在一种交配成功率极低的昆虫中，研究其隐秘的雄性择偶行为

《Behavioral Ecology and Sociobiology》：Testing for cryptic male mate choice in an insect with high mating failure

　　摘要 交配后的性选择是性选择的重要组成部分。虽然传统上主要从精子竞争和隐秘的雌性选择的角度进行研究，但雄性也可能在交配后进行配偶选择，例如决定是否在交配过程中使雌性受精或传递多少精子。区分这些交配后的性选择过程具有挑战性，尤其是因为雄性和雌性的行为不太可能是完全独立的。在这里，我们采用实验方法来探索种子虫Lygaeus simulans中的隐秘雄性选择行为，该物种有40-60%的交配不涉及精子传递。证据表明这是一种由雄性驱动的过程，雄性更有可能向较大的雌性传递精子。然而，较大的雌性可能比较小的雌性需要或接受更多的精子。通过两个实验，我们试图改变雄性对特定大小雌性的评价，从而改变精子传递的模式，明确显示出雄性的影响。我们改变了（1）雄性竞争对手的可获得性和（2）在交配试验前与雌性的接触机会，以操纵雄性的经验。尽管在第二个实验中我们发现了雄性交配前行为的改变，并证实了较大的雌性更有可能接受精子并产生后代的先前结果，但我们的实验操作几乎没有产生影响。因此，我们的数据仍然支持雄性对较大雌性进行隐秘选择的假设，但将受精成功与雄性明确联系起来的证据仍然难以获得。

引言 性选择源于同一性别内部为获得另一性别的配子而进行的竞争（Shuker和Kvarnemo 2021）。在达尔文提出性选择的概念并概述了雄性间竞争和雌性选择的机制之后（Darwin 1859, 1971），随着20世纪上半叶现代综合理论的发展，性选择的研究在很大程度上被物种形成的研究所取代（Cronin 1991; Andersson 1994; Milam 2010）。此外，性选择的焦点在于获得配偶的机会，即我们现在所说的交配前性选择（Andersson 1994; Shuker 2014）。20世纪70年代初对交配后性选择的认识彻底改变了性选择的研究（Birkhead 2010）。从Parker关于精子竞争的开创性工作（Parker 1970），到Thornhill发现隐秘的雌性配偶选择（Thornhill 1983），再到Eberhard关于交配求偶和隐秘雌性选择的广泛研究（Eberhard 1985, 1996），我们现在对交配前和交配后的性选择有了越来越丰富和多样的理解（综述见Smith 1984; Birkhead和M?ller 1998; Simmons 2001; Birkhead和Pizzari 2002; Parker和Pizzari 2010; Arnqvist 2014; Firman等人2017; Parker 2020）。最近，性选择的另一个同样重要的转向是关于雄性和雌性所扮演的角色。特别是，现在越来越清楚配偶选择不仅是一个由雌性驱动的过程，而且许多物种中也越来越深入地研究了交配前的雄性配偶选择（Bonduriansky 2001; Edward和Chapman 2011）。然而，这尚未延伸到详细探讨交配后雄性选择的机会，即雄性在交配开始后所做的选择（一种形式的交配后性选择：Arnqvist 2014; Aumont和Shuker 2018）。鉴于关于性选择中雄性和雌性的传统假设，即雄性拥有大量廉价的精子，而雌性则受到昂贵卵子的限制（Tang-Martínez和Ryder 2005; 参见Ah-King 2022），这并不令人惊讶。因此，人们更容易认为一旦雄性与雌性成功交配，他们不妨也向雌性传递精子。然而，对精子竞争本身的研究表明，尽管精子相对丰富，但它们既不廉价也不无限（Wedell等人2002）。现在已知许多物种的雄性会根据一系列因素调整传递给雌性的精子数量，包括雌性的大小、妊娠状态以及精子竞争的风险和强度（Gage 1991; Simmons 2001; Kelly和Jennions 2011; Bretman等人2023）。这种所谓的策略性精子分配打破了精子廉价性的简化观念，以及雄性应该如何谨慎地使用精子。然而，策略性精子分配也可能导致隐秘的雄性配偶选择。策略性精子分配确实允许雄性通过根据精子竞争的风险和强度，适当地向雌性传递精子，从而更成功地竞争雌性的配子（Wedell等人2002; Parker 2020）。许多关于策略性精子分配的研究都是从这一角度正确解释的。但这种精子分配也可能意味着雄性会根据雌性表型的某些方面优先向某些雌性传递精子，而不仅仅是潜在的精子竞争环境。因此，策略性精子分配也成为雄性配偶选择的手段（Aumont和Shuker 2018）。这也意味着一些雌性可能无法获得与其他雌性相比更理想的精子数量或质量，从而在雌性内部产生了对雄性配子的性选择（Shuker和Kvarnemo 2021）。与隐秘的雌性选择（CFC：即雌性在交配开始后做出的选择，以偏向偏好配偶，例如丢弃不太理想的雄性的精子：Eberhard 1996; Peretti和Eberhard 2010; Arnqvist 2014）类似，隐秘的雄性选择（CMC）也难以研究，因为涉及的过程通常发生在雌性的生殖道内（Thornhill 1983; Eberhard 1996; Pitnick和Brown 2000; Arnqvist 2014）。此外，由于我们对CFC有了更好的理解，因此可能更容易将我们观察到的模式归因于雌性的行为而非雄性，即CFC而非CMC。将两者分开增加了额外的复杂性。到目前为止，除了将精子分配与雌性表型联系起来的策略性精子分配研究（Reinhold等人2002; Kelly和Jennions 2011）之外，专门研究CMC的研究仍然很少（例如关于黑兵蝇Merosargus cingulatus的研究Barbosa 2011, 2015; 和果蝇Drosophila melanogaster的研究Anastasio等人2023）。在交配失败率高的物种中可以寻找CMC的迹象（Rhainds 2010, 2019）。交配失败指的是个体在其一生中可能从未成功交配。这包括那些终生未交配的个体，以及那些虽然交配但未能产生后代的个体。越来越多的证据表明，交配失败可能影响多种物种中的大量个体（Rhainds 2010, 2019; Greenway等人2015）。在这里，我们特别关注交配失败的第二个组成部分，也称为“隐秘交配失败”，即雄性和雌性确实交配，但这些交配未能成功传递和/或接收精子（Greenway等人2015）。隐秘交配失败可能是由于交配过程中的机械故障，或者是因为雄性或雌性选择不传递或接受精子。尽管仍然难以区分雄性和雌性的行为，但具有交配失败的物种可能为研究CMC提供了良好的机会。在这里，我们考虑了种子虫Lygaeus simulans中的CMC可能性，该物种的交配失败率约为40-60%（Tadler 1999; Tadler等人1999; Micholitsch等人2000; Greenway和Shuker 2015; Greenway等人2017; Balfour等人2020, 2024a, b, c, 2026）。解剖研究表明，超过90%的交配失败是由于缺乏精子传递（Greenway等人2017）。在L. simulans及其近缘物种L. equestris的多个实验中，成功交配的最常见相关因素是雌性的大小，较大的雌性更有可能接受精子（Balfour等人2024a, c）。这种模式可能是由于雄性更倾向于向较大的雌性传递精子，因为较大的雌性通常更具生育能力（Shuker等人2006），或者较大的雌性需要或接受更多的精子，或者存在某种形式的相互配偶选择，其中雄性和雌性的偏好重叠。前者似乎最有可能（如Balfour等人2024a所论证的），尤其是考虑到该物种的雌性高度多配偶制。然而，仅仅将精子的传递和使用与雌性大小联系起来并不足以明确证明隐秘的雄性选择。我们还注意到，该物种中没有证据表明射精物被用作婚礼礼物，精子是作为自由状态传递的（即没有精包；Gschwentner和Tadler 2000）。我们进行了两项实验，试图确定CMC在L. simulans交配后性选择中的作用。我们的理由是，为了显示雄性的影响（即使也存在雌性的影响），我们需要改变雄性根据雌性大小对其的评价，从而改变其传递精子的可能性，但这种改变应独立于雌性的自身经验。与其他关于策略性精子分配的研究一样，已经证明在近缘物种Lygaeus equestris中，如果存在其他雄性，交配持续时间会有所不同（Burdfield-Steel和Shuker 2014），并且我们知道交配持续时间是一个很好的交配失败预测指标（Balfour等人2020, 2024a, b, c, 2026）。但在这类实验中，雌性也意识到竞争对手的存在，因此我们不能排除雌性也会改变行为的可能性。在我们的第一个实验中，我们将雄性单独饲养或成群饲养，然后将其与三个大小类别之一的雌性配对。我们预测，成群饲养的雄性会比单独饲养的雄性选择得更少，因为竞争可能会限制交配的机会，从而降低选择性。单独饲养的雄性受潜在竞争的限制较少，因此更倾向于选择价值更高的雌性，即较大的雌性，从而更有可能向较大的雌性传递精子。在我们的第二个实验中，我们再次操纵了雄性的经验，这次是将雄性单独饲养或在雌性存在的情况下饲养，它们可以或不能交配，从而设置了三种实验处理。然后我们将单个雄性与雌性配对。在这里，我们预测单独饲养的雄性可能比有与雌性交配经验的雄性更不挑剔，因此更有可能将精子传递给雌性，无论雌性的体型大小如何。最后，虽然我们的重点关注交配后的结果，但我们的两个实验也提供了关于交配前结果的进一步数据，我们报告这些数据以更广泛地解释我们的发现。

**方法**

**伦理声明**
所有工作均遵守当地和国家的动物福利规定。我们的实验使用了昆虫（Lygaeus simulans），这种昆虫进行实验不需要特别审查。实验设计或程序对动物福利或环境没有影响。在整个实验过程中，昆虫可以自由获取食物和水，并被保持在它们能够良好生存的温度下的培养箱中。使用软镊子处理昆虫以减少压力，仅在饲养或实验必要时进行。

**饲养**
Lygaeus simulans 是一种红黑相间的伪瓢虫，属于 Lygaeidae 科（广义上），分布于欧洲，是 Lygaeus equestris 的姐妹物种（Deckert 1985）。这些昆虫于 2008 年和 2009 年在意大利托斯卡纳地区采集，此后一直被持续地在实验室中饲养。昆虫被放置在尺寸为 30 × 15 × 15 厘米的塑料盒中，盒内提供一层 3 厘米厚的去壳有机葵花籽作为食物和栖息地。此外，还提供 2-3 支装有去离子水的棉塞管（每管 25 毫升），每周更换一次，并提供一块棉絮作为栖息地。培养箱的温度设定为 29°C，光照周期为 22:2 小时，以防止生殖滞育的发生。大约每 6-10 周，我们会使用吸管将大约 50 只处于不同发育阶段的昆虫转移到新的培养箱中，以限制近亲繁殖。在创建新培养箱时，总是从至少两个不同的群体中混合昆虫。

为了获得用于实验的处女成年个体，我们将处于后期发育阶段的若虫转移到尺寸为 20 × 10 × 8 厘米的塑料盒中，同样提供自由量的葵花籽、每周更换一次的去离子水（每管 25 毫升）以及棉絮作为栖息地。我们每 2-3 天检查一次这些盒子，将新羽化的成年个体用软镊子转移到收集容器（尺寸为 108 × 82 × 55 毫米的塑料容器）中。这一过程确保了雄性和雌性的纯度。成年个体按性别分开饲养，每个容器中最多容纳 10 只个体。每个收集容器都提供自由量的葵花籽、装有去离子水的棉塞管（7 毫升）和一块棉絮。所有容器都放置在培养箱中。

**实验 1：操纵雄性与竞争对手的交配前经历**
我们的第一个实验旨在操纵雄性在与雌性交配前的竞争对手经历，以观察这是否会影响交配后的结果。由于雌性在交配试验前与雄性分开饲养，因此雌性应该不知道雄性之前的竞争对手情况（尽管请参见下面的讨论，了解表皮烃类物质的潜在作用），因此交配试验后雄性处理组之间的任何差异主要应归因于雄性本身的影响。

为了生成不同的雄性处理组，在交配试验前四天，我们随机选择处于羽化后 3-9 天的处女雄性，将它们分为两组：一组（1）单独饲养，另一组（2）三只雄性一起饲养在同一个容器中（尺寸为 108 × 82 × 55 毫米的塑料容器）。每个容器中装有 30-40 颗葵花籽、一根装有水的棉塞管（7 毫升）和一块棉絮作为栖息地。四天后，收集这些雄性进行交配试验，每个高密度容器中只使用一只雄性，以避免伪重复。处理组（1）代表在交配试验前四天内没有竞争对手经历的雄性，而处理组（2）代表有两位竞争对手经历的雄性。

为了确定雌性的体型类别，在交配试验前四天，我们测量了处于羽化后 3-9 天的处女雌性的体长，并将它们分为大型（L）、中型（M）和小型（S）。中型雌性的平均体长为野生型雌性的平均值 ± 半个标准差（11.4 – 11.8 毫米），大型雌性的体长大于这个值（> 11.8 毫米），小型雌性的体长小于这个值（< 11.4 毫米）。这些体型类别是根据 Balfour 等人（2018；另见 Balfour 等人 2024a, b, c）的研究结果确定的。我们通过将雌性放在两块玻璃片之间并施加轻微压力来测量体长，同时避免伤害雌性。然后，我们将装有雌性的玻璃片放在装有目镜微米的校准解剖显微镜下，从吻端到翅膀尖端测量体长，背部朝上。之后，将雌性按照上述方式饲养在容器中。每个容器中最多饲养 10 只同体型类别的雌性，并将它们放回培养箱中直到实验开始。

在实验中，我们采用 2 × 3 因子设计随机配对雄性和雌性，其中一个因素是雄性的饲养密度，另一个因素是雌性的体型。这产生了 6 种不同的组合：LH、LI、MH、MI、SH、SI，其中第一个字母代表雌性的体型（L = 大型，M = 中型，S = 小型），第二个字母代表雄性的饲养密度（I = 单独饲养，H = 与另外两只雄性一起饲养）。总共观察了 387 对雌雄组合，每个处理组的样本量在 62 到 67 之间。需要注意的是，在这个实验和实验 2 中，观察者对雄性的预处理情况是知晓的，因为观察者在设置交配试验时需要知道雄性的处理组别。

我们将雌雄组合放入直径为 55 毫米的培养皿中，在室温下放置 6 小时，每 15 分钟观察一次，记录它们是否进行交配。交配中的组合会采取特定的背靠背姿势。如果组合在连续两次检查后分离（即 < 30 分钟），则让它们重新交配。这是因为成功授精所需的最短时间约为 30 分钟（Gschwentner 和 Tadler 2000）。出于分析目的，我们只计算持续 3 次或更长时间（> 30 分钟）的交配行为，尽管我们也认识到较短的交配过程可能在配偶评估和选择中起作用。然而，我们的主要关注点是交配失败以及至少有可能成功授精的交配结果，因此只计算持续时间超过 30 分钟的交配。如果组合连续三次或更长时间（> 30 分钟）进行交配，我们会将它们分开，并移除雄性以防止再次交配，然后将雄性置于 -18°C 的冷冻箱中处死。之后，将雌性转移到单独的塑料容器（尺寸为 108 × 82 × 55 毫米）中，容器内装有 15-20 颗葵花籽和一根装有水的棉塞管（7 毫升）。试验结束后，通过轻轻刷洗生殖器将仍在交配中的组合分开。雄性被处死，雌性按照上述方式重新饲养在单独的容器中。

我们将雌性放回培养箱中产卵 7 天。之后处死雌性，因为 7 天的时间足以让雌性在交配后产卵，从而判断是否发生了交配失败（即是否传递了精子，以及这些精子是否被用来受精）。然后检查容器中是否有卵，丢弃没有卵的容器。将所有剩余的容器继续放在培养箱中 7 天，之后将容器在 -18°C 下冷冻至少 24 小时，然后计数其中的若虫数量。由于雌性可能会产下未受精的卵，因此若虫的存在可以判断是否发生了受精，7 天的时间足以让若虫孵化。

**实验 2：操纵雄性与雌性的交配前经历**
我们的第二个实验旨在操纵雄性在与目标雌性交配前的经历，以观察这是否会影响交配后的结果。由于目标雌性在交配试验前与目标雄性分开饲养，且交配试验前的预处理中使用的雌性与目标雄性无关，因此雄性之前的非目标雌性经历应该对目标雌性来说是未知的。因此，交配试验后雄性处理组之间的任何差异主要应归因于雄性本身的影响。

实验 2 在全球 SARS-Cov-2 大流行期间进行，因此实验室的访问和同时在场的人员数量受到了一些限制。因此，与实验 1 相比，实验差异较少。最显著的是，为了节省实验室时间，在交配试验前没有对雌性进行体型分类，预处理用的雌性是从群体笼子中随机选取的（详见下文）。

为了生成实验用的雄性，我们按照上述方法收集并饲养了处女雄性。在羽化后 7-13 天，将每只雄性单独饲养在容器（尺寸为 108 × 82 × 55 毫米）中，并提供一根装有水的棉塞管（7 毫升）和 40-50 颗葵花籽。在每个容器中，我们还放置了一个“雌性展示装置”（FPD）。FPD 由一个直径为 55 毫米的培养皿底和一个直径为 34 毫米的较小培养皿底组成，较小的培养皿底放在较大的培养皿底内。为了封闭较小的培养皿底，在其上方放置了一个中央有孔（直径 16 毫米）的灰色塑料盘，孔上覆盖着纱布。这样雄性无法进入 FPD，但 FPD 与容器之间有空气流通。在 48 小时内，雄性要么（1）单独饲养（处理组 I），要么（2）每天与两只雌性接触 6 小时并可以交配（处理组 A），要么（3）每天与两只雌性接触 6 小时但不能交配（处理组 N）。对于处理组 I，容器中不添加雌性；对于处理组 A，每天有两只随机选择的雌性被放入容器中与雄性在一起。雌性可以在容器内自由移动并与雄性互动，因此可以发生交配；对于处理组 N，每天有两条雌性被放入 FPD 内，但雄性与雌性的接触受到限制，因为它们被培养皿和带纱布窗口的盖子隔开。用于预处理 A 和 N 的雌性是在第一天直接从群体笼子中选取的，因此没有控制它们的年龄和交配状态。为了随机化任何可能的雌性效应，在第一次接触后的第二天，所有雌性都被放入与若虫容器相同的容器中，在培养箱中过夜。第二天，我们将这些雌随机分配到处理组 A 和 N 中。第二次预处理后，雌性被放回群体笼子中。在 48 小时的预处理期间，所有容器都保持在培养箱中。最终样本量分别为N=53、59和53，对应于处理组I、A和N，总样本量为N=165。在48小时的处理前阶段后，雄性个体与处于交配后7-13天的处女雌性个体在直径为55毫米的培养皿中配对，配对时间持续6小时，遵循与实验1相同的方案，但有两个改动：首先，检查在配对后立即进行，而不是在配对后15分钟；其次，为了简化实验室COVID限制下的数据收集工作，配对个体在整个6小时的交配试验期间保持在一起，而不是在第一次完整交配（超过30分钟）后终止试验。这意味着一些配对个体能够进行多次交配。因此，为了与实验1的分析结果保持一致和可比性，我们仅分析那些仅进行了一次超过30分钟交配的配对个体（165对中的102对）。完整的数据分析见附录1。

在试验结束时，我们在-18°C下使用Eppendorf管对雄性个体实施安乐死以便后续测量。雌性个体按照之前的方法被放入单独的管中，并在孵化器中放置7天以产卵。随后，我们也在-18°C的冷冻室中使用Eppendorf管对雌性个体实施安乐死以便后续测量。再次检查每个管中是否有卵，没有卵的管被丢弃。再过7天后，所有管都被冷冻在-18°C至少24小时，并统计其中的若虫数量。

解冻后，我们像实验1一样使用装有目镜微米的校准解剖显微镜测量雌性的体长。与实验1不同，这次测量是从吻端到腹部末端（生殖器之前）的腹侧进行的。雌性的平均体长为10.51±0.04毫米。

所有统计分析均在R版本4.4.3（R Core Team 2025）中进行。对于实验1，雌性体型被视为有序变量；而对于实验2，则被视为连续变量。我们的方法是检查交配前和交配后的结果序列，从是否发生交配开始，一直到那些成功产下后代的雌性个体所产下的若虫数量。

对于实验1，我们使用具有二项分布和对数链接函数的一般线性模型（GLMs）来测试（i）雌性体型和（ii）雄性处理（以及它们之间的交互作用）对以下交配前和交配后性选择成分的影响：（a）雌性参与交配的可能性；（b）雌性在交配试验开始前15分钟内参与交配的可能性（即交配潜伏期的一个衡量指标，这是交配前配偶选择的另一个组成部分）；（c）如果交配成功，雌性产卵的可能性；（d）如果交配失败（即未能产下若虫）的可能性。我们注意到，与其他许多昆虫一样，这种物种的未交配的处女雌性也会产下未受精的卵，因此它们不需要交配就能开始产卵。我们还使用二项GLM来测试交配持续时间与交配失败可能性之间的关系。我们分别评估交配持续时间的作用，因为在这里以及之前的研究中（见引言），雌性体型和交配持续时间通常高度相关。然后我们使用具有高斯分布的一般线性模型（GLMs）来测试（i）雌性体型和（ii）雄性处理（以及它们之间的交互作用）对以下方面的影响：（a）交配持续时间；（b）成功交配的雌性个体所产下的若虫数量。最后，我们使用高斯GLM来测试交配持续时间与若虫数量之间的关系。

我们对实验2进行了类似的分析，这次将雌性体型视为连续变量。对于雄性的处理前阶段，该实验考虑的是雄性接触雌性的机会，而不是竞争对手雄性的存在与否。此外，如上所述，我们还在时间点0（实际上是在配对后大约两分钟内）扫描了配对个体，这使我们能够更直接地测量雄性在实验2中的交配尝试次数。

对于所有二项GLM，我们使用所谓的“Type 2”平方和以及似然比检验统计量（表示为χ2统计量）来测试模型中的所有主效应和交互作用；而对于所有高斯GLM，我们使用“Type 2”平方和以及‘F’检验统计量（这些测试使用了car包，Fox和Weisberg 2019）。在相关情况下，我们展示了回归系数及其标准误差，以明确任何关系的方向和强度。

**实验1：操纵雄性在交配前的竞争对手经历**

在这项实验中使用的387对配对中，有306对发生了交配（79.1%），其中213对产下了若虫，总体隐秘交配失败率为30.4%。

在交配前性选择方面，雄性在交配试验前的竞争对手经历并未影响配对发生的可能性，雄性经历与雌性体型之间也没有交互作用（雄性处理：χ21=1.86，P=0.173；交互作用：χ21=0.14，P=0.706；图1a）。在这项实验中，雌性体型作为主效应也不显著，因此较大的雌性没有在交配前选择配偶（χ21=0.08，P=0.774）。同样，对于那些发生了交配的配对，它们是否在交配开始后的15分钟内开始交配也不依赖于雄性处理（χ21=0.85，P=0.356）、雌性体型（χ21=0.62，P=0.430），或者它们之间的交互作用（χ21=2.08，P=0.150）。发生交配的雌性产卵的可能性显著高于未发生交配的雌性（85.9% vs 60.5%；χ21=23.45，P<0.0001；注意雌性作为处女可以并且确实会产下未受精的卵，但频率低于已交配的雌性；见方法部分）。

在交配后性选择方面，较大的雌性在交配后产卵的可能性高于较小的雌性（χ21=6.23，P=0.013；图1b）。然而，雄性处理并未影响雌性随后是否产卵（χ21=1.67，P=0.197），雄性处理与雌性体型之间也没有交互作用（χ21=0.06，P=0.799）。同样，较大的雌性也不太可能遭遇隐秘交配失败，更有可能产下若虫（χ21=8.10，P=0.004；图1c），而雄性处理也没有显著影响（χ21=2.64，P=0.104），雄性处理与雌性体型之间也没有显著交互作用（χ21=0.17，P=0.683）。因此，如果较大的雌性更有可能被交配是因为雄性更倾向于与较大的雌性交配，那么雄性在试验前的经历——无论是否有竞争对手——对这种偏好没有影响。

雄性处理（F1,302=2.22，P=0.138）或雌性体型类别（F1,302=2.72，P=0.100）对交配持续时间没有影响，它们之间也没有交互作用（F1,302=0.19，P=0.662）。然而，较长的交配时间更有可能导致若虫的产生，从而降低了交配失败率（β=0.017±0.002，χ21=167.08，P<0.0001；图2a）。仅考虑未经历交配失败的配对，较长的交配时间也导致了更多的若虫产生（β=0.069±0.032，F1,211=4.54，P=0.034；图2b）。此外，较大的雌性比小型雌性产下了显著更多的若虫（F1,209=10.12，P=0.0017；图1d）。另外，与其它雄性一起饲养的雄性在交配试验前略微但非显著地更有可能产下更多的若虫（F1,209=3.56，P=0.061）。然而，雌性体型与雄性处理之间在这方面没有交互作用（F1,209=0.59，P=0.444）。

**图1** 实验1中雌性体型在交配前和交配后性选择中的作用。各面板显示了（a）观察到交配的配对比例（N=387），（b）观察到交配后产卵的雌性比例（N=306），（c）观察到交配并成功产下若虫的配对比例（N=306），以及（d）有若虫的配对平均产卵数量（N=213），所有这些都是相对于雌性体型的。实心蓝色条形代表在实验试验前4天与另外两只雄性一起饲养的雄性配对，而灰色条形代表在试验前4天被隔离的雄性配对。误差条表示标准误差。每个条形上方还显示了处理代码（雌性体型类别：L=大型；M=中型；S=小型；雄性处理：H=与其它雄性一起饲养；I=被隔离的雄性）。

**图2** 实验1中交配持续时间的作用。左侧面板显示了（a）交配持续时间与交配失败之间的关系（配对是否产下若虫[0]或未产下[1]），以三次样条曲线表示（N=306）。数据由圆圈表示，颜色反映了给定体型和交配状态的个体数量（颜色越深表示重复次数越多）。虚线表示预测线上方和下方的1个标准误差。右侧面板显示了（b）交配持续时间与成功产下若虫的配对所产若虫数量之间的关系（N=213）。所有处理的线性回归结果以虚线表示。处理代码与图1相同。

**实验2：操纵雄性在交配前的雌性经历**

在这项实验中的165只雄性个体中，有125只（75.8%）在交配试验期间进行了至少一次交配（超过30分钟），有40只雄性未能交配。在仅进行了一次交配的102只雄性中，有64只的雌性伴侣产下了若虫，隐秘交配失败率为37.3%。

在交配前性选择方面，雄性在交配试验前的竞争对手经历影响了交配是否发生。之前有机会与雌性发生性接触的雄性比完全与雌性隔离的雄性（处理A：61.0%）或在交配试验前无法与雌性发生性接触的雄性（处理N：84.9%）更不容易交配（χ22=10.35，P=0.006；图3a）。较大的雌性更有可能参与交配（χ21=4.64，P=0.03；图4a），然而，雄性处理与雌性体型之间在是否交配方面没有交互作用（χ22=4.99，P=0.082）。

在发生交配的配对中，有50对（40.0%）几乎立即开始交配。在交配试验前无法与雌性发生性接触的雄性比完全被隔离的雄性（处理I：47.7%）或在处理前有机会与雌性发生性接触的雄性（处理A：50.0%）更不容易立即交配（χ22=6.74，P=0.034）。雌性体型或雄性处理之间的交互作用也没有影响（χ21=0.82，P=0.364 和 χ22=0.15，P=0.926）。这些关于交配前选择的结果表明，雄性的处理前经历对雄性行为有一定影响。然而，观察更长的交配尝试窗口并未显示出任何雄性处理（或雌性体型）的影响（数据未显示），因此对交配潜伏期的任何影响可能是短暂的，因为更多的配对开始尝试交配。

发生交配的雌性产卵的可能性远高于未发生交配的雌性（79.2% vs 40.0%；χ21=20.8，P<0.0001）。在交配后性选择方面，如果我们现在只考虑那些进行了一次交配的配对，对于那些发生交配的雌性来说，产卵的可能性与雌性体型高度正相关（χ21=21.2，P<0.0001；图4b）。雄性处理并未影响雌性的产卵（χ22=1.61，P=0.448；图3b），雄性处理与雌性体型之间也没有交互作用（χ22=1.85，P=0.396）。

产卵也与交配持续时间高度正相关（β=0.015±0.003；χ21=39.8，P<0.0001）。交配持续时间也与雌性体型高度正相关（F1,96=15.4，P=0.0002；图5a；见方法部分）。交配持续时间不受雄性处理的影响（F2,96=0.04，P=0.962）或它们之间的交互作用（F2,96=2.14，P=0.122）。

在避免交配失败和产生一些若虫方面，交配持续时间再次与产生若虫的数量高度正相关（β=0.013±0.003；χ21=34.3，P<0.0001；图4d）。有若虫的配对平均交配时间为317.6±7.9分钟，而经历交配失败的配对平均交配时间为189.9±20.1分钟（这进一步证实了与L. simulans物种的交配失败相关的交配过程仍然相对较长，与其他许多昆虫物种甚至其他动物相比）。较大的雌性更有可能避免交配失败（χ21=23.5，P<0.0001；图4c），这再次支持了雄性对雌性体型进行隐性选择的观点。然而，其他变量并未影响产生若虫的可能性（雄性处理：χ22=2.14，P=0.343；雄性处理与雌性体型之间的交互作用：χ22=0.42，P=0.812；图3c）。当考虑配对产生的若虫数量时，雌性体型的重要性也得到了凸显。较大的雌性产生的若虫数量也显著更多（F1,58=15.3，P=0.0002；图5b），但与产卵情况类似，产生的若虫数量不受雄性预处理或雄性预处理与雌性体型之间交互作用的影响（F2,58=0.70，P=0.501和F2,58=2.1，P=0.132；图3d）。最后，对于产生若虫的雌性来说，交配持续时间本身与产生的若虫数量没有显著关联（F1,62=0.81，P=0.373）。

图3：实验2中雌性体长和雄性预处理的作用。图表显示了（a）处于交配状态的配对比例（N=165），（b）交配后产卵的雌性比例（N=102），（c）交配后成功产若虫的配对比例（N=102），以及（d）交配一次并成功产若虫的配对平均产若虫数量（N=64），这些数据都与雄性预处理和雌性体型相关。雄性要么被隔离，要么在交配试验前被允许与雌性进行性接触，要么被允许有限的非性接触。为了清晰和可视化，雌性体型被分为两个等级：深蓝色条形代表体型大于平均体长的雌性（>10.51毫米），浅灰色条形代表体型小于平均体长的雌性（<10.51毫米）。关于雌性体长作为连续变量的关系在图4中有更详细的展示。误差条代表二项式标准误差。

图4：实验2中雌性体长和性选择。图表显示了雌性体长（毫米）与（a）配对是否发生交配（N=165），（b）雌性是否产卵，（c）配对是否经历交配失败，以及（d）交配持续时间（分钟）与交配失败之间的关系。注意，b、c和d仅包括那些成功交配一次的配对（N=102）。所有关系均以三次样条曲线表示，细节如图2所示。

图5：实验2中雌性体长（毫米）与（a）交配持续时间（分钟）之间的关系，以及（b）交配一次并成功产若虫的配对产生的若虫数量（N=64）。实线代表线性回归。

讨论：隐性雄性选择仍然是一种尚未得到广泛研究的性选择机制。与隐性雌性选择一样难以研究，隐性雄性选择也挑战了我们对雄性和雌性在性选择中角色的某些假设，特别是如果它涉及到在交配已经开始后选择不射精的情况。越来越多的人接受这样的观点：尽管精子数量可能很多，但它们并不一定“廉价”（Wedell等人，2002年）。然而，对我们来说，想象雄性在交配过程中（例如生殖器已经完全接触的情况下）选择不射精仍然不太直观。然而，Lygaeus simulans雄性的隐性mate选择可以解释该物种中观察到的高交配失败率，因为雄性选择不将精子传递给与其交配的雌性（Balfour等人，2024a）。尽管有有限且不一致的证据表明该物种的雄性在交配前会选择较大的雌性，但在众多研究中，雄性在交配过程中的决策最为一致，即雄性更倾向于将精子传递给较大的雌性（见引言）。但到目前为止，我们还没有排除另一种可能性，即较大的雌性只是更愿意接受精子，或者相反，较小的雌性不太愿意接受精子。

在这里，我们试图通过操纵雄性对特定体型雌性的评价来排除雌性的影响。在我们的第一个实验中，我们改变了雄性在交配试验前对竞争对手的经验。虽然我们得到了之前研究的关键结果，即较大的雌性更有可能产生若虫，且交配持续时间是精子传递的关键相关因素，但我们没有发现雄性处理与这些结果有交互作用。这表明至少在短期内，雄性对竞争对手的经验不会改变它对遇到的雌性的评价。在姐妹物种Lygaeus equestris中，当雄性同时面对雌性和其他雄性竞争者时，它们的交配时间更长，这表明在精子竞争更可能的情况下，交配后的配偶保护行为更强（Burdfield-Steel和Shuker，2014年）。否则，几乎没有证据表明之前的经验对雄性或雌性的交配行为有强烈影响（Balfour，2023年；尽管参见Balfour等人，2026年的研究，其中先前与异种个体的经验降低了未来与同种和异种个体交配的可能性）。这些昆虫似乎更关注当前的情况，而不是之前的交配历史或经验。

同样，在我们的第二个实验中，我们改变了雄性在交配试验前接触雌性的机会，较大的雌性更有可能产卵并产生若虫，但这同样与雄性处理无关。交配持续时间也与交配失败有很强的关联，在这个实验中——可能由于实验2中雌性体型范围更广——交配持续时间也与雌性体型呈正相关，但与雄性处理无关。

在交配前的性选择方面，两个实验中都没有发现雌性体型与交配可能性之间有令人信服的关联，只有在实验2中，较大的雌性交配的可能性略有显著增加，这加强了之前研究的趋势，即在该物种及其近亲L. equestris中，交配前对体型的选择是不一致的（Dougherty和Shuker，2014年，2016年；Dougherty等人，2015年；Balfour等人，2020年，2024a，c）。然而，在实验2中，如果雄性之前有过性接触，它们交配的可能性较低，因此我们在实验2中的操作至少对雄性和雌性的交配结果产生了一些影响，表明我们成功操纵了雄性随后对雌性的反应的某些方面。那些在交配试验前有过非性接触的雄性更快速开始交配的弱显著效应也支持了这一点，但这种效应并不强烈，并且在试验开始15分钟后就消失了。

区分隐性mate选择中的雄性和雌性成分是具有挑战性的（Pitnick和Brown，2000年）。我们采取的方法是实验性的，试图通过操纵雄性的经验来改变雄性对特定雌性的评价和选择。我们希望独立于雌性对雄性的任何了解来进行这项操作。在我们的第一个实验中，我们改变了雄性在交配试验前对竞争对手的经验。虽然我们得到了之前研究的关键结果，即较大的雌性更有可能产生若虫，且交配持续时间是精子传递的关键相关因素，但我们没有发现雄性处理与这些结果有交互作用。这表明至少在短期内，雄性对竞争对手的经验不会改变它对随后遇到的雌性的评价。在姐妹物种Lygaeus equestris中，当雄性同时面对雌性和其他雄性竞争者时，它们的交配时间更长，这表明在精子竞争更可能的情况下，交配后的配偶保护行为更强（Burdfield-Steel和Shuker，2014年）。否则，几乎没有证据表明之前的经验对雄性或雌性的交配行为有强烈影响（Balfour，2023年；尽管参见Balfour等人，2026年的研究，其中先前与异种个体的经验降低了未来与同种和异种个体交配的可能性）。这些昆虫似乎更关注当前的情况，而不是之前的交配历史或经验。

同样，在我们的第二个实验中，我们改变了雄性在交配试验前接触雌性的机会，较大的雌性更有可能产卵并产生若虫，但这同样与雄性处理无关。交配持续时间也与交配失败有很强的关联，在这个实验中——可能由于实验2中雌性体型范围更广——交配持续时间也与雌性体型呈正相关，但与雄性处理无关。

在交配前的性选择方面，两个实验中都没有发现雌性体型与交配可能性之间有令人信服的关联，只有在实验2中，较大的雌性交配的可能性略有显著增加，这加强了之前研究的趋势，即在该物种及其近亲L. equestris中，交配前对体型的选择是不一致的（Dougherty和Shuker，2014年，2016年；Dougherty等人，2015年；Balfour等人，2020年，2024a，c）。然而，在实验2中，如果雄性之前有过性接触，它们交配的可能性较低，因此我们在实验2中的操作至少对雄性和雌性的交配结果产生了一些影响，表明我们成功操纵了雄性随后对雌性的反应的某些方面。那些在交配试验前有过非性接触的雄性更快速开始交配的弱显著效应也支持了这一点，但这种效应并不强烈，并且在试验开始15分钟后就消失了。

解开隐性mate选择中的雄性和雌性成分是具有挑战性的（Pitnick和Brown，2000年）。我们采取的方法是实验性的，试图通过操纵雄性的经验来改变雄性对特定雌性的评价和选择。我们希望独立于雌性对雄性的任何了解来进行这项操作，以消除雌性的影响。在这两个实验中，我们的努力只取得了部分成功。在实验1中，与其他雄性一起饲养的雄性可能会保留一些其他雄性的化学信号（如通过接触传播的角质层烃类化合物）。同样，在实验2中接触雌性的雄性也可能有类似的嗅觉信号，尤其是在那些可以与雌性交配的雄性处理组中。这样的雄性的角质层上可能残留有雌性的化学信号，实际上雌性也可能能够辨别出雄性之前是否交配过（尽管我们注意到这种化学信号在该物种中的mate选择中的作用，或者它们在性别之间传递的程度尚未得到验证）。然而，如果存在这种部分雌性关于雄性先前经验的影响，似乎并不强烈。我们的任何操作都没有影响交配后的结果。

另一种方法，借鉴早期关于隐性雌性选择的研究，是通过方差分解方法来区分雄性和雌性的影响，即在类似于数量遗传学实验的设计中，将受精成功分为雄性和雌性成分（有关讨论，请参见Birkhead，1998年，2000年；Telford和Jennions，1998年；Pitnick和Brown，2000年；需要注意的是，将成功的变化归因于雄性或雌性并不一定意味着因果关系，因为两性在交配过程中都可能是非随机的参与者）。之前的关于CMC的研究利用了这种方法（Barbosa，2011年；Anastastio等人，2023年）。同样，也有一些相关的数据。Greenway和Shuker（2015年）将雄性与多个雌性交配，发现交配失败在个体雄性之间具有显著的重复性（R±SE=0.415±0.07），表明有些雄性一致地更有可能使雌性受精（即这代表了雄性在选择上的差异性；注意，在那个实验中雌性是随机分配的）。或者，这些数据可以解释为有些雄性一直不受雌性的欢迎（但参见Greenway等人，2017年），或者始终无法机械地使雌性受精。Balfour等人（2024a）的数据表明，这种重复性与机械性无能无关，因为将配对保持更长时间可以减少隐性交配失败，表明成功的精子传递没有内在障碍。Greenway和Shuker（2015年）的数据可能提供了关于L. simulans中雄性对成功精子传递影响的一些最强证据（也参见Greenway等人，2017年），但那篇论文并没有从隐性雄性选择的角度解释这些数据；直到发现雌性体型与精子传递之间存在强烈且一致的相关性（Balfour等人，2024a）之后，我们才开始强烈怀疑隐性雄性选择。然而，我们仍然缺乏直接将这种雄性的重复性与雌性对体型的交配后偏好联系起来的数据。此外，我们还注意到，目前我们对缺乏精子传递与未能产生后代之间的因果关系的解释依赖于Greenway等人（2017年）的数据，他们显示超过90%未能产生后代的雌性的储精囊中没有精子。因此，进一步验证我们观察到的隐性交配失败与未能接收精子之间的强烈关联将是非常有价值的。

关于雌性，之前的精子竞争实验中有证据表明，有些雌性比其他雌性更有可能接收精子。虽然这不是正式的重复性分析，但Balfour（2020年）显示了雌性的非随机受精成功，这与雌性在受精过程中起作用是一致的。这也许并不令人惊讶，特别是考虑到L. simulans和L. equestris中交配后对雄性插入器官长度的选择稳定模式（有关观察和实验数据，请参见Tadler等人，1999年；Dougherty等人，2015年；Dougherty和Shuker，2016年）。雌性的生殖形态和/或行为显然可以与雄性受精相关。然而，最近的一项后续实验包括了对雌性体型的实验性操纵，发现雌性的受精成功仅与体型相关（Balfour等人，2024c），当去除体型差异后，雌性的受精成功变化符合预期。综合这些证据来看，它们更支持雄性对体型较大的雌性存在“隐性选择”行为，同时也存在一些雌性对中等大小雄性生殖器的“隐性选择”倾向。总之，我们尝试通过两种不同的方式来影响雄性，以改变它们将精子传递给特定体型雌性的概率，从而更明确地证明该物种中存在雄性的“隐性选择”现象。虽然研究结果证实体型较大的雌性更有可能接收到精子并产下受精卵和后代，但我们仍缺乏确凿的证据。在Lygaeus simulans物种中，区分精子竞争、雌性的“隐性选择”以及雄性的“隐性选择”仍然是一个挑战，这在整个昆虫研究中都是普遍存在的问题。正如Pitnick和Brown（2000）所建议的，可能需要多种研究方法来揭示该物种及其他物种在交配后发生的性选择过程。