Arthrobacter sp. SC2-19菌株在镉生物修复方面的潜力研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Characterization of cadmium bioremediation potential of Arthrobacter sp. SC2-19

　　隋阳|辛阳|李坦|黄婷婷|袁凌伟|唐宇|张胜元|吴永军|童硕秋|金静|张林成|岑莉
中国贵州省贵阳市贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究所，教育部山地植物资源保护与种质创新重点实验室，邮编550025

**摘要**
节杆菌属（Arthrobacter sp.）是一类具有生态效益的微生物，具有修复镉污染的潜力。在本研究中，从受污染的土壤中分离出了节杆菌SC2–19菌株，其对CdCl?的最低抑制浓度为2900 mg/L。该菌株具有广泛的环境适应性，能在pH 5–9、盐离子浓度0.5–5%以及温度18–38°C的条件下生长。在pH 5且生物量浓度为1 g/L的条件下，该菌株在60分钟内从60 mg/L的溶液中吸附了53.23%的Cd2?。在镉浓度为5 mg/kg的土壤中，添加0.5%（w/w）的SC2–19菌株后，可交换态镉含量减少了25.48%，而残余态镉含量增加了13.36%。吸附等温线和动力学分析表明，Cd2?的吸附过程是异质且多层的。在镉胁迫下，菌细胞表现出顶端膨胀和细胞间黏附现象，导致细胞分支。细胞表面蛋白质和多糖上的关键功能基团（如-OH、N-H、氨基、磷酸基和硫酸基）参与了Cd2?的结合。这些发现为理解细菌吸附重金属的分子机制提供了理论基础，并突显了节杆菌SC2–19在镉污染修复中的潜力。

**1. 引言**
快速的工业和农业发展加剧了采矿、工业排放和化肥过度使用等活动，导致土壤重金属污染日益严重（Angon等人，2024年）。全球约有5亿公顷的土壤受到重金属或类金属的污染，每年造成高达100亿美元的经济损失（Ahmad等人，2024年）。调查显示，中国16.1%的土壤超过重金属标准，其中镉是主要污染物（Tu等人，2020年）。镉是一种高毒性的重金属，被国际癌症研究机构和世界卫生组织列为I类致癌物和主要食品污染物（Zhu等人，2022年）。镉在土壤中具有高迁移性，容易被作物吸收（Ali等人，2022年；Fattorini等人，2017年）。镉在食物链中的积累会导致人类肝脏和肾脏损伤、骨骼癌变以及生殖功能障碍（Chi等人，2020年；Ma等人，2020年）。统计数据显示，中国每年约有15万吨农产品受到镉污染（Hu等人，2016年）。土壤镉污染已成为全球性的环境问题。为防止进一步污染，迫切需要绿色和可持续的修复方法来减轻土壤中镉的危害。

近年来，已采用多种方法进行土壤镉污染的修复。物理修复方法（如土壤稀释、置换和热处理）往往受到环境破坏、成本高昂、劳动强度大以及损害土壤有机质等因素的限制，从而限制了其在实际应用中的效果（Wang等人，2023年；Xu等人，2024年）。化学修复通常使用石灰、氧化铁和锌盐等改良剂来固定镉，降低其迁移性和生物可利用性（Xu等人，2024年）。然而，这些处理方法会改变土壤的物理化学性质并降低土壤肥力（Yu等人，2022年）。此外，固定作用仅能隔离镉而不能将其完全去除，存在重新释放的风险（Xu等人，2024年）。为了弥补肥力下降并稳定修复效果，通常需要长期施用肥料。相比之下，利用微生物的生物修复方法是一种更可持续且前景广阔的策略，利用其快速生长和适应能力（Ma等人，2023年；Zhang等人，2024年）。细菌的镉抗性包括表面固定和细胞内解毒两种机制（Chi等人，2020年）。细菌细胞壁和胞外聚合物（EPS）上的功能基团通过配位、离子交换和静电吸附等方式与镉结合，减少其吸收，从而阻止其进入细胞（Verma等人，2025年；Ye等人，2014年）。细胞内部通过外排泵、金属螯合蛋白和酶促氧化还原反应等机制进一步排除、隔离或转化镉（Abbas等人，2018年）。这些多层次过程的协同作用使微生物能够在受污染环境中存活，并为其有效修复镉提供了基础（Nie等人，2024年；Xia等人，2021年）。例如，用Fe-Mn氧化菌处理镉浓度为6 g/kg的土壤75天后，可降低可提取镉含量36.84%，并将其转化为生物利用度较低的化学形式（Huang等人，2023年）。

微生物修复的实际应用依赖于合理选择具有针对性镉修复特性的菌株。节杆菌属细菌广泛分布于土壤环境中，具有很强的环境适应性和高镉抗性（Kong等人，2022年；Wang等人，2018年）。特定菌株对CdCl?的最大抗性浓度达到950 mg/L，并对多种重金属（如Zn2?、Cu2?和Pb2?）具有抗性（Wang等人，2018年）。此外，有证据表明节杆菌属细菌能够积极调节土壤微生物群落结构（Ma等人，2023年），并在镉胁迫下维持促进植物生长的关键功能（如吲哚-3-乙酸的产生和磷酸盐溶解）（Xu等人，2018年）。总体而言，这些特性凸显了节杆菌属细菌作为多功能镉生物修复剂的潜力。然而，目前仍存在镉吸附机制不明确以及对受污染土壤效果未经验证的问题。因此，全面研究节杆菌属细菌的镉去除性能和机制至关重要。

本研究旨在从重金属污染的土壤中分离并筛选高镉抗性菌株，并系统评估其生物修复潜力。通过对镉抗性的初步研究，筛选出高抗性菌株并表征其生长特性。基于生长特性，评估了这些菌株在不同环境条件下的镉吸附能力及其在镉污染土壤中的修复效果。最后，通过平衡等温线、动力学模型、扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等手段对吸附机制进行了分析。本研究为重金属污染的生物修复提供了宝贵的微生物资源，并有助于深入理解微生物与金属相互作用的机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 样品采集与试剂
土壤样品采集自中国贵州省遵义市（27.70°N, 106.92°E）的采矿区，采用五点采样法分离镉抗性细菌，并储存在PVC袋中。用于制备镉污染基质的土壤购自湖南湘辉农业科技有限公司。CdCl?（CAS 10108–64–2）购自上海麦克林生化有限公司。
2.2. 镉抗性细菌的分离与鉴定
将5 g土壤样品悬浮在10 mL无菌水中，浓度为5 × 10?1 g/mL，然后依次用无菌水稀释至10?2、10?3、10??和10?? g/mL。将稀释后的样品涂布在含有500、800、1100、1400、1700和2000 mg/L CdCl?的LB琼脂平板上，28°C培养4天以监测细菌生长情况。选取前三株最耐镉的细菌进行形态学鉴定、分子鉴定和生长曲线分析。将分离出的单菌落划线接种到LB琼脂平板上，28°C培养72小时观察菌落和细胞形态。此外，将菌株在LB液体培养基中28°C、180 rpm振荡培养24小时，观察生长特性。将每个菌株的单菌落接种到LB液体培养基中，28°C、180 rpm振荡培养直至OD600达到1.0。随后将2%（v/v）的菌液接种到LB培养基中培养64小时，每小时测量一次OD600以生成生长曲线。

使用引物16S-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和16S-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行镉抗性细菌的PCR扩增。测序后（上海生物工程有限公司），将16S rRNA序列在NCBI中进行BLAST分析，并使用MEGA 11（v11.0.13）进行系统发育重建（Huang等人，2021年）。
2.3. 选定细菌的镉抗性评估
根据Bafana等人（2010年）的方法确定三株耐镉菌株的镉抗性。将三株耐镉菌株的单菌落分别接种到LB液体培养基中，28°C、180 rpm振荡培养至对数期。将培养物调整至OD600为1 ± 0.05，然后依次稀释（10?1–10?3）。将每种稀释液的5 μL接种到含有2000–2900 mg/L CdCl?的LB琼脂平板上，28°C培养3天，通过观察菌落生长确定最低抑制浓度（MIC）。此外，将OD600调整至1 ± 0.05的培养物以2%（v/v）的比例接种到含有0 mg/L和100 mg/L Cd2?的LB液体培养基中。28°C、180 rpm振荡培养至对数后期，通过测量OD600进一步评估镉抗性。
2.4. 耐镉菌株的生长特性分析
根据镉抗性测试结果，选择最耐镉的菌株进行生长特性分析（Fan等人，2023年）。将LB液体培养基的pH调整至5、6、7、8和9；使用NaCl将盐度调整至0.5%、0.7%、1.0%、2.0%、5.0%和10.0%（w/v），然后将处于对数期的菌株以2%（v/v）的接种量接种到培养基中。28°C、180 rpm培养64小时，每小时测量一次OD600以评估菌株对不同pH和盐离子的适应能力。最后，将菌株以相同的接种量接种到LB液体培养基中，分别在18、23、28和37°C、180 rpm振荡培养24小时。使用分光光度计测量OD600以评估菌株的生长情况（Fan等人，2023年）。
2.5. 生物量的制备
将最耐镉的菌株在LB液体培养基中28°C、180 rpm振荡培养至对数期，然后4°C、5000 rpm离心15分钟以收获生物量。将沉淀物重新悬浮在无菌水中，制备所需浓度的细胞悬液用于后续的生物吸附实验（Zhang等人，2024年）。
2.6. 批量实验
进行批量生物吸附实验，研究初始镉浓度、生物量剂量、溶液pH和接触时间对镉去除的影响（Xu等人，2020年）。基准条件设置为Cd2?浓度60 mg/L、生物量1 g/L、pH 7和接触时间60分钟。每次改变一个参数，其他参数保持不变。具体实验范围如下：初始Cd2?浓度20、40、60、80和100 mg/L；生物量剂量0.5、1、2、4和6 g/L；溶液pH值5、6、7、8和9；接触时间5、10、30和120分钟。所有实验均在含有20 mL培养基的Erlenmeyer烧瓶中进行，28°C、180 rpm振荡培养。培养后，样品以5000 rpm离心10分钟，上清液通过0.22 μm膜过滤后进行ICP-MS分析（PerkinElmer，美国）（Li等人，2023年）。还包括一个无生物量的对照组，条件相同，以评估化学沉淀和/或容器吸附对镉损失的影响。镉去除效率（R）和吸附容量（q）分别用公式（1）和（2）计算：
(1) R = (C? ? C?) / C? × 100%
(2) q = (C? ? C?) / m × V
其中C?和C?分别表示吸附前后的Cd2?浓度（mg/L），V为培养基体积（L），m为生物量干重（g）。
2.7. 耐镉菌株对土壤中镉形态的影响
参考Fan等人（2023年）和Zheng等人（2023年）的实验方法，稍作修改，研究菌株对镉污染土壤的修复效果。去除杂质（如石头）后，将土壤在121°C下灭菌30分钟。随后加入CdCl?溶液并充分混合，制备镉浓度为5 mg/kg的污染土壤，然后在25°C下老化75天后再使用。在121°C灭菌前后分别采集土壤样品。这些样本被悬浮在无菌水中，连续稀释1000倍后涂布在LB琼脂上，并在28°C下培养3天，以验证土壤中微生物在灭菌后的存活情况。耐镉菌株被接种到液体LB培养基中，在28°C下以180转/分钟的转速振荡培养，直到达到对数生长阶段。细菌细胞通过离心收集，称重后重新悬浮在液体LB培养基中以制备细菌悬浮液。在实验组中，将细菌悬浮液以0.5%（w/w）的剂量均匀喷洒在500克土壤上，而对照组则在其他条件相同的情况下接受相同体积的无菌LB培养基。实验在28°C的培养箱中进行，黑暗条件下持续120天，同时保持土壤含水量为40%。此外，细菌细胞也被重新悬浮在无菌水中并施加到土壤中。在培养7天和14天后，将土壤悬浮液连续稀释（10^-5），然后涂布在LB琼脂上，并在28°C下培养72小时以观察菌株的存活情况。实验完成后，使用Tessier顺序提取方法确定土壤样本中五种不同的镉化学形态，包括可交换态（EXE）、碳酸盐结合态（CAB）、Fe-Mn氧化物结合态（FMO）、有机物结合态（OM）和残留态（RES）（Huang等人，2023年）。

2.8. 探索选定细菌的镉吸附和抗性机制
2.8.1. 生物吸附等温线
采用了两种平衡等温线模型（Langmuir和Freundlich）来阐明细菌生物量与吸附物溶液之间的吸附机制（Liu等人，2023年）。生物量以1克/升的剂量加入pH值为7且含有5、10、20、50、100和200毫克/升Cd2+的溶液中。然后在28°C下吸附6小时。离心并通过0.22微米膜过滤后，使用ICP-MS测定上清液中的Cd2+浓度。相应的方程和参数定义见表S1。

2.8.2. 生物吸附动力学
采用了两种动力学模型（伪一级和伪二级）来阐明细菌生物量与吸附物溶液之间的生物吸附动力学（Wang等人，2024年）。在生物吸附动力学研究中，生物量以1克/升的剂量加入pH值为7且含有60毫克/升Cd2+的溶液中。然后让溶液吸附5、10、20、30、60、120、240和360分钟。之后测量上清液中的Cd2+浓度。使用这两种模型对动力学数据进行了拟合，得出的计算平衡吸附容量（qe, cal）与实验测定的值（qe, exp）进行比较，以评估模型性能。相应的方程和参数定义见表S1。

2.8.3. SEM分析
使用SEM观察了最强耐镉菌株在吸附Cd2+前后的形态变化。该菌株被接种到含有600毫克/升Cd2+的液体LB培养基中，并在28°C下以180转/分钟的转速培养至对数生长阶段。在没有Cd2+的相同条件下培养的细菌细胞作为对照。通常，吸附前后收集细菌细胞，并通过添加3%戊二醛和1%锇酸进行两次固定。固定后，加入乙醇进行梯度（30%、50%、70%、90%、100%）脱水并干燥。干燥后的样品在喷镀金后使用jsm-it700hr（JEOL，日本）扫描电子显微镜观察（Chen等人，2019年）。

2.8.4. FTIR分析
在2.9节描述的相同条件下，通过FTIR分析了Cd2+暴露前后细胞表面官能团的变化。在此过程中，KBr研磨片以1:100的比例进行分析，扫描范围为400–4000厘米^-1，分辨率为2厘米^-1，共扫描64次（Chi等人，2020年）。

2.9. 统计分析
使用Origin 2022软件进行图表绘制。SPSS软件版本17.0用于单因素方差分析，并使用Duncan检验来检测组间差异。p≤0.05的差异被认为是显著的。

3. 结果
3.1. 耐镉微生物菌株的分离与鉴定
最初在含有500–2000毫克/升CdCl2的LB琼脂上分离出三种最有效的耐镉菌株，并分别标记为SC2–6、SC2–7和SC2–19。这三种菌株在LB琼脂上的菌落表现出相似的特征，包括淡黄色、湿润的表面、革兰氏染色呈阳性以及短杆状细胞结构（图1A）。在液体LB培养中的生长特征表现为细小的絮状悬浮液，而不是形成清晰的离散颗粒（图1A）。SC2–6、SC2–7和SC2–19菌株的生长模式如图1B所示。SC2–6和SC2–19菌株在大约4–18小时内表现出指数生长，24小时后达到稳定期，随后进入死亡期。SC2–7菌株在对数生长阶段有大约2小时的延迟，在6–18小时内完成指数生长，然后在24小时后进入死亡期。

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图1. Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6、Arthrobacter sp. SC2–7和Arthrobacter sp. SC2–19的形态、生长和系统发育特征。(A) 形态观察：a) 在28°C下培养72小时的LB固体培养基上的单个菌落形态。b) 在28°C、180转/分钟下培养24小时的LB液体培养基中的菌落形态。c) 显微镜下的菌落形态。(B) 菌株的生长曲线，(C) 基于16S rRNA基因序列的邻接聚类系统发育树。
16S rRNA序列的同源性分析和系统发育树构建显示，SC2–6、SC2–7和SC2–19菌株与Paenarthrobacter nitroguajacolicus GU-NR7、Arthrobacter sp. MR-18和Arthrobacter sp. HBUM179104具有99%的序列相似性，并在系统发育树中聚类在一起（图1C）。根据这些结果，SC2–6、SC2–7和SC2–19菌株分别被鉴定为Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6、Arthrobacter sp. SC2–7和Arthrobacter sp. SC2–19。SC2–19菌株被存入中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 20242394。

3.2. SC2-6、SC2-7和SC2-19菌株的耐镉能力评估
通过在固体培养基上进行点测法确定了CdCl2的MIC值。Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6、Arthrobacter sp. SC2–7和Arthrobacter sp. SC2–19的MIC值分别为2700、2800和2900毫克/升，其中Arthrobacter sp. SC2–19细胞表现出最高的耐受性（图2A）。图2B显示，在暴露于100毫克/升Cd2+ 18小时后，Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6、Arthrobacter sp. SC2–7和Arthrobacter sp. SC2–19的生物量分别减少了25.1%、37.48%和13.12%，与未添加Cd2+的对照组相比。在100毫克/升Cd2+ 下，Arthrobacter sp. SC2–19的生物量产量分别比Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6和Arthrobacter sp. SC2–7高出13.76%和27.23%，表明Arthrobacter sp. SC2–19具有更强的Cd2+耐受性。基于这些结果，选择Arthrobacter sp. SC2–19进行进一步的镉生物吸附机制研究。

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图2. Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6、Arthrobacter sp. SC2–7和Arthrobacter sp. SC2–19的耐镉性。(A) 在含有不同浓度CdCl2的LB固体培养基上培养72小时后的菌株生长差异。(B) 在28°C、180转/分钟下，在0和100毫克/升液体LB培养基中培养18小时后的菌株生物量，（***表示p<0.001）。

3.3. Arthrobacter sp. SC2-19的生长特性
在不同的盐度、pH值和温度条件下研究了Arthrobacter sp. SC2–19的生长情况。如图S1A所示，Arthrobacter sp. SC2–19能够在0.5–5%的盐度范围内生长，在0.5–2%的盐度下生长稳定，而在5% NaCl下生长受到显著抑制。该菌株在pH 5–9和温度范围18–38°C下都能存活，并在pH 7和28°C时表现出最大生长（图S1B和S1C）。因此，后续研究将标准培养条件设定为1%盐度、pH 7和28°C，以研究Arthrobacter sp. SC2–19的镉吸附能力和其潜在机制。

3.4. 评估Arthrobacter sp. SC2-19的Cd2+吸附潜力
在初始实验条件下（60毫克/升Cd2+、1克/升生物量、pH 7、接触时间60分钟），评估了不同Cd2+浓度、生物量、pH值和吸附时间对Arthrobacter sp. SC2–19细胞吸附能力的影响。图3A显示了初始Cd2+浓度对Arthrobacter sp. SC2–19吸附能力的影响，此时生物量为1克/升，pH值为7，接触时间为60分钟。在20毫克/升Cd2+ 下，去除效率为41.79%；当Cd2+浓度增加到40、60、80和100毫克/升时，去除效率分别降低到35.78%、33.23%、31.30%和32.82%。随着生物量从0.5克/升增加到6克/升，Arthrobacter sp. SC2–19的Cd2+去除效率从32.15%增加到38.78%（图3B）。图3C显示了pH值对Arthrobacter sp. SC2–19 Cd2+去除效率的影响。该菌株在pH 5时表现出最高的去除效率，为53.24%。当pH值从5增加到9时，去除效率最初降低到27.84%，然后增加到34.27%，随后再次降低到20.06%。当接触时间从5分钟增加到120分钟时，Arthrobacter sp. SC2–19的Cd2+去除效率最初降低到31.27%，然后在120分钟时逐渐增加到38.65%（图3D）。

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图3. 不同吸附条件对Arthrobacter sp. SC2–19生物量吸附能力的影响。(A) Cd2+浓度，(B) 生物量剂量，(C) pH值，(D) 接触时间 (*表示p<0.05，***表示p<0.001)。

3.5. Arthrobacter sp. SC2-19对土壤中镉形态的影响
研究了Arthrobacter sp. SC2–19在土壤系统中的修复潜力。图4显示了用0.5%（w/w）Arthrobacter sp. SC2–19处理120天后镉的分馏变化。与对照土壤相比，经过处理的土壤中可交换态镉减少了25.48%，而稳定的有机结合态和残留态分别增加了4.8%和13.36%。

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图4. 120天修复后土壤中镉的化学分馏分布。CK：未接种细菌的对照组（仅LB）；Arthrobacter sp. SC2–19：接种了Arthrobacter sp. SC2–19的处理组。**表示p<0.01，***表示p<0.001。

3.6. Arthrobacter sp. SC2-19对镉的吸附和抗性机制
3.6.1. 生物吸附等温线和动力学
Langmuir和Freundlich等温线的线性图分别显示在图5A和B中。相应的参数列在表1中。Freundlich模型的决定系数（R2）值（0.94）高于Langmuir模型（0.84）。Freundlich常数KF和n分别为5.36 L1/n?mg^-1/n/g和2。Langmuir模型得出的最大吸附容量为23.02毫克/克（qmax），KL值为0.4 L/mg。

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图5. Arthrobacter sp. SC2–19生物量的吸附等温线和动力学。(A) Langmuir等温线，(B) Freundlich等温线，(C) 伪一级动力学，(D) 伪二级动力学。
表1. Arthrobacter sp. SC2-19生物量对Cd2+的吸附常数。
吸附剂
Langmuir等温线
空
Freundlich等温线
qmax (mg/g)
KL (L/mg)
R2
RL
KF (L1/n?mg^-1/n/g)
n
R2
SC2–19生物量
23.02
0.40
0.84
0.01
5.36
20.94
伪一级模型（图5c）的r2值高于伪二级模型（图5d）。从arthrobacter sp. sc2–19吸附数据拟合得到的动力学参数总结在表2中。从伪二级模型计算出的qe, cal值（40.03毫克/克）与实验测定的qe, exp值（32.74毫克/克）更为吻合，而从伪一级模型计算出的qe, cal值（23.33毫克/克）则不太吻合。

表2. arthrobacter sp. sc2-19生物量对cd2+的吸附动力学参数。
吸附剂
qe, exp (mg/g)
伪一级动力学
qe, cal (mg/g)
k1 (1/min)
qe, cal (mg/g)
k2 (g/(mg?min))
sc2–19生物量
32.74
23.33
0.00
45
0.03
0.00
17
3.6.2. sem和ftir分析
使用sem观察了arthrobacter sp. sc2–19细胞在cd2+吸附前后的形态变化。吸附前，细胞表现出紧密聚集、光滑的表面和规则的短杆状形态（图6a）。cd2+暴露后，细胞聚集减少，表现出延长的不规则杆状形态，有明显的分支、末端膨胀和含有颗粒沉积的表面突起（图6b）。 5.36 20.94 伪一级模型（图5c）的r2值高于伪二级模型（图5d）。从arthrobacter sp. sc2–19吸附数据拟合得到的动力学参数总结在表2中。从伪二级模型计算出的qe, cal值（40.03毫克 克）与实验测定的qe, exp值（32.74毫克 克）更为吻合，而从伪一级模型计算出的qe, cal值（23.33毫克 克）则不太吻合。 表2. arthrobacter sp. sc2-19生物量对cd2+的吸附动力学参数。 吸附剂 qe, exp (mg g) 伪一级动力学 qe, cal (mg g) k1 (1 min) qe, cal (mg g) k2 (g (mg?min)) sc2–19生物量 32.74 23.33 0.00 45 0.03 0.00 17 3.6.2. sem和ftir分析 使用sem观察了arthrobacter sp.>5.36
20.94
伪一级模型（图5c）的r2值高于伪二级模型（图5d）。从arthrobacter sp. sc2–19吸附数据拟合得到的动力学参数总结在表2中。从伪二级模型计算出的qe, cal值（40.03毫克/克）与实验测定的qe, exp值（32.74毫克/克）更为吻合，而从伪一级模型计算出的qe, cal值（23.33毫克/克）则不太吻合。

表2. arthrobacter sp. sc2-19生物量对cd2+的吸附动力学参数。
吸附剂
qe, exp (mg/g)
伪一级动力学
qe, cal (mg/g)
k1 (1/min)
qe, cal (mg/g)
k2 (g/(mg?min))
sc2–19生物量
32.74
23.33
0.00
45
0.03
0.00
17
3.6.2. sem和ftir分析
使用sem观察了arthrobacter sp. sc2–19细胞在cd2+吸附前后的形态变化。吸附前，细胞表现出紧密聚集、光滑的表面和规则的短杆状形态（图6a）。cd2+暴露后，细胞聚集减少，表现出延长的不规则杆状形态，有明显的分支、末端膨胀和含有颗粒沉积的表面突起（图6b）。>图中的红色箭头指示了细胞的主要形态变化。在Cd2?吸附前后，通过FTIR分析了Arthrobacter sp. SC2–19的表面官能团（图7）。在细菌吸附前后，特定吸收峰观察到了明显的蓝移和红移，表S2列出了光谱位移和相应的官能团鉴定结果。Cd2?生物吸附后，在3432.524、1630.22、1534.89、1304.87、1236.77和1041.56?cm?1处出现了显著的峰位移，这些位移对应于-OH、-NH和CO基团的伸缩振动以及N-H、P?=?O、-SO?和P-O键的弯曲振动。在552.02?cm?1处也观察到了一个峰位移，这对应于磷酸盐/硫酸盐基团。

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图7. Arthrobacter sp. SC2–19在Cd2+吸附前后的傅里叶变换红外光谱。

4. 讨论
4.1. Arthrobacter sp. SC2-19的筛选与表征
在本研究中，从重金属污染的土壤中分离出了三种具有高抗镉性的菌株：Paenarthrobacter nitroguajacolicus SC2–6、Arthrobacter sp. SC2–7和Arthrobacter sp. SC2–19。上述菌株在液体培养中的黏液状菌落外观和絮凝生长特征通常与EPS的产生有关（图1A）。先前的研究表明，由Arthrobacter ps-5产生的EPS可以有效吸附溶液中的Cd2?（Ye等人，2014年）。细菌可以在其细胞膜、细胞壁和EPS上固定Cd2?，从而防止Cd2?进入细胞并造成细胞损伤（Niu等人，2024年）。EPS是一种高分子物质，细菌在面对重金属毒性等环境压力时通常会生成它。其阴离子官能团、蛋白质、多糖和脂壁酸可以通过配位、离子交换和静电相互作用有效地将Cd2?固定在细胞外（Ma等人，2023年）。
在鉴定出的抗镉菌株中，Arthrobacter sp. SC2–19对CdCl?的抵抗力最强，其最小抑制浓度（MIC）为2900?mg/L。如表3所示，Arthrobacter sp. SC2–19的卓越抗镉性能明显优于同一属内的其他菌株。较高的重金属抗性通常伴随着更好的Cd2?去除效果。与此一致的是，基因工程菌株的MIC提高也伴随着镉去除能力的增强。在Escherichia coli BL21中异源表达烟草重金属结合蛋白后，其MIC增加了1.6倍，镉吸附能力增加了2.8倍（Li等人，2023年）。

表3. 不同菌株对Cd2?的最小抑制浓度值。

4.2. Cd2?吸附条件对Arthrobacter sp. SC2-19的影响
在含有20–100?mg/L Cd2?的溶液中，尽管总体去除效率有所下降，但Arthrobacter sp. SC2–19的单位生物量吸附能力逐渐增加。这种现象归因于生物量上结合位点的相对丰富度相对于溶液中Cd2?离子的浓度（Li等人，2023年）。当生物量上的可用结合位点数量超过Cd2?离子的数量时，单位生物量的吸附量会继续增加，直到这些位点饱和。然而，在结合位点总数不变的情况下，尽管单位生物量的吸附能力在较高初始污染物浓度下增加，但仍有大量Cd2?留在溶液中，导致总体去除效率下降。这一观察结果与其他关于微生物吸附剂的研究结果一致。例如，Cupriavidus necator GX_5（Li等人，2023年）和Agrobacterium tumefaciens S12（Liu等人，2024年）都表现出随着Cd2?浓度的增加而增加的Cd2?吸附能力，而它们的去除效率却呈现相反趋势。去除效率的下降归因于结合位点的逐渐饱和。
Arthrobacter sp. SC2–19的Cd2?去除效率随着生物量的增加而提高，但其吸附能力则呈现逐渐下降的趋势。这是因为随着Arthrobacter sp. SC2–19生物量的增加，Cd2?结合位点的总数也随之增加，从而增强了从溶液中去除Cd2?的效果（Cheng等人，2017年；Wang等人，2018年）。然而，当生物量浓度过高时，细胞会聚集，紧密堆积的细胞之间的屏蔽效应减少了Cd2?的可用结合位点数量，导致生物量的吸附能力下降（Hegazy等人，2023年）。Microbacterium sp. D2–2和Bacillus sp. c9–3在添加的生物量少于1?g/L时能有效吸附溶液中的Cd2?。超过这个生物量剂量后，由于细胞聚集，金属相互作用的表面积减少，溶液中Cd2?的去除率也随之降低（Long等人，2021年）。
pH是重金属生物吸附的关键因素，因为它影响Cd2?的化学形态和微生物表面官能团的质子化状态（Long等人，2021年；Mohapatra等人，2024年）。在强酸性条件下，过量的H?可能会与Cd2?竞争结合位点，从而降低去除效率。相反，在碱性环境中，Cd2?倾向于形成细菌无法结合的氢氧化物沉淀物（Liu等人，2023年）。然而，非生物控制实验显示，在测试的pH范围内溶解的镉含量没有显著下降（图S3），表明在本研究的实验条件下化学沉淀的贡献可以忽略不计。
菌株SC2–19对Cd2?的去除效率强烈依赖于pH值，在pH 5时达到最大值（53.24%），而在pH 9时降至20.06%。这一趋势与细胞表面官能团（如羧基和氨基）的离子化状态随pH变化而变化一致，这些变化可以调节表面电荷和Cd2?的结合位点可用性（Ma等人，2023年；Liu等人，2023年）。随着pH值的增加，表面官能团的形态和静电相互作用与配位/离子交换过程之间的平衡可能会发生变化，从而减弱有效的Cd2?结合并降低总体去除效率。这些结果表明，pH主要通过调节细胞壁官能团的反应性和它们对金属离子的亲和力来影响Cd2?的吸收。对Arthrobacter protophormiae的研究显示，在酸性pH 6下，由于羧基和磷酸基团的部分离子化（Wan等人，2016年），Bacillus cereus C9在pH从7降至4的过程中表现出Cd2?吸附能力从0.11?mg/g增加到3.31?mg/g（Liang等人，2025年）。
在吸附初期，Cd2?离子与细胞表面的吸附位点（如EPS或细胞壁）结合，这促进了去除效率的提高。随着接触时间的延长，去除效率逐渐上升，直到达到饱和。这可能是由于细胞表面吸附位点的逐渐饱和，随后Cd2?被吸收进入细胞并在其中被金属结合蛋白螯合（Wang等人，2024年）。因此，Arthrobacter sp. SC2–19对Cd2?的有效吸附受到初始Cd2?浓度（20?mg/L）、生物量剂量（6?g/L）、溶液pH（5）和接触时间（120?min）等关键参数的影响。这些因素对吸附过程的影响表现出非线性特征，表明Arthrobacter sp. SC2–19生物体的生物吸附过程涉及复杂的、多方面的机制。

4.3. Arthrobacter sp. SC2-19在镉污染土壤中的潜在应用
土壤中的镉以EXE、CAB、FMO和RES等形式存在（Huang等人，2023年）。其中，FMO、OM和残留部分生物可利用性较低，因此对环境的威胁较小（Tu等人，2020年）。相反，可交换型和CAB型代表主要的生物可利用形式，它们常常会释放自由的Cd2?离子到环境中，导致生态系统污染（Meng等人，2018年）。经过Arthrobacter sp. SC2–19处理后，受污染土壤中的可交换型和FMO型镉含量减少，而CAB、OM和RES型含量增加，表明镉从更不稳定的形式转变为更稳定的形式，从而降低了镉再移动的风险。此外，在灭菌后的土壤中没有观察到微生物生长（图S1），并且在实验过程中也没有观察到微生物生长的迹象。这些观察进一步支持了观察到的变化主要是由Arthrobacter sp. SC2–19引起的，突显了该菌株在土壤修复方面的巨大潜力。
细菌可以通过有机酸分泌、EPS产生和氧化还原电位调节等机制促进土壤中Cd2?的转化（Zheng等人，2021年）。特别是有机酸（如草酸、苹果酸和柠檬酸）可以螯合Cd，并从无机磷相中释放磷酸盐，从而增加可能参与镉配位和/或共沉淀的阴离子的可用性（Wan等人，2016年；Xu等人，2018年）。有机酸中的阴离子和磷酸根离子通过配位与Cd2?共沉淀，形成不溶性的镉化合物，有助于将生物可利用的可交换型镉转化为土壤中的稳定OM和残留部分（Zheng等人，2021年）。此外，Arthrobacter spp.分泌大量的EPS，其表面官能团（如羧基和磷酸基）与Cd2?形成稳定的复合物（Li等人，2015年），有效减少了土壤中的可交换型镉。
为了提高微生物在复杂实际环境中的镉去除稳定性和效率，细菌固定化是一种可行的策略，可以在多种修复场景中实现长期稳定的性能。已建立的固定化技术包括吸附、包埋、基于纤维素的载体和凝胶封装，可以提高微生物在污染环境中的抗性，提高去除效率并减少微生物损失（Bouabidi等人，2019年）。将Bacillus megaterium固定在玉米秸秆生物炭上显著提高了土壤中的镉固定效率，减少了土壤中镉的移动性（Qi等人，2023年）。在藻酸钠和氯化钙凝胶系统中固定微藻后，它们有效地从废水中去除了90%的Cd2+（Li等人，2024年）。即使在没有外源营养的情况下，Arthrobacter sp. SC2–19也能在土壤中存活一段时间，这增强了该菌株在实际应用中的潜力（图S4）。未来，可以采用各种固定化系统来固定Arthrobacter sp. SC2–19，并根据环境条件开发多种应用策略。

4.4. Arthrobacter sp. SC2-19对Cd2?吸附的等温线和动力学研究
使用Langmuir和Freundlich两种等温线模型对Arthrobacter sp. SC2–19生物体在液体介质中对镉离子的吸附亲和力和容量进行了数据拟合（Liu等人，2022年；Yao等人，2022年）。Langmuir模型假设细菌生物体表面是均匀的，具有固定数量的相同结合位点，并且吸附的金属离子之间没有相互作用，通常描述了在特定、均匀位点上的单层吸附（Yao等人，2022年）。Freundlich等温线模型描述了在异质表面或具有不同亲和力的位点上的多层吸附，适用于具有多种活性位的异质吸附系统（Mohapatra等人，2024年）。
在我们的研究中，与Langmuir模型相比，Freundlich模型提供了更好的拟合（R2值更高），表明Arthrobacter sp. SC2–19上的Cd2?结合更符合异质表面相互作用（Mohapatra等人，2024年）。Freundlich等温线的特征参数为KF和n，其中KF代表Arthrobacter sp. SC2–19对金属离子的吸附容量，n反映了生物体与金属离子之间的异质性，表明吸附的化学性质。较高的n值表示吸附剂与吸附物之间的相互作用更强。参数（KF 5.36?L1/n?mg1?1/n/g，n 2.0?>1）表明Arthrobacter sp. SC2–19与金属离子之间的相互作用更强。SC2–19生物质在高浓度梯度下仍保持有效的Cd2?生物吸附能力，这表明吸附过程是在非均匀表面上发生的多层吸附而非单层吸附（Mohapatra等人，2024年）。生物吸附的异质性源于细菌细胞膜、细胞壁和EPS（胞外多糖）对Cd2?的不同吸附能力（Zhang等人，2024年），以及细胞对Cd2?的摄取途径的差异（Mohapatra等人，2024年）。为了阐明Arthrobacter sp. SC2–19生物质对Cd2?的摄取机制，使用了伪一级和伪二级动力学模型来描述Cd2?与生物质结合位点之间的相互作用（Li和Zhou，2018年）。在ln (qe-qt)与t的线性图中，随着反应时间的增加，qt逐渐趋近于qe；因此，该方程仅用于分析Arthrobacter sp. SC2–19生物质在达到平衡之前的吸附过程。在动力学建模中，尽管伪一级模型得到了更高的R2值，但从伪二级模型得出的qe值更接近实验值qe, exp。这些结果表明，伪二级模型能更准确地描述Arthrobacter sp. SC2–19生物质对Cd2?的生物吸附过程，表明化学吸附可能在吸附速率控制步骤中起主导作用。这种模式与Freundlich等温线所描述的异质吸附特性一致。此外，Arthrobacter sp. SC2–19的生物吸附动力学还表明，Cd2?在生物质上的吸附速率更多地依赖于结合位点的数量及其作用方式，而不是Cd2?的浓度。综上所述，Arthrobacter sp. SC2–19对Cd2?的吸附是一个复杂的过程，主要由化学吸附主导，涉及细菌表面功能基团之间的配位和离子交换。

4.5. 使用SEM和FTIR分析Arthrobacter sp. SC2-19在Cd2?吸附过程中的变化
为了进一步研究Arthrobacter sp. SC2–19的吸附机制，从细胞微观结构和参与Cd2?结合的化学结构的角度出发，使用SEM和FTIR技术观察了Cd2?吸附前后的细菌细胞。Cd2?吸附后，Arthrobacter sp. SC2–19细胞的形态发生了显著变化，表现为细胞表面黏液物质明显增加、细胞间形成分支状粘连、顶端膨胀以及部分细胞表面收缩和聚集（图6B）。这些结果表明，Cd2?应力显著改变了细胞壁/膜的结构，这些形态变化可能与Cd2?的抗性机制和生物吸附行为有关（Liu等人，2024年）。在Arthrobacter sp. SC2–19吸附镉的过程中，细胞表面的多种配体（包括羟基、氨基、磷酸基和硫酸基）与镉发生相互作用。CO和N-H伸缩振动主要发生在酰胺I和酰胺II基团中，而-OH伸缩和N-H弯曲振动可能来源于多糖（Li等人，2019年；Li等人，2015年）。P=O、P-O和-SO?弯曲模式主要归因于磷脂双层和蛋白质基质（Ali等人，2022年；Kasprzyk等人，2018年）。这些配体通常来源于细胞壁或EPS中的蛋白质、细菌外多糖和脂肪酸的结构成分（Zhang等人，2024年）。根据这些发现，Arthrobacter sp. SC2–19对镉离子的吸附主要是通过细胞外聚合物、膜蛋白和磷脂表面的功能基团来实现的。这些可离子化的结构成分生成负电荷的功能基团（如羟基、酰胺基、磷酸基或硫酸基），通过配位、离子交换或静电吸引将Cd2?结合到细胞表面（Mohapatra等人，2024年）。在类似的研究中，也观察到了类似的现象，例如Arthrobacter protophormiae（Wan等人，2016年）、Pseudomonas sp. 375菌株（Xu等人，2020年）和Cupriavidus necator GX_5（Li等人，2023年），进一步证实了氨基、羟基和磷酸基等功能基团在Cd2?吸附中的重要作用。

5. 结论
在这项研究中，我们分离出了细菌菌株Arthrobacter sp. SC2–19，该菌株对CdCl?具有高抗性，最低抑制浓度为2900 mg/L，并且具有显著的Cd2?吸附能力，同时具有广泛的环境适应性。Cd2?的去除效率受到初始Cd2?浓度、生物质剂量、pH值和接触时间等因素的影响。在测试条件下（pH 5，1 g/L生物质），SC2–19菌株在60分钟内从60 mg/L的溶液中去除了53.23%的Cd2?。在受镉污染的土壤（5 mg/kg）中，应用SC2–19菌株后，可交换镉的比例降低了25.48%，而残留镉的比例增加了13.36%。机制分析表明，Arthrobacter sp. SC2–19对Cd2?的生物吸附涉及异质表面相互作用，细胞表面和细胞外物质的关键功能基团促进了多层吸附。总体而言，Arthrobacter sp. SC2–19在实验室条件下表现出优异的Cd2?去除和土壤修复潜力，显示出其作为重金属污染生物修复候选者的潜力。未来的研究需要评估其在更复杂环境条件下的表现以及联合污染条件下的效果。

作者贡献声明：
Xin Yang：可视化、方法学、研究、数据管理。
Li Tan：研究、数据管理。
Lincheng Zhang：监督、研究。
Cen Li：写作——审阅与编辑、写作——初稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。
Shuai Yang：写作——审阅与编辑、写作——初稿、可视化、软件应用、正式分析、数据管理、概念化。
Tingting Huang：研究、数据管理。
Lingwei Yuan：研究、数据管理。
Yu Tang：研究、数据管理。
Shuoqiu Tong：监督、研究。
Jin Jing：监督、研究。
Shengyuan Zhang：研究、数据管理。
Yongjun Wu：写作——审阅与编辑、监督。