Tralopyril的跨代毒性：铁死亡（Ferroptosis）导致Oryzias melastigma的生殖和骨骼系统受损

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Transgenerational toxicity of Tralopyril: Ferroptosis mediates reproductive and skeletal disruption in Oryzias melastigma

　　刘斌|李腾洲|王存龙|曾边豪|尹海阳|刘玲|李平|李志华
山东大学海洋学院，威海，山东，264209，中国

**摘要**
Tralopyril是一种已知的内分泌干扰化学物质，会干扰甲状腺激素系统。我们使用Oryzias melastigma建立了完整的生命周期暴露和多代模型（F0-F3），以研究tralopyril的生殖和骨骼毒性。结果表明，tralopyril会导致性腺成熟受阻、性激素水平异常以及HPG轴基因表达改变，并表现出性别特异性的反馈模式。胶原蛋白的积累和Cathepsin K的激活表明存在跨代骨基质失衡。在F1-F2幼体中，bmp4和col2a1a的表达下调与颅面骨骼畸形和矿化延迟有关。甲状腺激素水平的波动以及tshβ的表达上调与骨骼毒性相关，而erβ表达的增加则提示雌激素介导的骨骼效应。亲代激素谱与后代的骨骼表型有很强的相关性，表明存在多代内分泌干扰。此外，组织中铁和谷胱甘肽水平的异常以及fth1表达的增加表明铁死亡（ferroptosis）可能参与了多代毒性。这些发现突显了tralopyril的持续生态风险，强调了需要加强对新兴污染物的监管。

**1. 引言**
水生生态系统的可持续性与鱼类的生殖健康密切相关，而鱼类生殖健康正日益受到新兴污染物的威胁。其中，海洋防污剂会渗入沿海水域并干扰鱼类的内分泌功能，从而降低种群的恢复力。Tralopyril是一种普遍存在但研究不足的溴化吡咯类防污剂，具有高生物累积潜力和对非目标生物的急性毒性[1]、[2]、[3]。由于在港口、造船厂和水产养殖区的广泛使用（预测的环境浓度（PEC）高达0.714 μg/L），它可能在水生环境中持续累积[4]。生殖内分泌系统是控制鱼类生殖行为和性腺成熟的核心调节轴，在种群可持续性和生态平衡中起着关键作用[5]。越来越多的证据表明，环境污染物——特别是内分泌干扰化学物质（EDCs）会干扰下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，导致激素失衡、性腺畸形和繁殖力下降，从而威胁水生种群的更新和生态系统的稳定性[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。重要的是，传统的毒性评估方法无法捕捉到这类污染物的跨代效应[11]，这为沿海水质管理带来了监管空白。

鱼类的骨骼系统对于维持身体结构、游泳性能和觅食行为至关重要，因此在个体生存和种群繁衍中起着关键作用[12]。骨骼发育、矿化和重塑受到多种内分泌因素的严格调控，其中甲状腺激素在介导早期骨骼分化和矿化方面尤为重要。甲状腺激素水平的失调已被直接与骨骼畸形和功能障碍联系起来[13]。此外，雌激素及其受体（如ERα和ERβ）对骨骼稳态和成骨调节至关重要[14]。这些激素途径协同作用以保持骨骼完整性。随着环境污染的加剧，一些EDCs（如双酚A）已被证明会干扰甲状腺和雌激素信号通路，从而带来潜在的骨骼毒性风险[12]、[15]。然而，尽管它们具有共同的调节机制，但生殖毒性和骨骼毒性很少同时进行评估[16]、[17]，其潜在的相互作用仍不甚明了。鉴于像三丁基锡这样的防污剂已导致广泛的种群崩溃[16]，了解tralopyril的跨代毒性对于生态风险评估至关重要[18]。

铁死亡反应是水生生物暴露于污染物的敏感指标，但其在多代毒性中的作用仍需进一步探索[19]、[20]。我们之前的研究发现，铁稳态和谷胱甘肽（GSH）代谢的紊乱是tralopyril在海洋青鳉中引起应激的标志。此外，对F0代的全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）显示，tralopyril还会导致海洋青鳉的表观遗传学紊乱，改变对正常生长至关重要的基因表达谱。因此，我们假设tralopyril引起的生物毒性可能具有跨代效应，铁死亡可能是其中的一种机制[21]。为了验证这一假设，我们量化了关键生物标志物，包括组织中铁积累、GSH耗竭和铁蛋白重链1（fth1）在四代（F0-F3）中的表达，作为细胞应激和跨代毒性的综合指标[20]、[22]。

在本实验中，F0代海洋青鳉在整个生命周期内暴露于1 μg/L和10 μg/L的tralopyril中，而F1-F3代则未暴露于tralopyril。我们建立了一项全面的多代研究，以评估tralopyril对海洋青鳉的跨代影响，具体包括：（1）生殖健康（F0-F2成体的性腺组织病理学、激素水平、HPG轴基因）；（2）骨骼完整性（矿化、胶原蛋白代谢、HPT/雌激素信号传导）；（3）行为适应性（幼体游泳性能）；（4）铁死亡指标（组织中铁、GSH、fth1）。通过综合生物标志物响应（IBR）指数整合表型和分子响应，建立了环境风险评估的定量阈值。这种方法提供了可操作的数据，以支持针对海洋生态系统中防污剂污染的监管策略。

**2. 材料与方法**
2.1. 暴露实验
根据已建立的实验设计，暴露浓度维持在1 μg/L和10 μg/L。1 μg/L的浓度对应于海洋生态系统中tralopyril的预测环境浓度（PEC），而10 μg/L的高浓度（LC50的1/50[21]）是基于暴露时间和起始点选择的，模拟潜在的污染积累区域（例如，水交换不良的码头，反复使用防污剂和有限的水交换可能导致浓度暂时升高）。然而，这种高浓度在开放沿海水域中的实际频率和空间范围仍不确定，需要进一步的环境监测。

每天中午前收集受精卵。使用立体显微镜（SZ810，Cnoptec，中国）检查胚胎发育阶段，并选择正常发育的桑椹胚阶段胚胎进行tralopyril暴露。胚胎被放置在培养皿中直至孵化，每个浓度组有10个培养皿，每个培养皿含有80个健康胚胎。每天计数并移除死亡胚胎。孵化后，幼体被放置在2 L烧杯中继续暴露，30天后转移到15 L玻璃水箱中进一步暴露。每个浓度组至少包括5个玻璃水箱，每个水箱不超过75条鱼。暴露水每天完全更换。暴露195天后，根据次级性特征对F0代成体进行性别鉴定，在冰板上安乐死，并解剖以收集性腺、大脑和肌肉组织。所有程序和动物处理均遵循中国实验动物科学学会和山东大学动物伦理委员会的指南（文本S1）。剩余的F0代成体（雄性与雌性比例为1:1，每组30条鱼）被转移到新的15 L玻璃水箱中（每组5个重复），其中含有无tralopyril的清洁海水用于产卵。收集F1代胚胎，并根据Liu等人的方法[23]计算繁殖力。F1代胚胎被放置在培养皿中孵化，然后按照F0代的相同程序将幼体转移到玻璃水箱中。在清洁海水中饲养6个月后，以与F0代相同的方式对F1代鱼进行采样。F2代胚胎由F1代成体产生，采用相同的程序，在清洁海水中饲养6个月后，在成年期进行采样。F3代胚胎由F2代成体产生，后续过程与F1和F2代相同。对于F1至F3代胚胎，连续4天收集后代胚胎，卵产量定义为每条雌鱼每天的平均产卵数。每天记录孵化胚胎的数量，直到第21天，并根据先前的方法[24]计算孵化率。

2.2. tralopyril浓度的测定
水样中tralopyril浓度的测定遵循先前的研究方法[23]（n = 3）。对于海洋青鳉生物组织中的tralopyril浓度，我们准确称量鱼肉或胚胎样本（n = 3），加入5倍体积的乙腈，在冰水浴中匀浆，涡旋30秒，静置10分钟，以12000 r/min离心10分钟，然后取上清液进行测定。详细步骤请参见文本S1。

2.3. 性腺组织切片
样本在4%甲醛中浸泡过夜，然后通过一系列乙醇梯度脱水。脱水后的组织被包埋在石蜡中，并使用旋转切片机切成5 μm厚的切片。组织切片用苏木精和伊红（H&E）染色，染色后通过显微镜进行组织病理学检查（n = 3）。

2.4. 生化参数测定
使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Chundu，武汉，中国）检测性激素E2（CD-JZ90031）和T（CD-JZ90048）、甲状腺激素T3（CD-JZ90100）和T4（CD-JZ90063）、Cathepsin K（CD-JK60670）以及I型和II型胶原蛋白（CD-JK90010，CD-JK90286）的水平。性激素和甲状腺激素的测定使用海洋青鳉的全身肌肉组织匀浆进行。同时，Cathepsin K和I型及II型胶原蛋白的测定使用海洋青鳉的骨骼组织匀浆进行。详细信息见表S2和文本S2。使用市售试剂盒（Jiancheng，南京，中国）测定海洋青鳉大脑、性腺和骨骼组织中的铁含量（A039–2-1）和GSH（A006–2-1）水平。总蛋白含量使用BCA方法（A045–4-2）（Jiancheng，南京，中国）测定，所有上述指标均归一化到总蛋白含量。所有上述生物标志物的测定均进行了3次生物重复。

2.5. 海洋青鳉的骨骼染色
15 dpf的幼体在4%甲醛中浸泡过夜（n = 19）。整体骨骼染色按照实验室建立的方法进行，包括Alcian blue软骨染色和Alizarin red染色。详细步骤请参见文本S3。

2.6. 行为记录与分析
对于游泳行为，随机选择15 dpf的幼体并转移到6孔板中，每个孔放置一条幼体。适应30分钟后，在连续可见光下使用运动相机（IDS，德国）记录15分钟的自由游泳行为。每组记录20条幼体，每条鱼视为一个生物重复。使用Lolitrack软件（Loligo? Systems，Lolitrack4，丹麦）分析每条鱼的游泳行为参数，持续3分钟[23]。

2.7. 实时定量PCR
对于关键基因表达水平，进行实时定量PCR（RT-qPCR）（n = 3）。具体程序与先前描述的一致[25]（文本S5）。引物序列（表S1）通过参考文献获得或使用NCBI Primer-BLAST设计。基于先前的研究，18S在海洋青鳉的不同组织和代际中表现出稳定的表达[26]。因此，选择18S作为参考基因，并通过实验验证进一步确认其稳定性。相对表达水平使用2?△△Ct方法计算。

2.8. 统计分析
使用IBM SPSS Statistics 23.0对获得的数据进行统计分析。首先进行正态性和方差同质性测试。方差分析（ANOVA）用于比较多个组之间的差异。当条件满足时，使用Dunnett的多重比较测试分析组间差异；当条件不满足时，使用非参数测试（Krustal-Wallis测试）分析组间差异。t检验用于比较两组之间的差异，例如雌鱼与雄鱼。皮尔逊相关系数用于相关性分析。使用多元线性回归分析评估骨骼特征与游泳性能之间的关系。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

IBR指数使用Sanchez等人[27]描述的修订版IBR v2方法计算和评估。生化IBR基于胶原蛋白含量（COL1和COL2）、组织中铁水平和谷胱甘肽（GSH）水平等生物标志物计算。计算程序的详细描述，包括生物标志物标准化和加权方案的各个步骤，见文本S4。

**3. 结果与讨论**
3.1. 环境生物累积和跨代转移
结果显示，暴露水样中实际的1 μg/L浓度为1.05 ± 0.08 μg/L，实际的10 μg/L浓度为10.88 ± 0.30 μg/L。所有浓度都在名义范围内，并符合OECD化学测试指南的要求[28]。在完整生命周期暴露后，测量了成年海洋青鳉组织中的tralopyril残留浓度（表1）。在1 μg/L处理组中，浓度分别为62.00 ± 14.11 ng/g和53.00 ± 10.50 ng/g；在10 μg/L处理组中，浓度分别为118.50 ± 22.47 ng/g和105.50 ± 4.27 ng/g。虽然数据表明雌鱼的累积趋势较高，但统计上这种差异不显著。此外，在F1代胚胎中也检测到tralopyril残留，浓度分别为18.83 ± 5.51 ng/g和42.50 ± 18.25 ng/g。F2和F3代没有测量浓度。这些发现突显了对特拉洛吡林（tralopyril）持久性的担忧，特别是考虑到其在沿海水域中的预测环境浓度（0.7 μg/L）可能对跨代遗传产生的影响[4]。3.2. 特拉洛吡林对多代繁殖的影响鉴于生殖系统中性腺的关键作用，其正常功能的改变被广泛认为是评估内分泌干扰化学物质（EDCs）生殖毒性的重要指标[11]。适当的卵子发育和成熟对鱼类的成功繁殖至关重要，这是水生种群可持续性的关键因素[29]。如图1A所示，F0代雌鱼的性腺组织中核周卵子（PO）的比例增加，成熟卵子（MO）的比例减少，以及闭锁卵泡（FA）的比例升高，表明性腺成熟受到损害。F1代雌鱼在不含特拉洛吡林的清洁海水中继续饲养直至性成熟，性腺发育指数显示出不同的趋势。PO和CAO的比例均下降，而MO和FA的比例上升（图1B）。这表明F1代成鱼的性腺成熟加速，与F0代观察到的趋势相反。进一步观察F2代雌鱼发现，与对照组相比，PO和CAO的比例没有显著变化（p > 0.05），但EVO比例下降，而MO和FA的比例上升，尤其是在10 μg/L组中，FA比例从F0代的6.10%增加到10.89%（图1C）。这种模式表明特拉洛吡林暴露会破坏海洋青鳉的繁殖能力，对种群更新和生态系统稳定性产生影响。F1和F2代雌鱼观察到的性腺成熟加速可能反映了对其父母代繁殖抑制的补偿反应。然而，这也可能表明繁殖周期缩短，这可能带来长期的生态风险[30]，[31]。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图1. 雌性性腺组织学和卵子比例（n = 3）：(A) F0代，(B) F1代，(C) F2代。PO指核周卵子，EVO指早期卵黄发生卵子，CAO指皮质泡状卵子，MO指成熟卵子，FA指闭锁卵泡。条形图表示卵子的比例。(D) F0代雄鱼的性腺组织切片和精子细胞比例（n = 3）。条形图表示精子细胞的比例。*P < 0.05；**P < 0.01。此外，卵子发育过程中的卵泡闭锁会损害卵子的正常成熟和排卵，导致鱼类繁殖力下降和不良繁殖结果[32]。例如，据报道，接触氟苯脲（diflubenzuron）会抑制海洋青鳉的卵子发育和排卵，对繁殖成功和种群稳定性产生负面影响[29]。同样，卡巴里尔（carbaryl）已被证明会诱导过度卵泡成熟，并显著增加闭锁卵泡的比例，从而损害海洋青鳉的繁殖表现[5]。从F0代到F2代，FA比例的持续增加表明即使在性腺成熟加速的情况下，退行性特征如卵泡闭锁仍然存在，表明毒性效应可能是不可逆的[29]。这些效应可能与氧化应激和细胞死亡途径（如铁死亡）的激活机制有关。在雄性个体中，性腺的组织学观察结果见图1D和图S1。在F0代，精子和精原细胞的比例呈上升趋势，尽管没有统计学意义。然而，精原细胞的比例显著下降，表明特拉洛吡林暴露通过加速早期精原细胞分化为更成熟的生殖细胞来促进睾丸成熟。虽然在F1和F2代雄性中也观察到了类似的趋势，但差异没有统计学意义，表明特拉洛吡林对雄性性腺成熟的影响相对较轻。相比之下，F0代雄性性腺唯一观察到的变化是精原细胞比例的下降，这可能归因于雄性较短的生精周期和更强的补偿能力。雌性性腺对特拉洛吡林的显著敏感性可能与雌激素信号在调节卵子成熟中的主导作用有关。水生生物的繁殖能力与种群密度维持和水生生态系统的稳定性密切相关[33]。许多环境污染物，特别是如阿特拉津（atrazine）、甲氧氯（metolachlor）和二甲氧虫酯（dimethoate）等杀虫剂，已被证明会显著损害栖息在淡水和海洋环境中的鱼类和其他脊椎动物的生育能力[34]，[35]。从F0代到F1代（图2A，B），特拉洛吡林暴露导致雌性繁殖力显著下降，包括产卵量减少、卵子直径减小和孵化成功率降低，对种群再生构成重大威胁[5]。F1代雌鱼的繁殖能力呈下降趋势。尽管F2代的繁殖力部分恢复（图2C），但后代质量（如卵子直径和孵化率）仍显著受损。在F3代，胚胎卵子直径和孵化率进一步下降。这可能表明了一种权衡策略，即增加的产卵量补偿了个体后代的存活率下降。作为卵黄储备和胚胎发育能力的指标，卵子直径的减少表明由于母体内分泌紊乱导致卵泡质量控制受损。同时，孵化率的下降直接反映了胚胎对发育干扰的脆弱性增加，可能加速种群衰退。这些发现与性腺组织中观察到的组织学变化一致，表明异常的性腺成熟会损害配子的质量，导致多代繁殖能力和后代存活率的下降[29]，[36]。下载：下载高分辨率图像（406KB）下载：下载全尺寸图像图2. (A) 特拉洛吡林对F0-F2代多代繁殖的影响，包括繁殖力、卵子直径和孵化能力（n = 3）：(A) F0代，(B) F1代，(C) F2代。*P < 0.05；**P < 0.01。性类固醇激素在鱼类的性腺分化和生殖成熟中起着关键作用，类固醇生成相关基因的表达直接影响繁殖能力[11]。激素水平是评估生殖功能的重要生物标志物[37]。异常的激素水平可能导致繁殖周期紊乱、产卵失败或后代质量下降。作为内分泌干扰的直接指标，它们在特拉洛吡林暴露后从F0代到F2代表现出显著波动[11]。在F0代，雄性和雌性的E2和T水平均显著升高（图3），可能是对化学暴露的生理应激反应。具体来说，在1 μg/L浓度下，雌性的E2和T水平分别增加了0.98倍和0.99倍，而雄性分别增加了0.14倍和0.35倍（p < 0.01）。在海洋青鳉暴露于100和1000 ng/L的丙环唑（prochloraz）180天后也观察到了类似的T水平升高[38]。此外，E2对雌性卵子成熟至关重要，循环雌激素水平的波动可能对后代产生不利影响，可能导致跨代毒性[39]。下载：下载高分辨率图像（646KB）下载：下载全尺寸图像图3. 机制示意图。斜体文字表示基因名称。方形热图表示转录水平，圆形热图表示生化水平（n = 3）。*P < 0.05；**P < 0.01。在通过母体传递间接暴露于特拉洛吡林的F1代个体中，性激素水平出现异常升高，雄性的E2水平和雌性的T水平升高。在雄性中，E2水平增加到对照组的1.39倍和1.35倍，而在雌性中，T水平增加到对照组的1.28倍和1.69倍。在F2代成鱼中，雌性和雄性的E2和T水平均显著升高（p < 0.05）。在1 μg/L浓度下，雌性的E2和T水平分别增加到对照组的1.44倍和1.49倍；在10 μg/L浓度下，分别增加到1.49倍和1.45倍。同样，在雄性中，这些水平在1 μg/L浓度下分别增加到1.31倍和1.25倍，在10 μg/L浓度下分别增加到1.64倍和1.72倍，这与F0代观察到的激素变化相似。结果表明，尽管F1和F2代没有持续暴露于该污染物，特拉洛吡林对性激素水平的干扰具有跨代效应，持续影响各代的生殖内分泌系统。在F2代中，随着特拉洛吡林浓度的升高，性激素水平也升高。性激素的异常升高表明HPG轴的负反馈调节受到干扰。通常，激素水平的升高会触发反馈抑制以减少进一步的激素产生。然而，这些暴露的鱼类缺乏这种反馈，表明激素反馈回路受到破坏。激素变化还表现出性别特异性模式。例如，在F1代中，雄性的T水平较高，雌性的E2水平较高，表明雌激素和雄激素信号在F1代可能受到特拉洛吡林暴露的不同影响。到F2代时，变化与F0代一致，两种激素均升高，显示出更明显的跨代毒性。为了进一步评估特拉洛吡林的潜在女性化或男性化效应，计算了雌二醇与睾酮（E2/T）的比例（表S3）。在暴露于1 μg/L的F0代雄性中，E2/T比例显著增加了0.23倍，表明直接暴露的父母代有向女性化的趋势[40]。相反，在暴露于10 μg/L的F1代雌性中，E2/T比例显著下降了0.26倍，表明第一代后代出现了补偿性转变或向男性化的转变。其他组没有观察到显著变化。这些特定于代际和性别的E2/T比例变化，而不是普遍的不平衡，表明特拉洛吡林的主要内分泌干扰机制可能不是经典的雌激素或雄激素受体激动剂/拮抗剂。需要进一步研究来探讨不同暴露浓度下这些激素比例变化的机制及其与生殖健康的关系。HPG轴长期以来一直是研究内分泌干扰化学物质（EDCs）对内分泌途径相关基因表达影响的宝贵框架，并阐明其在鱼类中的潜在分子机制[41]。性激素水平的变化与HPG轴上基因表达的变化密切相关[29]。作为生殖内分泌系统的核心调节途径，HPG轴涉及关键基因，如mgnrh、fshβ和lhβ，这些基因在各个世代中均表现出显著的表达变化（图3）。在F0代雌性中，fshβ和lhβ的转录水平显著上调（p < 0.05）。具体来说，在1 μg/L和10 μg/L组中，fshβ的表达分别增加了2.66倍和1.20倍，而lhβ的水平分别增加了3.39倍和2.86倍。这些结果表明，特拉洛吡林暴露诱导了F0代雌性的促性腺激素表达，可能是对受抑制的性腺发育的补偿性反馈机制。在F0代雄性中，mgnrh的转录在1 μg/L组显著下调至0.73倍（p < 0.05）。然而，与雌性类似，fshβ和lhβ在1 μg/L和10 μg/L组中均显著上调（p < 0.05）：fshβ分别增加了2.72倍和2.65倍，lhβ分别增加了1.56倍和2.87倍。尽管GnRH合成部分受到抑制，但促性腺激素的表达仍然过度激活，表明特拉洛吡林可能通过不同机制调节HPG轴。在F1代中，基因表达谱表现出显著的性别特异性差异。在暴露于10 μg/L的雌性中，mgnrh和lhβ的转录水平分别增加了1.36倍（p > 0.05）和2.24倍（p < 0.01）。相反，在1 μg/L和10 μg/L组中，fshβ分别显著下调至0.62倍和0.66倍（p < 0.01）。这种模式表明促性腺激素反馈调节受到干扰，可能是由于lhβ的短暂过度激活引起的负反馈。相比之下，F1代雄性的lhβ显著抑制，分别在1 μg/L和10 μg/L组中下调至0.32倍和0.35倍（p < 0.01）。在F2代中，性别特异性的调节模式持续存在。在雌性中，10 μg/L组中的mgnrh水平保持升高（2.85倍，p < 0.05）。然而，下游的促性腺激素受到抑制：fshβa在1 μg/L组中下调至0.73倍，lhβ在1 μg/L和10 μg/L组中分别下调至0.73倍和0.49倍。在F2代雄性中，显著的变化仅限于1 μg/L组，其中mgnrh下调至0.32倍（p < 0.05），而fshβ上调至1.84倍（p < 0.05）。这些发现进一步突显了促性腺激素在不同代际间具有明显的性别特异性调控机制。除了脑组织外，还测量了与类固醇合成和转化相关的五个关键基因在生殖腺组织中的表达水平，以探讨特拉洛吡林（tralopyril）对类固醇生成途径的干扰作用。这些基因包括芳香化酶（cyp19a）、17α-羟化酶（cyp17a）、胆固醇侧链裂解酶（cyp11a）、类固醇生成急性调节蛋白（star）和3β-羟基类固醇脱氢酶（3βhsd）。在F0代雌性鱼类中，这些基因（cyp19a、cyp17a、cyp11a、star、3βhsd）的表达表现出双相剂量-反应效应：在低浓度特拉洛吡林下被激活，但随着浓度增加出现反馈抑制。在F0代雄性鱼类中，cyp11a的表达显著降低了0.40倍（p < 0.05），而在10 μg/L浓度下star的表达显著增加了2.13倍（p < 0.05），表明类固醇合成的早期转运步骤被激活，但下游途径中的酶活性受到明显抑制。在F1代雌性鱼类中，cyp19a、cyp11a和3βhsd的表达显著下调（p < 0.05），表明芳香化酶活性和类固醇生成能力减弱。具体来说，在10 μg/L浓度下，cyp19a和cyp11a的水平分别降至对照组的0.62倍和0.42倍；3βhsd的转录在1 μg/L和10 μg/L组中分别下调至0.68倍和0.60倍。在F1代雄性鱼类中，观察到反馈调节的紊乱：cyp19a的转录分别显著上调了1.71倍和1.66倍（p < 0.05），而star的水平在1 μg/L和10 μg/L组中分别显著下调至0.57倍和0.47倍（p < 0.05）。在F2代中，暴露于10 μg/L的特拉洛吡林显著下调了雌性和雄性鱼类中cyp17a、cyp11a和star的表达。相比之下，cyp19a的表达在雌性中下调至0.38倍（p < 0.05），而在雄性中上调至2.21倍（p < 0.01）。这些发现表明，芳香化酶表达的性别特异性改变可能是观察到的性激素水平异常的关键分子基础。

在雌性鱼类中，由HPG轴产生的激素在卵细胞发育中起着关键作用。GnRH是HPG网络的初始步骤，调节促性腺激素FSH和LH的合成和释放，并调节与类固醇生成途径和配子发育相关的基因的表达[37]。文献报道指出，促卵泡激素（fshβ）是一种调节雄性精子生产和雌性卵子生产的激素。在生殖腺中，生殖腺激素通过一系列酶催化的反应合成[42]。Star参与卵细胞成熟和排卵的调节，以及鱼类卵巢中的类固醇激素生产[43]。芳香化酶（cyp19a）负责将雄激素转化为雌激素，其表达的变化直接影响E2水平，进而影响卵细胞的发育和成熟[29]。在F0代成年鱼类中，持续暴露于特拉洛吡林导致脑组织中fshβ和lhβ的显著上调，尤其是在雌性中，表明特拉洛吡林激活了促性腺激素的合成途径。相反，在高浓度暴露下，生殖腺组织中类固醇生成酶如cyp11a、cyp17a和3βhsd的表达受到抑制，可能是由于特拉洛吡林引起的内分泌干扰导致负反馈调节紊乱[44]。尽管F1代个体没有直接暴露于特拉洛吡林，但观察到性激素水平和HPG轴基因表达的显著紊乱。HPG轴的反馈调节似乎失衡，表现出性别特异性的相反反应模式（图S1）。类固醇生成相关基因的表达变化表明F1代鱼类的激素生物合成途径异常。相关性分析进一步表明，激素波动通过反馈机制影响HPG轴的下游调节。在F2代中，关键HPG轴基因的表达显示出负反馈调节的迹象[43]。值得注意的是，编码类固醇激素合成所需酶的CYP家族基因在生殖腺组织中的表达对特拉洛吡林暴露特别敏感，表明生殖腺内的局部类固醇生成调节受到干扰[45]。cyp19a在雄性和雌性之间的性别特异性表达模式也表明，特拉洛吡林可能干扰性别分化和生殖腺成熟，暗示了需要进一步研究的更深层次的生态风险[46]。

从环境管理的角度来看，这些发现强调了需要更全面地评估内分泌干扰物（EDCs）的生态影响，特别是那些影响生殖健康的干扰物。生殖毒性跨代传递意味着即使环境中的低水平暴露也可能对水生种群产生长期、连锁的影响（图S2、S3）。

3.3. 特拉洛吡林对多代骨骼系统的影响
骨骼形成与吸收之间的平衡对于维持骨骼完整性和矿物质稳态至关重要[47]。颅骨结构，如上颌骨和下颌骨，对鱼类的运动功能至关重要，这些骨骼的畸形会显著影响游泳性能[16]。组织蛋白酶K（CATHK）是由破骨细胞分泌的关键酶，在骨基质降解中起核心作用，其上调通常与骨吸收增强相关。I型胶原（COL1）是骨基质的主要有机成分[48]，而II型胶原（COL2）对软骨完整性和正常骨骼生长至关重要[49]。在我们的研究中，图3显示CATHK在F0至F2代成年鱼类中持续激活，同时COL1水平持续增加，COL2水平波动。这些发现表明特拉洛吡林暴露可能增强破骨细胞活性，同时破坏胶原稳态，指向潜在的长期骨代谢紊乱。在F0代雄性和雌性鱼类中，观察到COL1和COL2水平均升高，这可能是对骨吸收增加的补偿反应[50]。然而，在F1代雌性鱼类中，COL1增加而COL2减少；在F2代中，这两个标志物再次升高，表明存在代际变异性和复杂的调控机制。这表明特拉洛吡林暴露不仅影响即时骨骼形成，还会造成持续数代的紊乱，引发对鱼类种群长期影响的担忧。

甲状腺激素已知能促进软骨向骨骼的转化，并在骨吸收过程中调节细胞活性[51]。F0代中观察到的甲状腺激素水平升高随后在F2代中降低的趋势表明了一个早期激活阶段，随后在后续代际中受到反馈抑制。此外，特拉洛吡林引起的甲状腺紊乱表现出跨代和性别特异性特征。甲状腺激素的合成和分泌受促甲状腺激素（TSH）的调节，tshβ的表达水平是评估甲状腺激素调节的重要指标[51]。尽管甲状腺激素水平升高，但tshβ表达的上调表明预期的负反馈调节失败（图S4），这在之前的甲状腺内分泌干扰物研究中也有报道[52]。这种反馈失败可能是由于调节回路受损或tshβ的直接转录激活所致，这两种情况都导致了观察到的骨代谢和激素调节紊乱。由于甲状腺激素对骨骼稳态至关重要，其对骨骼发育和功能的影响表明，仅从短期暴露的角度评估特拉洛吡林的环境风险可能被低估了。这强调了需要制定考虑内分泌干扰物对水生物种即时和跨代影响的监管框架。

在哺乳动物和其他有骨脊椎动物中，天然雌激素通过调节参与不同细胞类型分化和活性的基因的转录来参与骨骼发育[53]。雌二醇（E2）通过促进分化、延长成骨细胞的寿命、诱导骨矿化以及减少破骨细胞的形成、活性和寿命来保护骨骼，其中ERβ是介导这一过程的关键受体[12]。在F0代雌性鱼类中，erβ的表达降低，而在雄性鱼类中增加，反映了内分泌干扰效应的性别差异。在F1代中，暴露于10 μg/L的雌性和雄性鱼类中erβ的表达均增加。在F2代中，雄性鱼类的erβ表达降低。值得注意的是，雌激素受体的表达也受到循环雌激素水平的动态调节。因此，本研究中观察到的erβ表达变化可能反映了两层调节：一层是特拉洛吡林对受体表达的直接干扰，另一层是身体对暴露后改变的雌激素环境的反馈适应。在这项研究中，雌激素信号与骨骼标志物之间的相关性分析表明，特拉洛吡林暴露可能通过调节结构蛋白和生长因子来影响骨骼发育[12]、[15]。像双酚A（BPA）这样的内分泌干扰物模仿雌激素或阻断受体活性，导致ER信号失衡，这表现为ERβ表达的波动及其与骨骼发育标志物的相关性[47]。在成年鱼类中，性别特异性的erβ表达差异表明雌激素信号在介导骨骼毒性的性别特异性效应中可能起关键作用。从分子机制的角度来看，ERα和ERβ在两性之间的基础表达水平、分布比例和共调节因子存在固有差异[54]。这些固有的表达差异可能使雌性对具有雌激素活性的污染物或干扰雌激素通路的污染物更加敏感[42]。此外，污染物可能通过表观遗传机制调节ER的性别特异性表达[55]。研究还明确显示，TDCIPP的生物浓度在雌性青鳉的多个组织（包括大脑）中高于雄性[56]。这种药代动力学性别差异可能导致雌性的关键靶器官（如大脑和生殖腺）暴露于更高浓度的污染物，从而放大其毒性效应[57]。未来的研究可以进一步调查两性关键组织中ER蛋白的基础表达水平和分布，并使用ER基因敲除模型或特定拮抗剂来直接验证ER信号通路在介导特拉洛吡林性别特异性毒性中的核心作用。

下载：下载高分辨率图像（186KB）
下载：下载全尺寸图像

图4. 成年鱼类中E2水平与erβ以及骨骼指标之间的相关性：(A) F0代成年鱼类，(B) F1代成年鱼类，(C) F2代成年鱼类。
在幼体阶段，图5显示F1代幼体的骨骼异常，包括M-CH（下颌-角质骨）距离增加，M-PQ（下颌-腭方骨）角度减小，CH-CH（角质骨-角质骨）角度增加，表明骨骼排列异常。茜素红染色进一步显示骨矿化减少，表明特拉洛吡林暴露抑制了成骨活性，导致骨骼结构变弱。在F2代幼体中（图S6），颅骨形态变化仍然存在，M-CH距离增加，CH长度减小，CH-CH角度增加。这些变化表明特拉洛吡林的毒性效应在后代中持续存在，并对颅骨发育产生长期影响。此外，在10 μg/L处理组中，骨矿化面积显著减少（p < 0.05），表明特拉洛吡林对骨生成过程的抑制毒性效应延续到了F2代。到F3代（图S7），10 μg/L组的M-CH距离显著增加（p < 0.01），CH-CH角度增加，颅骨骨骼异常持续存在。此外，10 μg/L组的骨矿化面积减少。这表明特拉洛吡林的毒性效应稳定地遗传到了未暴露的F3代，对骨骼形态产生了持久影响。

下载：下载高分辨率图像（566KB）
下载：下载全尺寸图像

图5. F1代幼鱼的骨染色结果：(A) 15天龄F1代幼鱼的Alcain蓝染色示意图，(B) 15天龄F1代幼鱼的颅骨长度和角度，(C) 15天龄F1代幼鱼的Alcain红染色示意图及骨矿化面积。*P < 0.05；**P < 0.01。（关于该图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

这些骨骼缺陷与运动性能下降直接相关，如F1-F3代幼体的平均速度、活跃时间和移动距离减少所示（图S8，表S4）。先前的研究表明，由环境毒素引起的骨骼畸形，尤其是影响颌角和骨间距的畸形，会显著损害个体的行为表现[49]、[58]。由于自由游泳行为是鱼类觅食、躲避捕食者和生存等关键功能的基础，这种行为的损害可能会显著降低生态适应性[59]。鉴于骨骼完整性对鱼类整体健康和生存的至关重要性，tralopyril破坏多代骨骼发育的潜力在环境管理和监管策略中值得高度重视。如图6所示，在F1代幼体中，CATHK、COL1和COL2的水平显著升高（p<0.05），表明骨基质合成和降解过程同时被激活。在F2代幼体中，只有10 μg/L组中的CATHK浓度显著增加（p<0.01），而COL1和COL2没有显著变化（p>0.05），这表明骨骼重塑过程偏向于骨吸收。到了F3代幼体，CATHK、COL1和COL2的水平再次显著升高（p<0.05），与F1代观察到的趋势一致。F1-F3代幼体中骨矿化面积的减少以及COL1和COL2的异常增加可能是由于这不是功能性骨形成，而是由于骨代谢失调导致的补偿性异常合成[49]。下载：下载高分辨率图像（443KB）下载：下载全尺寸图像图6. 幼体指标和铁死亡相关标记的网络热图：(A) F1代幼体，(B) F2代幼体，(C) F3代幼体。*P<0.05；**P<0.01。考虑到甲状腺激素在骨代谢调节中的关键作用，测量了F1至F3代幼体的T3和T4水平变化。结果显示，在F1代幼体中，T3和T4水平均显著升高（p<0.01）。在F2代中，T3和T4水平呈现低-高-低的波动趋势，但没有观察到统计学差异。到了F3代，T3水平显著升高（p<0.05）。这些发现表明甲状腺激素水平在幼体阶段也表现出代际波动和跨代效应。骨基质紊乱和甲状腺激素波动的代际传递表明这些干扰可以累积多代。F1和F3代幼体中CATHK、COL1、COL2和甲状腺激素水平的升高，以及亲代激素水平与后代骨骼标记之间的显著相关性（图S9）[60]，突显了tralopyril影响的跨代性质。这强调了需要进行环境风险评估，以考虑即时和累积效应，特别是在依赖激素调节进行骨骼发育的物种中。骨形态发生蛋白4（bmp4）是骨诱导信号通路中的核心调节因子，指导间充质细胞分化为软骨细胞和成骨细胞[61]。col2a1a编码软骨形成的关键结构成分，其在早期发育中的失调会损害骨骼形态发生[49]。在F1代幼体中，bmp4、col2a1a和tshβ的转录水平显著下调至对照组的0.58-0.77倍（p<0.05）。这些变化可能是观察到的骨骼表型受损的关键分子基础。在F2代幼体中，只有1 μg/L组中的col2a1a表达显著下调了0.70倍（p<0.05）。在暴露于tralopyril的幼体中，bmp4和col2a1a的表达均大幅下调，表明F0代中的tralopyril暴露抑制了后代的早期成骨途径——可能在分子水平上导致颅面软骨畸形[61]。在F3代幼体中，10 μg/L组中col2a1a和tshβ的表达分别显著上调至对照组的1.47倍和1.71倍（p<0.05）。这表明随着代数的增加，分子水平的调节开始部分恢复。然而，表型变化，如颅面畸形和行为改变，仍然持续存在，可能是由于污染物的长期影响。值得注意的是，F1-F3代幼体中也观察到了骨骼异常，F1代幼体直接暴露于tralopyril，表明亲代暴露可能对后代的骨骼发生产生持续的影响。在这种情况下，不能排除表观遗传机制的作用。与我们之前基于甲基组的研究一致，我们的研究表明tralopyril暴露伴随着钙感应受体基因（casr）和多个参与骨发育的基因（如CSGALNACT1、bmp2和cacna2d2）的DNA甲基化模式改变，支持表观遗传失调在骨骼结果中的潜在作用[21]。鉴于casr对软骨形成和全身钙稳态至关重要，这种甲基化变化可能是亲代暴露影响后代软骨/骨发育的合理途径。总体而言，tralopyril与暴露成体的骨基质重塑紊乱（CATHK激活和COL1/COL2失衡）以及未暴露F1-F3代幼体的持续颅面缺陷和矿化减少有关，这些缺陷伴随着运动性能的受损。这些发现与涉及甲状腺/雌激素信号传导、表观遗传调节和成骨/软骨生成基因表达改变（如bmp4和col2a1a）的多代骨骼危害一致，表明存在长期生态风险。3.4. 铁死亡在tralopyril诱导的多代毒性中的作用为了明确铁死亡是否是tralopyril诱导的生殖内分泌和骨骼系统多代毒性的机制学上合理的驱动因素，我们测量了F0至F3代中与铁死亡相关的关键生化标志物，包括组织铁含量和谷胱甘肽（GSH）水平。选择这些组织是因为它们在铁代谢中的作用及其与污染物诱导的毒性研究的相关性。在大脑、生殖腺和骨组织中评估了铁含量。这些组织因其在铁代谢中的作用和对污染物诱导的毒性的相关性而被选中。在大脑中，铁过载与氧化应激标志物的增加相关，这是神经毒性的特征。在生殖腺中，铁含量与生殖健康紊乱有关，包括激素水平和配子生成的改变。在骨组织中，铁含量与骨基质形成紊乱和矿化受损相关，这是骨骼毒性的关键标志物。如图3所示，在F0代中，10 μg/L组中雌鱼大脑的组织铁含量增加了2.55倍（p<0.01）。这表明中枢神经系统可能是tralopyril暴露后铁积累的主要靶标。在F1代雌鱼中，生殖腺的组织铁含量分别增加了2.90倍和2.88倍（p<0.01），在骨组织中增加了1.96倍（p<0.01）。到了F2代，10 μg/L组中雌鱼的大脑组织铁含量分别增加了2.54倍和1.99倍（p<0.05）。在F2代雄鱼中，生殖腺中也观察到显著的铁积累，水平分别增加了1.87倍和2.01倍，在骨组织中分别增加了2.42倍和2.14倍（p<0.05）。GSH不仅是一种主要的细胞内抗氧化剂，还通过限制脂质过氧化来抑制铁死亡[62]。当GSH耗尽时，细胞解毒脂质过氧化的能力受损；在铁过载的情况下，不稳定的铁池的扩张会加剧芬顿反应，放大活性氧（ROS）并驱动膜脂质过氧化，从而引发铁死亡损伤[63]。F0代实验的结果显示，雄鱼的大脑、生殖腺和骨组织中的GSH水平呈下降趋势。相比之下，雌鱼的生殖腺GSH水平显著升高至1.38倍（p<0.01）。在F1代中，雌鱼骨组织和雄鱼的大脑及生殖腺中的GSH水平显示出恢复趋势，可能通过抗氧化系统的调节实现了一定程度的功能恢复。然而，到了F2代，雌鱼骨组织和雄鱼大脑中的GSH水平再次下降，显示出一些代际波动。在1 μg/L组中，两性的生殖腺GSH水平分别上调至对照组的1.75倍和1.96倍（p<0.05）。此外，我们评估了通过先前组学分析鉴定出的铁死亡相关基因fth1的表达，以探讨铁死亡在代际间介导骨骼和内分泌毒性的机制作用。成年鱼中fth1的基因表达分析显示了复杂的、依赖于代的模式，这些模式因组织和性别而异（图3）。在F0代中，fth1的表达在脑中显著上调至对照组的1.49-2.24倍（p<0.05），而在生殖腺中则下调至0.09-0.44倍（p<0.01）。值得注意的是，在1 μg/L暴露的雄性中，骨组织中的fth1表达显著上调（对照组的1.60倍，p<0.01）。这种组织和性别特异性的紊乱在代际间持续存在。在F1代暴露于10 μg/L的成年鱼中，雌鱼大脑中的fth1转录上调至对照组的1.72倍（p<0.05）。相反，两性的生殖腺表达均下调至0.51-0.80倍（p<0.05），这种模式可能与观察到的生殖毒性有关。在1 μg/L组中，两性的骨组织fth1水平均升高，雄性中显著增加了3.05倍（p<0.05）。到了F2代，表达模式发生了明显变化。在雌性中，大脑中的fth1转录显著下调至1 μg/L组的0.27倍和10 μg/L组的0.57倍（p<0.01）。相反，雄性的生殖腺表达显著增加至1.44倍（p<0.05）。在骨组织中，fth1表达受到抑制：具体来说，在1 μg/L组中雌性的fth1表达下降至0.45倍（p<0.05），在10 μg/L组中雄性的fth1表达下降至对照组的0.02倍（p<0.01）。在不同代的成年鱼中，组织铁积累和GSH耗尽显示出明显的组织和性别特异性模式，特别是在雌性大脑中持续的铁过载和雄性大脑中持续的GSH耗尽，表明铁死亡可能在功能上连接神经系统、生殖系统和骨骼系统。fth1编码铁蛋白的重链，是铁稳态的核心调节因子，其上调通常反映了铁积累的增加[64]。其调节非常复杂，并表现出组织特异性模式。在高铁死亡敏感性的组织（如大脑和生殖腺）中，fshβ、lhβ、cyp19a和star的表达显著下调。值得注意的是，生殖腺中fth1的下调通常伴随着E2水平的升高，表明铁死亡信号与HPG轴之间存在潜在的相互作用（图S9）。大脑和生殖腺中的铁死亡应力会损害神经内分泌调节和类固醇生成功能，导致HPG轴紊乱和生殖腺病理，而骨组织中的铁死亡脆弱性会破坏成骨/软骨生成稳态并促进基质重塑和矿化缺陷。类似的跨代氧化应激特征也已在亲脂性防污剂（如三苯基锡）中报告，包括微塑料/纳米塑料共暴露的情况，支持遗传性氧化还原失衡可以跨代传递发育缺陷的概念[24]。在F1至F3代幼体中，还评估了组织铁含量和GSH水平，以评估铁稳态和抗氧化能力的协调变化（图6）。关于F1至F3代幼体的分析，F1代中观察到GSH的显著耗尽，其中1 μg/L组中的水平分别下降至对照组的0.65倍和0.63倍（p<0.05），表明母体暴露于tralopyril损害了后代的抗氧化防御，引发了早期氧化应激。到了F2代，10 μg/L组中的铁含量显著增加至对照组的2.15倍（p<0.05），表明铁过载持续存在。然而，在F3代幼体中，1 μg/L组中的铁水平下降至0.40倍（p<0.01）。尽管如此，谷胱甘肽水平仍表现出显著波动，反映了持续的氧化应激。与成年鱼中的组织特异性模式相反，对整个幼体的分析揭示了fth1转录的明显代际趋势。在F1代幼体中，fth1表达显著下调至对照组的0.48倍和0.40倍（p<0.01）。这种抑制效应在更高暴露浓度（10 μg/L）的F2代中持续存在，其中水平仍保持在0.45倍（p<0.01）。然而，在F3代中发生了显著逆转：fth1转录水平回升，增加到对照组的1.41倍（p<0.01）。在跨代水平上，铁死亡相关指标（铁含量/GSH/fth1）与骨骼相关终点之间的密切关联支持铁死亡是tralopyril诱导的多代骨骼和内分泌毒性的机制学相关因素。我们提出铁死亡在骨骼毒性中起关键作用。我们的研究通过组织铁含量、GSH水平和跨代的fth1表达等标志物提供了证据。我们还认识到HPG轴和HPT轴的功能障碍也可能导致骨骼毒性，特别是具有性别特异性效应。虽然单凭相关性不能确定因果关系，但铁过载、GSH耗尽、铁稳态基因失调以及跨代内分泌和骨骼表型之间的强相关性表明铁死亡可能驱动tralopyril诱导的多代毒性，损害HPG轴和HPT轴。根据我们之前的研究结果[21]，铁死亡（ferroptosis）以及HPG（性腺轴）和HPT（激素轴）的紊乱可能共同导致骨骼毒性及其跨代传递。本研究揭示了tralopyril的多代生殖和发育毒性，它具有一些经典环境内分泌干扰物（EDCs）的特征，同时也表现出作为新型污染物的独特特性。与BPA[65]和BaP[42]类似，tralopyril也会导致F0代亲本的生殖能力下降、后代胚胎质量降低以及后续几代相关基因的表达异常。这些效应表明其对HPG轴的干扰是跨代的，这与许多EDCs的共同特征一致。然而，与经典EDCs不同的是，tralopyril的毒性机制可能更为复杂。除了可能直接干扰雌激素受体外，它还显著扰乱了HPT轴并激活了铁死亡，这是一种新型的调控性细胞死亡方式。这种多靶点、多途径的协同机制可能是其多代毒性的核心原因。此外，与DDT[66]和PFOS[67]等高度持久性的经典EDCs不同，tralopyril在环境中的半衰期相对较短，但其引起的分子水平紊乱可以持续几代，从而导致长期影响。这表明，仅关注新型污染物的环境持久性可能不足以进行全面的风险评估，还应充分考虑其内在的生物活性和跨代遗传潜力。因此，作为一种新型防污剂，tralopyril的多代毒性结合了经典EDCs的持久性和独特的毒理学机制，需要作为重要的环境污染物进行持续监测和进一步研究。

3.5 IBR指数
IBR指数是一种结合多种生物标志物来评估污染物暴露引起的环境和生物反应的方法[68]。它已被广泛用于生态毒理效应的全面评估。这种方法不仅反映了不同指标的相对权重，还有助于识别关键反应因素及其跨代趋势。在本研究中，使用IBR指数来整合和评估tralopyril暴露对F0至F3代海洋青鳉鱼所引起的毒理学反应。构建了雷达图来直观展示每一代的综合反应谱（图7）。在所有世代中，胶原蛋白含量和组织铁水平显示出一致显著且稳定的反应，表明它们是最敏感和可重复的生物标志物。这些发现支持了铁稳态和骨基质完整性紊乱是tralopyril毒性的核心机制的结论。甲状腺激素水平表现出动态的、特定于世代的反应，在F0代强烈激活，在F2代受到抑制，这与之前讨论的HPT轴的阶段性及世代特异性紊乱一致。此外，生物标志物的反应也因性别而异；例如，F0代成年鱼的GSH水平和F1代成年鱼的T4水平在雄性中受到更明显的抑制，这再次证实了性别是影响内分泌毒性的关键因素[69]。

下载：下载高分辨率图像（529KB）
下载：下载全尺寸图像
图7. IBR雷达图：(A) F0至F2代的雌鱼，(B) F0至F2代的雄鱼，(C) F1至F3代的15天大的幼鱼。
IBR值作为污染物总体毒性的定量指标，数值越高表示毒性越大[70]。如表2所示，tralopyril引起的内分泌激素调节和骨骼完整性的紊乱随着暴露浓度的增加而在三个成年世代中加剧。此外，基于性别的差异也很明显：tralopyril在F0代和F2代雄鱼中引起的毒性效应比在雌鱼中更强烈，而在F1代鱼中则观察到相反的模式。观察到的性别特异性差异突显了污染物对雄性和雌性个体的不同影响。性别特异性数据对于制定性别敏感的监测计划以及识别污染物对生殖健康、内分泌紊乱和骨骼毒性的潜在影响至关重要。此外，IBR值可用于风险评估，确定污染物的优先研究方向并监测环境政策的有效性。通过定期测量不同物种和环境中的IBR值，我们可以识别污染热点并评估污染物的长期生态效应，包括跨代毒性。包含性别特异性数据使我们能够制定更有针对性的风险管理策略，考虑到污染物对雄性和雌性种群的差异性影响[71]。

tralopyril引起的多代内分泌和骨骼紊乱的证据表明，即使低水平的暴露也可能导致持续的生态损害，从而可能随着时间的推移损害鱼类种群。因此，监管措施应考虑这些长期效应，特别关注像tralopyril这样扰乱关键生物途径（如铁稳态和激素调节）的污染物。虽然这些发现对于理解tralopyril的毒性机制至关重要，但还需要通过实地研究进行进一步验证。在自然生态系统中的长期生态监测和多代研究对于更好地了解tralopyril暴露的实际影响及其对水生环境的长期风险评估至关重要。

4. 结论
本研究提供了令人信服的多代证据，表明tralopyril在Oryzias melastigma中引起显著的、持续性的生殖和骨骼毒性。tralopyril在F0至F3代中引起了多代内分泌紊乱，雌性表现出更大的敏感性。效应包括性腺成熟加速、卵泡闭锁累积、卵母细胞直径减小、孵化成功率降低以及性腺异常，表明种群可持续性可能下降。这是由于E2和T水平持续升高以及HPG轴的失调所致，显示出性别特异性的分子反应。从F0至F3代持续的骨骼缺陷表现为组织蛋白酶K活性增加、胶原蛋白异常积累、成骨/软骨生成调节因子（bmp4、col2a1a）下调、软骨缺陷以及矿化延迟。HPT轴反馈的紊乱和雌激素信号的作用（通过erβ相关性）促进了这些性别特异性的发育障碍。亲本的甲状腺/性激素状态显著影响了后代的骨骼发育。铁死亡，其特征是组织铁过载、GSH耗竭以及跨代和性别的fth1激活，被认为是观察到的内分泌紊乱和骨骼损伤之间的关键机制联系。

总体而言，tralopyril表现出慢性、累积性和跨代的生态毒性，强调了需要对新兴持久性污染物进行全面的风险评估。这项工作提供了重要的科学见解，并确定了管理与长期环境暴露于tralopyril等污染物相关的风险的潜在干预目标，这些污染物对生态系统健康和种群稳定性有深远影响。

作者信息
通讯作者：
李志华（Zhihua Li）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100
刘斌（Bin Liu）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100
王存龙（Cun-Long Wang）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100
曾 Bianhao（Bianhao Zeng）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100
尹海阳（Hai-Yang Yin）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100
刘玲（Ling Liu）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100
李平（Ping Li）：- 山东大学海洋学院，中国山东省250100

注释：
李志华（Zhi-Hua Li）是《环境化学与生态毒理学》杂志的编委会成员，未参与本文的编辑审查或发表决定。其他作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所述的工作。

组/浓度
1 μg/L 10 μg/L
F0代雌鱼 62.00 ± 14.11 118.50 ± 22.47
F0代雄鱼 53.00 ± 10.50 105.50 ± 4.27
F1代胚胎 18.83 ± 5.51 42.50 ± 18.25

组/浓度
1 μg/L 10 μg/L
F0代雌鱼 16.64 18.80
F1代雌鱼 13.78 21.87
F2代雌鱼 16.25 21.03
F0代雄鱼 18.55 20.00
F1代雄鱼 15.30 20.42
F2代雄鱼 16.75 21.90
F1代幼鱼 8.77 12.45
F2代幼鱼 3.94 11.41
F3代幼鱼 8.90 12.23

LOQ：定量限

表2 IBR指数

CRedI 作者贡献声明：
刘斌（Bin Liu）：撰写——初稿
李腾洲（Teng-Zhou Li）：数据整理
王存龙（Cun-Long Wang）：正式分析
曾 Bianhao（Bian-Hao Zeng）：方法学
尹海阳（Hai-Yang Yin）：软件
刘玲（Ling Liu）：软件
李平（Ping Li）：验证
李志华（Zhi-Hua Li）：撰写——审阅与编辑、监督、概念化

作者贡献：
刘斌（Bin Liu）：调查、方法学、正式分析、撰写——初稿
李腾洲（Teng-Zhou Li）：采样和数据整理
王存龙（Cun-Long Wang）：验证、正式分析
曾 Bianhao（Bian-Hao Zeng）：调查
尹海阳（Hai-Yang Yin）：软件、调查
刘玲（Ling Liu）：审阅和编辑
李平（Ping Li）：资源、监督
李志华（Zhi-Hua Li）：概念化和总体指导

未引用的参考文献