的发展至关重要。使用不受限制的B3LYP泛函（Becke，1993；Shaik等人，2010）对UV-P的过渡态、反应物和产物的几何优化和频率计算进行了研究。B3LYP在精确描述铁卟啉电子结构方面的适用性已在先前工作中得到多次验证（Altun等人，2014；Mirzaei等人，2021）。对于Fe使用Lanl2DZ赝势基组，其余原子（C、H、O、N、S）使用6–31 G**全电子基组（Francl等人，1982；Hehre等人，1972；Shaik等人，2005）。通过振动分析，过渡态仅具有一个虚频，而与稳态点相对应的相对能量最小值通过正频率确定。图S6中的内在反应坐标（IRC）计算验证了过渡态的真实性，理论上建立了反应物和产物之间的桥梁（Fukui，2002）。为了准确揭示反应的热力学变化，使用相同泛函方法在更高级的混合基组（Lanl2TZ(f)（Fe）/6–311?+?+G**（C、H、O、N、S）（Hay和Wadt，1985；Shaik等人，2005）进行了单点能量（SPE）计算。在此水平上进行了Mulliken电荷和自旋密度计算，以提供对反应机制的洞察。为了补偿B3LYP的能量计算误差，必须使用Grimme的经验色散（GD3BJ）进行长程色散校正（Grimme，2006；Ogliaro等人，2000）。在整个几何优化过程中采用了含氯苯溶剂（ε = 5.69）的极化连续模型（PCM）来模拟P450活性位点的疏水环境（Tomasi等人，2005）。热力学计算中的零点能量（ZPE）用于校正标准条件下的能量。基本反应的活化能（Ea）是通过计算过渡态（TS）与反应物之间的总分子能量差得到的，这些数据汇总在图S1中。吉布斯反应自由能变化（ΔG）是在考虑热校正后，产物与反应物之间的吉布斯自由能差（图S2）。所有密度泛函理论（DFT）计算都是使用Gaussian 16程序包（Frisch等人，2016年）进行的。鉴于UV-P的结构特性，Cpd I在苯基、三唑基、甲基和羟基取代位点催化反应的可能性有很多。或者，UV-P的生物转化途径I可能通过氢原子抽取（HAT）或氢原子转移（HAT）启动，其中Cpd I从脂肪族或酚基团抽取一个氢原子，生成的碳中心自由基随后会迅速与氧结合形成羟基化代谢物（Groves和McClusky，1978年；Guengerich，2001年）。途径II是通过亲电加成直接引起芳香羟基化的方法，其中Cpd I与酚环或苯并三唑杂环的π电子系统发生反应。这一过程可能导致芳烃氧化物的形成，这些氧化物可能经历质子穿梭（PS）、NIH重排和环氧化（EPO）等反应（Bathelt等人，2005年；de Visser，2006年；Jin等人，2003年）。途径III是特异性地在三唑氮上进行氧化的途径。鉴于在类似含氮杂环中N-氧化物形成的先例，这条途径表明Cpd I可以直接氧化三唑氮并促进稳定的N-氧化物衍生物的生成（Mansuy和Boucher，2002年；Rydberg等人，2008年；Seger等人，2015年）。这些生物转化途径在图1中以示意图形式展示。总体而言，这三条途径为理解P450酶催化的UV-P的代谢转化提供了坚实的框架。所有能量、电子和几何数据都包含在补充信息（SI）中。

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**图1.** Cpd I催化的UV-P的代谢途径示意图，其中R代表反应物，IM代表中间体，P代表产物。芳香碳原子根据对称性依次编号，吡咯/吡啶氮原子也分别编号。取代位点的数字标签表示不同的反应位置。

**2.2. 反应动力学计算**
表S7中的基本反应速率（kn）可以用Eyring方程（Eyring，1935年）进行理论计算，其中反应动力学与热力学之间的关系已通过绝对TST得到很好的确立。Eyring方程表示如下：
$$
kn = \Gamma_T \cdot B_T \cdot H(C^\circ)^{-n} \exp\left(-\frac{E_A}{RT}\right)
$$
其中$k_B$是玻尔兹曼常数（J·K^{-1}$），$T$是开尔文温度（K），$h$是普朗克常数（J·s），$R$是理想气体常数（J·mol^{-1}·K^{-1}$）；$\Gamma_T$表示传递系数，$n$是反应物的化学计量系数，$C^\circ$是标准摩尔浓度（M）。对于主要或次要反应途径中的级联反应，UV-P的双分子反应速率是在298 K的温度下使用KisThelP程序包（Canneaux等人，2014年）计算的。量子力学隧穿效应对反应速率有很大影响。隧穿效应的校正是通过Wigner方法（Wigner，1997年）计算传递系数来实现的。
$$
\Gamma_T = 1 + \frac{1}{2^4 \cdot (h_v \neq k_B \cdot T)}
$$
其中$v_v$是过渡态的虚频大小（表S8）。这里得到的热速率kn可以用作评估P450催化的UV-P整个生物转化过程中反应途径优势的比较依据。

**2.3. 新生代谢物的毒性评估**
通过DFT计算，鉴定出大量主要通过关键羟基化、酮化、环氧化和硝化产生的UV-P产物和中间体。鉴于其未知的毒理学风险，使用生态结构活性关系（ECOSAR）模型（ECOSAR，2024年；Reuschenbach等人，2008年）预测了这些新生产物和中间体的水生毒性。急性毒性预测以中效浓度（LC50/EC50）表示，即鱼类的96小时LC50、水蚤的48小时LC50和绿藻的96小时EC50。慢性毒性值（ChV）是使用鱼类和水蚤的急性到慢性比率10以及藻类的4来估算的，当缺乏实验慢性数据时。当对急性效应的对数Kow ≤ 5.0且对慢性效应的对数Kow ≤ 8.0时，预测结果被认为是可靠的。这些预测数据提供了与UV-P生物转化相关的潜在环境危害的筛选级评估。

**3. 结果与讨论**
**3.1. 氢原子抽取和反弹机制**
P450催化的氢原子抽取及其向底物的反弹是异生物质代谢过程中烷基单羟基化的基本机制（Olsen等人，2006年；Tyzack和Kirchmair，2019年）。这一主要代谢途径通常通过检查主要产物得到证实。具体来说，使用人肝微粒体的研究一致显示，主要的生物转化产物是单羟基化异构体（Fischer等人，2020年；Kiejza等人，2022年）。含有甲基/羟基的氢原子容易被Cpd I中的FeO抽取，而Cpd I的不同位点特异性和电子构型表现出不同的反应性。在反应坐标上从双重态（2RH-OH）到相应的过渡态（2TS1H-OH）的过程中，FeO中心逐渐接近酚羟基的氢原子，从而形成具有精确几何配位的活化复合物。∠O-H-O角度范围在166.9°到176.8°之间，表明这一酶促过程的精确选择性（图2和图S3）。值得注意的是，酚羟基氢的抽取仅需0.93 kcal·mol^{-1}的活化能即可达到过渡态2TS1H-OH（1831.9i cm^{-1}）。或者，Cpd I也可以在甲基位置启动氢原子抽取。这一途径需要更高的活化能10.01 kcal·mol^{-1}才能达到相应的过渡态2TS1H-Me（1701.3i cm^{-1}）。对于酚羟基氢的抽取，能量障碍显著降低了约9.0 kcal·mol^{-1}，这表明了明显的动力学偏好。考虑到Cpd I中的高自旋电子构型，UV-P的羟基化符合双态反应机制。在四重态（图S3）中，反应物复合物（4RH-Me/4RH-OH）通过相应的过渡态进行氢原子抽取，形成铁-羟基和底物自由基中间体（4IMH-Me/4IMH-OH）。酚羟基的抽取需要最小的活化能障碍（高自旋态下为1.13 kcal·mol^{-1}），并生成相对稳定的中间体（4IMH-OH），同时伴随着适度的放热（-6.22 kcal·mol^{-1}）。相比之下，甲基氢的抽取在四重态下的能量障碍显著较低（8.70 kcal·mol^{-1}）。从技术上讲，UV-P的羟基处的氢原子抽取应优先于甲基位置的抽取。Cpd I对酚羟基位置的极高反应性可以用较低的键解离能（BDE）来解释。酚羟基的O-H键通常具有较低的BDE，范围在85 kcal·mol^{-1}到90 kcal·mol^{-1}，而脂肪族C-H键的BDE为95–105 kcal·mol^{-1}（Mayer，2011年；Warren等人，2010年）。这种热力学优势，加上酚氧上的孤对电子与Cpd I的π*轨道系统的最佳轨道重叠，促进了高效的HAT反应，且重组能量最小（Ogliaro等人，2001年）。

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**图2.** 在LS和HS状态下，UV-P的甲基（RH-Me）和酚羟基（RH-OH）位点处启动的HAT过程中的能级和构象变化示意图。构象在UB3LYP-D3(BJ)/Lanl2DZ (Fe)/6–31 G**（其余原子）下优化，能量计算考虑了Lanl2TZ(f) (Fe)/6–311 + G**（其余原子）的ZPE。能量以kcal·mol^{-1}标记在能级上，反应物、过渡态和中间体或产物的构象通过键长（?）以黑色显示，键角（°）以红色显示，振动频率（ν）以cm^{-1}显示。

实际上，通过HAT产生的中间体在热力学上并不稳定。根据Cpd I中Fe-OH的空间取向，羟基会反弹到暴露的烷基或芳香族的碳原子上，从而生成更稳定的羟基化产物（图2）。鉴于HS和LS之间的热力学反应性大致相当，HAT后的次要反应仅在双重态下进行了研究。与限速的HAT相比，反弹过程更快。具体来说，铁配位的羟基物种[FeIV-OH]的反弹伴随着底物自由基（UV-P·）的重组，并通过极低障碍的过渡态（2TS2H-OH，Ea=0.2 kcal·mol^{-1}）进行。伴随着Fe-O键的伸长至2.36 ?，自由基重组步骤的特征是杂化轨道从sp2变为sp3，同时形成了新的C-OH键（1.42 ?），而原来的羟基氧同时发生酮化。一旦Fe-O的配位键在HAT完成和羟基反弹后减弱，一个H2O分子会竞争性地重新与Fe原子结合，从而促进羟基化代谢物的释放和六配位结构（=FeIII-H2O）的恢复，为下一个催化循环做好准备。与先前的结果（Shaik等人，2004年）一致，羟基向裸露的甲基碳的反弹直接导致甲基羟基化（2PH-Me），通过近乎无障碍的过渡。相对于HAT，羟基向烷基或芳基碳的反弹更快、更自发且放热更多（2PH-OH的ΔE为-26.5 kcal·mol^{-1}；2PH-Me的ΔE为-48.6 kcal·mol^{-1}）。尽管从UV-P的第一个HAT开始，然后向相邻芳香碳的羟基进行两步羟基化所需的能量障碍较低，但从热力学上看，生成的2PH-OH产物不如从甲基位置羟基化产生的产物稳定。

尽管UV-P在甲基或羟基相邻芳香位点的羟基化过程看似相同，但背后的电子机制在电荷转移特性上存在显著差异。Mulliken电荷和电子自旋密度沿反应途径的变化分别在表S3和表S4中展示。除了FeO的反键轨道π*和卟啉环的a2u轨道中的电子自旋方向相反外，Cpd I在双重态和四重态下与底物结合的电子构型都表示为↑↓(δx2-y22πxz*1πyz*1a2u1σsub2)。HAT和反弹过程中反应物种和电子转移的变化在图3中针对双重态进行了具体说明。在UV-P的甲基位点进行氢原子抽取后，形成了自由基中间体IMH-Me，其电子构型发生了↑↓(δx2-y22πxz*1πyz*2a2u1σsub1)的重排，其中大约有一个Alpha电子从甲基转移到a2u，同时卟啉的原始Beta电子转移到π*上以实现双重占据。此时FeO部分的电子自旋密度从2.11降低到1.02。随后的反弹过程涉及OH介导的电子转移回底物自由基中心（↑↓3dxz2 3dyz1a2u2 σC-OH2）和a2u的壳层闭合。相比之下，UV-P的酚羟基路径（2RH-OH）表现出不同的轨道占据模式↑↓(δx2-y22πxz*1 πyz*1 a2u1σOH2 πSub2)，其中πSub轨道代表跨越苯环的离域分子轨道。通过从酚羟基组的氢原子抽取，同样生成了带有单个电子在πSub轨道中离域的自由基中间体，电子转移至π*促进了σOH轨道的形成。Fe-OH的反弹与电子向πSub和A2u的转移协同进行，壳层闭合，Fe的非键合状态（ρ=1.16）保持为3d/3d原子轨道特性（↑↓3dxz23dyz1a2u2πSub2）。据我们所知，这是首次通过Cpd I的HAT和羟基反弹来研究芳香环的独特羟基化机制。这些机制差异对于理解区域选择性和预测环境生物转化过程中的代谢物分布具有重要意义。

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**图3.** 甲基和酚羟基位置上氢原子抽取和OH反弹机制的电子转移和键形成途径。

**3.2. 芳香族亲电加成**
由于UV-P的结构不对称性、灵活性和位点多样性，Cpd I引起的芳香族亲电加成可能以复杂的方式发生。在图1中，考虑了包括C1-～C5-和C7-～C10-在内的多个芳香取代位点，这些位点对亲电加成的敏感性进行了研究。如图4(a)所示，由Cpd I在不同碳位点引发的亲电加成在原理上能够克服不同的活化能障碍，从而生成多种π-复合物中间体。活化能障碍分别在6.3–22.3 kcal·mol?1（LS）和8.8–20.4 kcal·mol?1（HS）范围内，较低的自旋多重态的电子构型似乎更有利于UV-P的亲电加成。总体而言，HAT过程比加成过程更有优势。下载：下载高分辨率图像（591KB）下载：下载全尺寸图像

图4. 不同反应路径上能级变化和构象变化的示意图，(a) 在UV-P的C1-～C5-和C7-～C10-位点引发的亲电加成（HS和LS）；(b) 涉及NIH、PS和EPO项的副反应，以LS下能量最稳定的反应物（RO-C3）为例。构象在UB3LYP-D3(BJ)/Lanl2DZ (Fe)/6–31 G**（其余原子）下优化，能量计算考虑了Lanl2TZ(f) (Fe)/6–311 + G**（其余原子）更高水平的ZPE。能量以kcal·mol?1标记在能级上，反应物、过渡态和中间体的构象用黑色表示键长（?），用红色表示键角（度，°）。

从区域选择性来看，LS下反应物最有利于加成的位点位于羟基桥接的C2位点，因为其活化能障碍最低，为6.3 kcal·mol?1。如果反应物在HS下进行电子构型，亲电加成的优选位点应该是C8位点，因为其活化能障碍为8.8 kcal·mol?1。FeO加成的模式和结构区域选择性与UV-P上的·OH自由基加成一致（Cao等人，2022年）。FeO中心以145.5°（∠Fe-O-C）接近底物，达到过渡态2TSO-C2（ν =425.8i cm?1），而四重态活化需要克服更高的活化能障碍10 kcal·mol?1才能达到相应的过渡态4TSO-C2（ν =502.5i cm?1），形成碳中心的四面体中间体（2/4IMO-C2）。在C2位点观察到的显著较低的活化能障碍可以归因于反应路径中的有利电子重组。表S6中的Mulliken电荷分析为这一过程提供了定量见解。从反应物到过渡态的过程中，底物的总电荷从0.02增加到0.73 e。同时，卟啉框架积累了负电荷（0.23至?0.38 e），表明底物向血红素辅因子的有效电荷转移。苯并三唑在C8位点的加成被证明是容易发生的反应路径，因为其活化能仅计算为四重态下的8.8 kcal·mol?1和双重态下的7.7 kcal·mol?1。同样，亲电加成在芳香位点的发生伴随着显著的电子转移。

如图5中的等高线图所示，2RO-C8在双重态下的电子自旋密度主要局域在Fe和卟啉环上，分别分配了更多的Alpha和Beta电子。当达到过渡态2TSO-C8时，UV-P中C8-和相邻芳香位点的Alpha电子显著转移到卟啉环的a2u轨道上，并部分转移到FeO的反键π*轨道上，未配对的Beta电子则分布在苯并三唑部分周围。HS下的4RO-C8反应物显示出明显的自旋分布，Alpha密度集中在Cpd I上，随着亲电加成的进行，电子转移与从底物中招募的主要Beta电子同时发生。实际上，UV-P的大量Beta电子转移到卟啉环的a2u轨道上，并部分转移到FeO的轨道上，当获得4IMO-C8复合中间体时。除了不同的自旋电子转移外，LS和HS之间的加成机制没有明显差异。下载：下载高分辨率图像（221KB）下载：下载全尺寸图像

图5. 在双重态（上图）和四重态（下图）下C8位点亲电加成路径上的电子自旋密度变化，蓝色等高线代表Alpha密度（+），黄色线条代表Beta密度（-）。

3.2.1. 亲电加成后的副反应
在限速步骤中，随着Cpd I亲电性的增加，芳香π电子系统发生轻微极化。与UV-P的C3位点结构协调的反应复合物可能是最可能的前体，因为它具有最高的热稳定性和最低的活化能障碍。考虑到C3位点的脆弱性，值得探讨Cpd I亲电加成后副反应的热力学可能性，如图4(b)所示。当通过亲电加成获得的中间体2IMO-C3（-8.8 kcal·mol?1）暂时异构化为更稳定的形式2IMC3-PS（-38.2 kcal·mol?1）时，由于卟啉N的耐受性和富电子特性，推测发生了质子穿梭（PS）。正如先前研究所记录的，通过NIH转移（C3-NIH）或与邻近碳的环氧化（C3-EPO）也可能发生，这些路径可能导致UV-P的氧化。上述三种路径之间的竞争关系将直接影响UV-P的代谢命运，并增加暴露的复杂性和风险。预计质子穿梭与几乎无障碍的质子反弹将占主导地位，最终形成相对最稳定的产物PC3-PS（-43.3 kcal·mol?1）。这与UV-327代谢中观察到的单羟基化产物一致（Fischer等人，2020年）。此外，引入的?OH将激活苯环的共轭π电子系统并降低亲电加成的障碍（Fu等人，2016年），并促进芳香环的羟基化或氧化开环。C8位点的苯并三唑加成被证明是容易发生的反应路径，因为其活化能仅计算为四重态下的8.8 kcal·mol?1和双重态下的7.7 kcal·mol?1。同样，亲电加成在芳香位点的发生伴随着显著的电子转移。

如图5所示，2RO-C8在双重态下的电子自旋密度主要局域在Fe和卟啉环上，分别分配了更多的Alpha和Beta电子。当达到过渡态2TSO-C8时，UV-P中C8-和相邻芳香位点的Alpha电子显著转移到卟啉环的a2u轨道上，并部分转移到FeO的反键π*轨道上，未配对的Beta电子则分布在苯并三唑部分周围。HS下的4RO-C8反应物显示出明显的自旋分布，Alpha密度集中在Cpd I上，随着亲电加成的进行，电子转移与从底物中招募的主要Beta电子同时发生。实际上，当获得4IMO-C8复合中间体时，UV-P的大量Beta电子转移到卟啉环的a2u轨道上，并部分转移到FeO的轨道上。除了不同的自旋电子转移外，LS和HS之间的加成机制没有明显差异。下载：下载高分辨率图像（221KB）下载：下载全尺寸图像

图5. 在双重态（上图）和四重态（下图）下C8位点亲电加成路径上的电子自旋密度变化，蓝色等高线代表Alpha密度（+），黄色线条代表Beta密度（-）。

3.2.1. 亲电加成后的副反应
在限速步骤中，随着Cpd I亲电性的增加，芳香π电子系统发生轻微极化。与UV-P的C3位点结构协调的反应复合物可能是最可能的前体，因为它具有最高的热稳定性和最低的活化能障碍。关于C3位点的脆弱性，值得探讨Cpd I亲电加成后副反应的热力学可能性，如图4(b)所示。当通过亲电加成获得的中间体2IMO-C3（-8.8 kcal·mol?1）暂时异构化为更稳定的形式2IMC3-PS（-38.2 kcal·mol?1）时，由于卟啉N的耐受性和富电子特性，推测发生了质子穿梭（PS）。正如先前研究所记录的，通过NIH转移（C3-NIH）或与邻近碳的环氧化（C3-EPO）也可能发生，这些路径可能导致UV-P的氧化。上述三种路径之间的竞争关系将直接影响UV-P的代谢命运，并增加暴露的复杂性和风险。预计质子穿梭与几乎无障碍的质子反弹将占主导地位，最终形成相对最稳定的产物PC3-PS（-43.3 kcal·mol?1）。这与UV-327代谢中观察到的单羟基化产物一致（Fischer等人，2020年）。此外，引入的?OH将激活苯环的共轭π电子系统并降低亲电加成的障碍（Fu等人，2016年），并促进芳香环的羟基化或氧化开环。启动NIH转移和环氧化所需的较大活化能表明它们在特定酶环境或底物取向下的劣势（Wang等人，2015年）。尽管相对于质子穿梭产物，NIH转移的热力学稳定性较低（-36.9 kcal·mol?1），但它涉及特征性的1,2-氢迁移，这在芳香羟基化中是一个机制上重要的路径（Ortiz de Montellano和Nelson，2011年）。环氧化路径表明，为了达到过渡态TSC3-EPO，芳香C3和O之间的距离需要从1.34 ?延长到1.40 ?，而产物PC3-EPO中的三员环闭合导致独特的几何构型变化，∠C-C-O角度从92.4°变为59.8°，C-O距离显著延长（1.45 ?）。这种三员环之间的结构应变可能是环氧化产物相对较高能量的原因（Kumar等人，2004年）。环氧化中间体通常具有高反应性，容易发生亲核攻击反应形成谷胱甘肽加合物（Guengerich和Macdonald，1984年）。此外，苯并三唑环氧化物代谢物在捕获实验中形成了DNA加合物，表明潜在的遗传毒性机制，需要进一步研究（Cheng等人，2025年）。尽管由于不稳定性难以检测环氧化产物，但它们的水解产物或谷胱甘肽加合物可以在非靶向代谢物谱中轻松识别（Lindstrom等人，1998年）。质子穿梭和质子反弹路径的占优势突显了先前研究中UV吸收剂多羟基化代谢物的主要检测结果，而不是因为它们的热力学劣势而较少见的环氧化物（Li等人，2022年）。

3.3. 三唑环的硝化
吡啶氮（N1, N3）构成了苯并三唑UV稳定剂的光活性核心，其中三唑氮和酚羟基之间的分子内质子转移产生了通过快速内部转换耗散UV能量（280–400 nm）的光激发态（Sobolewski和Domcke，2006年）。这种氮-氢-酚相互作用提供了工业UV保护所需的卓越光稳定性（Fluegge等人，2007年，Woessner等人，1984年）。生物学研究已经确定了苯并三唑UV稳定剂的N-氧化物代谢物（Denghel等人，2019年，Li等人，2024a），表明三唑环氧化是一种转化路径。三唑杀菌剂通过不同的CYP亚型表现出立体选择性代谢，涉及特定的氮-血红素结合相互作用，其中氢键和π堆叠限制了底物在活性腔内的位置（Lv等人，2017年）。三唑氮环境的微妙结构差异可以显著影响酶的选择性模式。对过渡态的计算分析揭示了UV-P的N-氧化的显著区域选择性。在双重态下，Cpd I对吡啶氮（N1, N3）的氧化表现出较低的活化能（Ea =15.2 kcal·mol?1）和热力学优势，并且可以自发发生，生成更稳定的N-氧化物（ΔG = ?16.7 kcal·mol?1）。相比之下，吡咯桥接氮（N2）的氧化需要稍高的活化能障碍（Ea = 23.1 kcal·mol?1），而正的Gibbs反应自由能变化进一步削弱了标准条件下的热力学可行性（ΔG = 14.3 kcal·mol?1）。这一结果再次强调了典型动力学与热力学控制之间的竞争机制（Shaik等人，2002年）。表S5中，来自Mulliken电荷和自旋密度的电子基础揭示了UV-P硝化的区域选择性。在N1过渡态（TSO-N1）中，Fe中心显示出高自旋密度（ρFe=1.69）和显著的底物极化（ΔρSub=0.23），表明强烈的电子耦合通过过度的轨道相互作用提高了活化能障碍。相反，N2路径（TSO-N2，ΔρSub=0.05）显示出中等的Fe自旋密度（ρFe=1.31）和分散的电子分布，然而桥接氮位置施加的几何约束最终决定了更高的能量要求。值得注意的是，底物氮的电荷演变反映了不同的电子重组模式。N1氧化涉及电荷从?0.49e（RO-N1）增加到0.13e（IMO-N1），而N2氧化显示出从0.90e（RO-N2）增加到1.61e（IMO-N2）的显著电荷增加，表明广泛的电子耗尽，使桥接氮环境不稳定，导致这一路径的热力学不利性。这种电子-立体相互作用表明，P450的最佳反应性需要平衡的金属-底物耦合，而不是最大轨道重叠，这与最近关于血红素酶选择性的机制研究一致（Rittle和Green，2010年，Shaik等人，2010年）。吡咯桥接氮（N2）的氧化路径可能是一种独特的途径，通过逐步的构象崩解导致环开环。如图6所示，UV-P的分子几何结构在苯环和苯并三唑环之间发生了显著变化，从反应物的伸展构象179.9°变为TSO-N2的逐渐折叠构象131.7°和IMO-N2的111.4°，这些构象变化被认为促进了N-C键的延长，最终导致N-N键的断裂。这种构象门控机制解释了N-氧化物代谢物的环境检测，因为热力学上适度的环开环产物（10.1 kcal·mol?1）为进一步的氧化分解提供了可行的路径（Akhtar等人，2018年，Zhang等人，2012年）。

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图6. 三唑环硝化过程中的能级和构象变化图。构象在UB3LYP-D3(BJ)/Lanl2DZ (Fe)/6–31 G**（其余原子）下优化，能量计算考虑了Lanl2TZ(f) (Fe)/6–311 + G**（其余原子）更高水平的ZPE。能量以kcal·mol?1标记在能级上，键长以埃（?）表示，键角和二面角（D）以度（°）表示，振动频率（ν）以cm–1表示。

3.4. UV-P的优先生物转化路径
表S7中计算了Cpd I对UV-P的基本反应速率（kn, cm3·molec?1·s?1），并用于通过动力学优先考虑生物转化路径和实际影响。与从四重态反应物开始的路径相比，双重态下的转化更倾向于直接、协同的氧化机制，具有较低的活化能障碍和更快的反应速率。在酚OH处的氢抽取显示出最高的反应速率，分别为1.30 × 10?1 × 10?1 cm3·molec?1·s?1（双重态）和9.26 × 10?2? cm3·molec?1·s?1（四重态）。在甲基位点的氢抽取显示出速率的显著下降（1.17 × 10?33 ～1.75 × 10?3? cm3·molec?1·s?1），大约低十四个数量级。总体而言，动力学计算与热力学一致，并证实了酚OH处氢抽取的优越性。在芳香碳位点中，C2位点的亲电加成显示出最优先的区域选择性（kC2-LS=2.78 × 10?3? cm3·molec?1·s?1）。与HAT和亲电加成相比，三唑上吡啶氮和吡咯氮的硝化在动力学上受到极大限制，硝化速率降低到2.79 × 10??3 ～2.82 × 10??3 cm3·molec?1·s?1。尽管较慢，但在有机体内可能发生硝化产物是合理的。此外，这些动力学数据为羟基化产物相对于硝基化产物的优势提供了理论依据。与主要限速反应相比，次要反应的加速效果更为显著，因为计算出的反应速率高出几个数量级。在C3位点的初始亲电加成反应（kC3-LS=3.06×10^-36 cm3·molec^-1·s^-1）之后，次要反应表现出截然不同的动力学特性。通过PS途径的次要反应显示出极高的速率（kC3-PS=1.26×10^7 cm3·molec^-1·s^-1），远超过NIH转移（kC3-NIH=1.13×10^-16 cm3·molec^-1·s^-1）和环氧化反应（kC3-EPO=1.68×10^-19 cm3·molec^-1·s^-1）。这种动力学竞争最终决定了羟基化产物的主要分布。对三个芳香环位点上的质子穿梭和反弹过程的研究揭示了反应性的优先级：邻位（C3）> 对位（kC4-PS=6.04×10^4 cm3·molec^-1·s^-1）> 苯并三唑环上的位置（kC8-PS=2.06×10^4 cm3·molec^-1·s^-1）。换句话说，PS在苯并三唑环上的反应性更强。这些动力学计算为理解UV-P代谢中的区域选择性提供了令人信服的解释和坚实基础。

3.5. 毒理学风险与生物转化相关
当UV-P的生物转化由P450酶介导时，通过多种羟基化、酮化和硝化途径，理论上可以识别出多种代谢产物或中间体。具体而言，羟基化产物是主要产物，这与热力学和反应动力学结果一致。与母体化合物UV-P相比，ECOSAR数据显示，羟基化产物对水生生物（鱼类、水蚤和藻类）的急性和慢性毒性较低。UV-P在所有三种测试物种中表现出最高的毒性，LC50/EC50值范围从0到1 log mg L^-1。随后，感兴趣的代谢物（PO-PS、PO-NIH、PO-EPO）的毒性显著降低，比母体化合物低2-3个数量级。这种毒性的降低可能源于羟基化代谢物增强的亲水性，这降低了其生物累积潜力和膜渗透性。此外，羟基官能团的引入可能促进结合反应和随后的消除途径，从而减少这些代谢物在水生系统中的生物利用度和持久性。然而，许多含有苯的药物在细胞色素P450催化下经历类似的生物转化时，显示出不同的药理学和毒理学特性（Gut等人，1996年）。越来越多的证据表明，从BT-UV衍生的羟基化代谢物表现出增强的毒理学特性，尤其是在内分泌干扰活性方面。强烈建议对UV-P代谢物进行更深入的毒理学研究，并对体内长期的内分泌干扰进行监测，以确定高风险代谢物的优先级。

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图7. 基于ECOSAR的UV-P及其降解产物的急性（a）和慢性（b）毒性预测。使用的毒理学术语包括96 h LC50、48 h LC50和96 h EC50，分别表示96小时内50%生物体的致死浓度和48小时内50%生物体的有效浓度。急性毒性的标准分为四个等级：极度毒性（LC50/EC50 ≤ 1 mg L^-1）、毒性（1 < LC50/EC50 ≤ 10 mg L^-1）、有害（10 < LC50/EC50 ≤ 100 mg L^-1）和无害（LC50/EC50 > 100 mg L^-1）。慢性毒性的标准为：极度毒性（ChV ≤ 0.1 mg L^-1）、毒性（0.1 < ChV ≤ 1 mg L^-1）、有害（1 < ChV ≤ 10 mg L^-1）和无害（ChV > 10 mg L^-1）。

4. 结论
本研究展示了计算化学与环境科学的结合，用于探讨BT-UVs新兴代谢物的酶介导的生物转化途径、机制和风险评估挑战。通过DFT计算，详细研究了导致UV-P羟基化、酮化和硝化的多种生化途径，并通过HAT的热力学启动、亲电加成及随后的次要反应机制进行了验证。（1）我们的计算表明，来自2-酚羟基的HAT在代谢中占主导地位，其活化能垒（0.93–1.13 kcal·mol^-1）和反应速率（10^-19 cm3·molec^-1·s^-1）远低于甲基氢抽取和芳香族亲电加成反应，优势高达14–24个数量级，从而为生物监测研究中羟基化代谢物的主要检测提供了分子层面的解释。（2）亲电加成后，质子穿梭机制以极高的效率进行（10^7 cm3·molec^-1·s^-1），比NIH转移和环氧化途径快20多个数量级，并建立了明确的区域选择性模式（苯并三唑环上的邻位 > 对位）。（3）Cpd I引起的N-氧化的热力学可能解释了肝组织中硝基化产物的存在。基于ECOSAR的毒性预测表明，羟基化代谢物对水生生物的急性毒性比母体UV-P低2–3个数量级。然而，包括内分泌干扰和AhR介导的毒性在内的全部生物学效应仍需进一步研究。DFT获得的系统知识有助于揭示BT-UVs的关键P450酶促生物转化机制、命运和毒理学变化。

尽管Cpd I活性位点模型提供了机制上的见解，但仍存在一些挑战。需要QM/MM计算来捕捉完整的酶动力学，对新鉴定的N-氧化产物进行实验验证，需要将这一框架扩展到其他BT-UVs和CYP异构体（CYP1A2、CYP2C9），以及将计算出的代谢物谱转化为定量环境暴露估计的挑战。

CRediT作者贡献声明：
范秀丽：软件、方法学、形式分析。
杨星伦：可视化、数据管理。
顾成刚：写作-审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。
高正远：可视化、软件、研究、形式分析。
严东云：软件、资源管理。
王尊尧：方法学。
孙成：项目协调。
江欣：监督、资金获取。
沈乐祖：写作-初稿、可视化、软件、方法学、研究、形式分析、概念构思。
何欢：形式分析。
杨少贵：监督。