硅纳米颗粒通过调节生长、生理机能和基因表达，在寒冷胁迫下增强Elymus nutans幼苗的耐寒性

《Food and Energy Security》：Silicon Nanoparticles Enhance Cold Tolerance in Elymus nutans Seedlings by Regulating Growth, Physiology, and Gene Expression Under Cold Stress

　　**摘要**

寒冷胁迫是影响牧草生长、发育、产量和品质的主要非生物胁迫因素之一。作为一种新型农业纳米材料，硅纳米颗粒（SiNPs）在调节植物应激反应方面展现出独特的潜力。然而，它们在牧草抗寒反应中的作用机制仍不甚明了。本研究旨在通过生理学和转录组学分析，探讨SiNPs在Elymus nutans（E. nutans）抗寒机制中的作用。实验中，E. nutans幼苗分别接受了3小时和48小时的寒冷胁迫处理，部分样本同时施用了SiNPs。3小时寒冷胁迫后，施用SiNPs的幼苗中脯氨酸（Pro）含量增加了16.38%；48小时寒冷胁迫后，超氧化物歧化酶活性增加了7.92%，叶绿素（Chl）含量增加了22.74%，脱落酸（ABA）含量减少了12.83%。转录组学分析显示SiNPs具有时间依赖性的调控效应：3小时寒冷胁迫诱导了与光合作用相关的基因表达，而48小时寒冷胁迫则促进了核糖体生物合成和氨基酸生物合成基因的上调。加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出两个核心模块（skyblue和floralwhite），它们分别富集于光合作用和次级代谢途径，与抗寒生理性状密切相关。综上所述，SiNPs通过协同调节光合作用保护、核糖体重建和氨基酸代谢，在不同胁迫持续时间下增强了E. nutans QL20-04（QL）品种的抗寒性。本研究为提高高山草地的抗寒能力以及优化SiNPs在寒冷脆弱农业生态系统中的应用提供了新的分子机制见解。

**1 引言**

在全球变暖的背景下，极端寒冷事件变得越来越频繁和强烈，成为限制植物生长发育并威胁生态系统稳定的关键非生物胁迫因素之一（Shao等人，2024年；Yousefi等人，2026年）。寒冷胁迫是指环境温度低于植物生长所需的最小温度或长时间缺乏热量，会对植物的生长发育产生不利影响，导致产量下降（Chen等人，2024年）。寒冷胁迫通过多种途径破坏植物的生理代谢，包括损害植物细胞膜的结构完整性、抑制光合作用和呼吸作用的代谢效率、诱导活性氧（ROS）的积累以及干扰正常的基因表达调控（Díaz-Narváez等人，2024年）。这最终可能导致生长停滞甚至死亡，对农业生产及生态安全构成严重威胁（Shaghaleh等人，2024年）。因此，揭示植物抗寒性的调控机制并开发高效、环保的应激响应技术已成为植物应激生理学和分子生物学领域的研究重点（Chen等人，2023年；Chen等人，2023年；Li等人，2024年）。Elymus nutans（E. nutans）是青藏高原高山草甸中广泛分布的关键建群种（Song等人，2025年）。它具有抗寒性强、耐旱、适应贫瘠土壤条件以及高适口性等优良特性（An等人，2022年；Long等人，2024年；Wang等人，2025年）。作为青藏高原及中国西北高海拔寒冷地区自然草地中的优势种，它也是退化草地生态恢复和人工草地建立的核心牧草物种（Zhang等人，2023年）。其生长区域年温度较低，昼夜温差显著，且经常遭受晚霜和冰冻等突发性寒冷胁迫（Zhang等人，2022年）。这些条件导致幼苗存活率低、生物量减少，严重限制了其生态功能和经济价值。然而，其抗寒性的内在调控机制仍不甚明了，有效增强其抗寒性的技术也缺乏，这成为高海拔寒冷地区草地资源可持续利用的瓶颈。硅（Si）作为一种有益于植物生长的元素，在提高植物抗逆性方面起着关键作用（Junedi等人，2023年；Nazim等人，2026年）。虽然传统硅肥可以适度改善植物的抗寒性、耐旱性和抗病虫害能力，但存在吸收效率低和作用缓慢等局限性（Singh等人，2025年）。SiNPs凭借其独特的物理化学性质——如较大的比表面积、高表面活性和强渗透能力，在植物体内的生物利用度更高（Mukherjee等人，2023年）。因此，近年来其在植物应激调控中的应用受到了广泛关注（Nie等人，2025年）。先前的研究证据表明，外源补充SiNPs可以缓解非生物胁迫对植物的损害（Sepasi等人，2024年）。这种缓解胁迫的效果通过多种调控机制实现，包括增强渗透调节物质的生物合成、减轻电解质泄漏和丙二醛（MDA）的积累、清除活性氧（ROS）以减弱其细胞毒性（Vafa等人，2026年）以及限制Na+离子的过量吸收（Alinia等人，2025年）。这些调控作用共同促进了叶片相对含水量、气孔导度、叶绿素（Chl）浓度、光系统II（PSII）活性和光合酶效率的提高，最终提升了作物的光合性能和生长活力（Tripathi等人，2016年；Hajizadeh等人，2021年；Akhtar和Ilyas，2022年）。目前，关于SiNPs在植物应对非生物胁迫中的研究主要集中在作物上，关于其在高山牧草中的应用报道较少。特别是，尚未有系统研究探讨其对E. nutans的影响。植物对寒冷胁迫的响应是一个复杂的过程，涉及生理代谢重编程和分子表达调控（Qian等人，2023年）。在生理层面，细胞膜通透性、抗氧化酶活性和渗透调节剂含量等指标是反映植物抗寒性的核心参数（Cheng等人，2020年；Zhang等人，2024年）。在分子层面，抗寒相关基因（如COR、CBF、ICE等基因家族）的表达调控以及信号通路的激活共同构成了植物抗寒性的分子基础（Yang等人，2019年；Eom等人，2022年；Chen等人，2023年；Chen等人，2023年）。然而，SiNPs如何通过“生理-分子”协同机制调节E. nutans的生理和代谢过程，从而影响抗寒相关基因的表达并最终增强抗寒性，目前尚不清楚。基于此，本研究以E. nutans为研究对象，通过外源施用SiNPs并结合寒冷处理，分析了其在寒冷条件下的生理变化。同时，利用转录组技术阐明了SiNPs增强E. nutans抗寒性的生理基础和分子调控机制。本研究旨在为开发高山牧草的抗寒调控技术提供理论基础和技术支持，从而推进高海拔寒冷地区草地生态恢复和人工草地的建立。

**2 材料与方法**

**2.1 植物材料与寒冷处理**

实验材料为对寒冷敏感的QL20-04（QL）品种。选择大小均匀、饱满的种子在培养皿中发芽11天，选出50株生长均匀的幼苗，移植到混合基质（泥炭藓：蛭石：珍珠岩=3:1:1）中。在人工气候室中培养，温度设置为25°C/20°C（昼夜），光照周期为16小时/8小时（昼夜），光照强度为20,000 lx，相对湿度为70%。使用Hoagland营养液配方，每2天灌溉一次E. nutans幼苗。在两叶期，间苗至每盆保留30株生长均匀的幼苗。经过60天的生长后，幼苗接受4°C的寒冷胁迫处理。实验设计包括以下处理组：CK（25°C/20°C，用蒸馏水灌溉）；SiNPs（25°C/20°C，用200 mg/L SiNPs悬浮液灌溉；SiNPs购自上海McLean公司，粒径10~20 nm，悬浮液的浓度选择和制备参考Khan等人，2024年的研究）；CK+CT（4°C，用蒸馏水灌溉）；SiNPs+CT（4°C，用200 mg/L SiNPs悬浮液灌溉）。灌溉间隔为2天，处理时间分别为0小时、3小时、24小时、48小时和72小时。处理结束后，收集叶片并立即置于液氮中冷冻。将叶片储存在-80°C的超低温冷冻柜中，用于生理参数测量和转录组测序。每个处理组包含三个生物学重复。

**2.2 生理参数测量**

MDA含量使用植物MDA检测试剂盒（TBA比色法）测定（Diao等人，2014年）。在酸性和高温条件下，MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成棕红色的三甲二酮产物，该产物的最大吸收波长为532 nm，可通过比色法测定样品中的MDA含量（Solarbio，产品编号BC6415）。脯氨酸（Pro）含量使用Pro检测试剂盒（吲哚酚比色法）测定。Pro在酸性和高温条件下与 ninhydrin 反应生成稳定的红蓝色化合物，其最大吸收峰位于520 nm，可通过比色法计算Pro含量（Solarbio，产品编号BC0290）。超氧化物歧化酶（SOD）活性使用植物SOD检测试剂盒（Solarbio，产品编号BC5165）测定；超氧阴离子（O2?）通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应系统生成，这些O2?自由基与WST-1反应生成水溶性黄色甲酚胺产物，其特征吸收峰位于450 nm。SOD可清除O2?，从而抑制甲酚胺的形成，因此反应溶液颜色越深表示SOD活性越低，反之亦然。ABA含量使用ABA ELISA定量检测试剂盒测定；该试剂盒基于竞争性酶联免疫吸附测定法（Solarbio，产品编号SA8750）。样品中的ABA与HRP标记的ABA竞争结合预包被的anti-ABA抗体，450 nm处的吸光度与ABA浓度成反比，通过标准曲线计算ABA浓度。叶绿素（Chl）含量使用Chl检测试剂盒（Solarbio，产品编号BC0995）测定；用有机试剂提取Chl，通过测量663 nm和645 nm处的吸光度计算其含量。

**2.3 叶片总RNA提取与质量评估**

根据生理变化，从3小时和48小时寒冷处理组以及同时接受寒冷处理和SiNPs处理的组中选取样本。共提取12个样本的RNA，每个组包含3个重复。冷冻保存的叶片样本在液氮中研磨。使用RNAprep Pure Plant Kit（Tiangen，编号DP441）按照制造商的协议提取总RNA，并用RNase-free DNase I处理以去除基因组DNA污染。使用NanoDrop 2000分光光度计评估RNA的纯度和浓度。使用Agilent 2100 Bioanalyzer分析RNA完整性数（RIN）和28S/18S比值。质量控制标准如下：RNA浓度≥250 ng/μL，OD260/OD280比值在1.8至2.2之间，OD260/OD230比值≥1.0，260 nm处有正常的吸收峰。电泳检测的28S/18S比值≥1.4且RIN值>6.5的样本用于后续cDNA文库构建。

**2.4 PacBio和Illumina RNA-Seq文库制备与转录组测序**

全长转录组测序分析采用Pacific Biosciences（PacBio）的第三代测序技术。实验遵循Pacific Biosciences公司提供的Iso-Seq文库制备指南，由BGI-MGI Biotechnology Co. Ltd.执行。具体实验步骤如下：首先从24个样本中提取高质量RNA并混合均匀。使用NEB Next Single Cell/Low Input cDNA合成和扩增模块从mRNA合成并扩增全长cDNA。随后，对获得的全长cDNA进行PCR扩增，然后进行损伤修复和末端处理以确保文库质量。接着，按照PacBio SMRT测序要求连接SMRT哑铃接头，再用外切酶处理得到适合测序的文库。最后，通过PacBio Single Molecule, Real-Time Sequencing（SMRT）技术对通过质量控制的文库进行测序。使用Illumina RNA-Seq技术平台构建和测序转录组文库。使用基于磁珠的寡核苷酸（dT）捕获技术富集每个样本的mRNA。用Fragmentation Buffer对mRNA进行随机片段化。以mRNA为模板，用随机六聚体引物合成cDNA的第一链。随后，加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I合成cDNA的第二链。纯化的双链cDNA经过末端修复、A-tailing和测序接头连接。使用AMPure XP珠子进行片段大小选择和纯化。最后，通过PCR扩增通过质量控制的文库，将其加载到Illumina NovaSeq 6000测序平台上进行高通量测序。

**2.5 全长转录本组装与结构分析**

分析来自测序仪的原始测序数据，将原始测序数据转换为CCS序列。根据3′、5′引物和PolyA信号的存在与否，将序列分类为全长（FL）或非全长（NFL）。随后，使用SMRTLink软件中的IsoSeq模块对全长非嵌合序列进行了聚类。经过多轮聚类和优化，最终获得了高质量（HQ，准确率>99%）和低质量（LQ）的转录本。使用cd-hit（v4.6.1）和参数-c 0.99 -M 0 (cd-hit-est)（Li和Godzik 2006）去除了冗余序列，以获得唯一且完整的非冗余转录本序列。使用基于OrthoDB（v9）数据库的BUSCO（v3.0.2）评估了非冗余转录组的完整性（Sim?o等人2015）。使用DIAMOND软件将非冗余转录本序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库进行了比对。InterProScan使用集成的InterPro数据库分析了非冗余转录本的GO同源性结果。在预测了非冗余转录本的氨基酸序列后，使用HMMER软件将它们与Pfam数据库进行了比对，得到了转录本的注释信息。

2.6 第二代测序数据分析

每个样本的原始测序数据都经过了质量控制。去除含有测序引物、接头和低质量读段的序列后，得到了高质量的干净数据，并对其Q30值和GC含量进行了统计分析。以第三代测序得到的非冗余转录本作为参考基因组，使用Bowtie2软件将每个样本的读段映射到全长转录本序列上。使用FPKM（每千碱基百万个片段）计算了每个转录本的表达水平。使用R包Hmisc（v4.7-0）计算了样本之间的Spearman相关系数，并使用pheatmap（v1.0.12）包和“correlation”聚类方法进行了可视化聚类分析。使用DESeq2 R包（1.34.0）进行了样本间的差异表达分析，计算了处理组间转录本的倍数变化。根据倍数变化≥2和FDR<0.01的标准筛选了差异表达基因（DEGs）。使用超几何分布算法对DEGs进行了GO和KEGG通路富集分析，并根据FPKM值绘制了表达热图。使用R包Mfuzz（v2.56.0）进行了基因表达的时间序列分析，并将数据分成了不同的簇。

2.7 WGCNA

使用相应的R包进行了WGCNA分析，以探索基因表达谱。该方法基于相关系数构建基因模块并聚类具有相似表达模式的基因。进一步评估了这些模块与表型特征之间的关联，p值<0.05被视为统计学上显著，旨在识别与目标特征相关的关键基因（Langfelder和Horvath 2008）。最初，使用FDR<0.01和倍数变化>1.5的阈值筛选了DEGs。随后，保留了FPKM值>1的DEGs作为WGCNA的表达矩阵。分析中使用的表型特征主要包括MDA、Chl、SOD、Pro和ABA。使用Cytoscape v3.3.0软件可视化了基因共表达网络（Shannon等人2003）。

2.8 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证

为了验证SiNPs介导的Echinochloa crus-galli冷响应中差异表达基因（DEGs）的可靠性，本研究选择了10个相关基因进行qRT-PCR验证。使用Primer 5软件设计了基因特异性引物（表1）。qRT-PCR定量使用来自中国南京的Vazyme公司的试剂盒进行。反应体系包含20μL，其中包括10μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、1μL cDNA模板和8μL无菌蒸馏水。PCR扩增程序包括在95°C下进行10分钟的模板变性，然后是40个循环的扩增（95°C下变性30秒，60°C下延伸1分钟）。使用2?ΔΔCt方法计算了相对基因表达水平（Adnan等人2011）。qRT-PCR分析进行了三次技术重复和三次生物学重复。使用Elymus nutans甘油醛-3-磷酸脱氢酶（EnGAPDH）作为参考基因（Liu等人2023）。GAPDH参与核心糖酵解过程，表达量适中，无组织特异性，对短期压力不敏感，适合用于qRT-PCR中的标准化。使用geNorm和NormFinder软件验证了EnGAPDH的稳定性，其M值分别为0.38和0.42，远低于1.5的阈值。表1列出了用于qRT-PCR分析的10个引物。

2.9 数据分析

数据使用SPSS 25.0软件（IBM，芝加哥，IL，美国）进行了统计分析，采用了Duncan的多重比较方法，显著性水平为p<0.05（如图S1和表S1所示，实验数据符合正态分布和方差齐性，满足Duncan多重范围测试的先决条件）。图表使用SigmaPlot 12.5（Systat Software，美国）和Microsoft Excel 2010生成。使用R 4.0软件进行了基因本体（GO）和KEGG通路的可视化分析。热图使用TBtools创建。所有数据均表示为平均值±标准差（SD），本研究中描述的所有值代表三个生物学重复的平均值。

3 结果

3.1 E. nutans在冷胁迫条件下的生理指标变化

E. nutans幼苗在不同处理和冷胁迫（CT）持续时间下表现出不同的表型特征。在处理后3小时、24小时和48小时，四个处理组（CK、SiNPs、SiNPs+CT和CK+CT）的幼苗显示出一致的生长活力，叶片颜色鲜绿，叶片完全展开，没有明显的胁迫损伤。到72小时时，CK和SiNPs组的幼苗保持了良好的生长状态；SiNPs+CT组表现出轻微的叶片卷曲，没有显著的冷诱导损伤，而CK+CT组则表现出叶片萎蔫和下垂（一些幼苗有部分叶片卷曲），其生长活力明显弱于SiNPs+CT组（图1A）。

3.2 全长转录组测序数据的质量控制

对四个样本组进行了RNA提取：QL品种分别经过3小时和48小时的低温处理，以及3小时和48小时的SiNPs与低温联合处理，每组六个重复。通过混合24个样本以相同浓度构建了PacBio文库。从原始序列中提取了满足条件≥3次完整读取和序列准确率>0.9的CCS（Circular Consensus Read）序列。QL第三代全长转录组测序产生了669,464个CCS序列，平均长度为1962 bp，平均测序深度为37。在对CCS序列进行质量控制后——去除了cDNA引物序列、polyA序列和文库插入序列——第三代全长转录组测序得到了636,763个FLNC（全长非嵌合）序列。进一步将相似序列聚类成簇，要求≥6次完整读取，得到了231,888个来自QL第三代全长转录组的一致序列。其中，231,830个（99.97%）是高质量转录本，准确率超过99%。考虑到同一转录本的多个拷贝可能被分配到不同的簇中，以及全长转录测序过程中5′端的降解也可能由于5′端变异产生冗余序列，使用CD-HIT去除了转录本中的冗余序列。最终得到了157,273个非冗余转录本。

3.3 转录组完整性评估、编码区序列预测和转录本功能注释

使用BUSCO软件和OrthoDB作为参考数据库，构建了多个进化谱系的单拷贝基因集。通过将Setaria viridis的全长转录本与密切相关的物种的基因集进行比对，评估了非冗余转录本的完整性（图S2A）。在QL全长转录本中的1440个保守基因中，有1238个是同源序列，完全覆盖了目标基因集。这包括279个单拷贝基因和959个多拷贝基因。有56个基因不匹配，146个未对齐。这些未匹配的序列可能代表Eragrostis curvula中的物种特异性基因，具有识别独特耐寒基因的潜力。合并并去重了所有样本中的冗余转录本，得到了239,127个合并的去重转录本。使用TransDecoder软件预测转录本的编码区和相应的氨基酸序列，得到了227,097个开放阅读框（ORFs）（94.96%），其中包括144,933个完整的ORFs（60.61%）。图S2B显示了这些预测的完整ORF编码的蛋白质序列的长度分布。使用DIAMOND软件，将239,127个非冗余转录本序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库进行了比对。InterProScan使用集成的InterPro数据库分析了非冗余转录本的GO同源性结果。在预测了非冗余转录本的氨基酸序列后，使用HMMER软件将它们与Pfam数据库进行了比对，得到了转录本的注释信息。共有222,424个转录本（93.01%）在这些数据库中至少有一个注释（高度匹配的同源序列）。注释覆盖率在九个数据库中的范围从34.43%（76,571，COG）到99.09%（220,396，TrEMBL）不等（表2）。与其他物种相比，Elymus nutans的转录本在三种草类Triticum turgidum（小麦属）、Aegilops tauschii（山羊草属）和Hordeum vulgare（大麦属）中显示出最多的同源序列数量，分别为65、64和63个同源序列。这些物种中的同源序列数量最多，分别为65,085（29.95%）、65,961（29.89%）和35,483（16.33%）（图2）。

3.4 转录组分析

对四个处理组的叶片进行了转录组测序：CK+3CT、SiNPs+3CT、CK+48CT和SiNPs+48CT（表3）。RNA测序和质量控制后，平均GC含量为53.48%，Q30读段覆盖率为91.36%至92.93%。这表明测序质量很高，适合后续分析。使用倍数变化≥2和FDR<0.01的标准识别了DEGs。如图3A所示，在SiNPs+3CT与CK+3CT之间发现了2633个DEGs（1461个上调和1172个下调），而在SiNPs+48CT与CK+48CT之间发现了5007个DEGs（3415个上调和1592个下调）。不同比较组合之间差异基因的Venn图分析显示了254个共同的差异基因（图3B）。表3. 测序数据统计。样本
阅读数量
基数
GC含量（%）
Q30（%）

CK+3CT1
22,522,603
6,748,639,185
54.60
92.93

CK+3CT2
21,406,387
6,415,878,824
54.18
91.83

CK+3CT3
23,116,547
6,926,275,883
53.59
92.52

SiNPs+3CT1
23,346,726
6,995,961,774
53.41
92.35

SiNPs+3CT2
22,710,916
6,806,456,077
54.34
92.26

SiNPs+3CT3
22,157,015
6,640,587,120
54.06
92.24

CK+48CT1
22,272,901
6,675,036,160
52.89
92.31

CK+48CT2
23,137,203
6,934,511,078
52.37
92.07

CK+48CT3
23,102,347
6,923,097,544
53.60
92.20

SiNPs+48CT1
23,740,311
7,115,737,885
53.28
91.36

SiNPs+48CT2
22,962,216
6,881,912,403
52.57
92.03

SiNPs+48CT3
22,905,381
6,865,038,866
52.85
91.82

图3：在PowerPoint图查看器中打开
差异表达基因（DEGs）表达的变化。(A) DEGs的上调与下调调控。(B) 不同处理组中DEGs之间的重叠维恩图。(C) SiNPs+3CT与CK+3CT中DEGs的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。(D) SiNPs+48CT与CK+48CT中DEGs的KEGG通路富集分析。对不同处理组之间的DEGs进行了GO富集分析，并将DEGs注释为生物过程、细胞过程和分子功能类别（图S3）。SiNPs+3CT与CK+3CT组的DEGs主要参与以下生物过程：代谢过程、细胞过程和单生物体过程。在细胞成分中，它们主要与膜、细胞和细胞部分相关。在分子功能中，催化活性、结合和转运蛋白活性占比较高（图S3A）。SiNPs+48CT与CK+48CT组的DEGs主要参与以下生物过程：代谢过程、细胞过程和单生物体过程。在细胞成分中，它们是细胞、细胞部分和膜。在分子功能中，它们是催化活性、结合和转运蛋白活性（图S3B）。对DEGs进行了KEGG通路富集分析。SiNPs+3CT与CK+3CT组中富集程度最高的三个通路是光合作用、淀粉和蔗糖代谢以及苯丙素生物合成（图3C）。SiNPs+48CT与CK+48CT组中富集程度最高的三个通路是核糖体、氨基酸生物合成和碳代谢（图3D）。

3.5 与光合作用和淀粉及蔗糖代谢通路相关的DEGs
在冷胁迫下，SiNPs处理的E. nutans幼苗中与光合作用相关的基因表现出诱导表达。如图4A所示，在SiNPs+3CT与CK+3CT比较组中，共有14个基因上调，包括2个光系统I（PS I）、8个光系统II（PS II）和4个细胞色素（Cyt）基因；6个基因下调，包括1个PS I基因、1个PS II基因、1个铁氧还蛋白-NADP还原酶（FNR）基因和3个质体蓝蛋白（PC）基因。在SiNPs+48CT与CK+48CT比较组中，没有光合作用相关基因上调或下调，表明在短期冷胁迫下，SiNPs可能调节E. nutans的光合作用响应。

3.5 硅纳米颗粒（SiNPs）对E. nutans幼苗在冷胁迫下光合作用和淀粉及蔗糖代谢通路的影响。如图4B所示，在冷胁迫下，SiNPs共诱导了21个与淀粉和蔗糖代谢通路相关的DEGs，其基因表达模式随冷胁迫持续时间而变化。在SiNPs+3CT与CK+3CT比较组中，9个基因上调，11个基因下调。上调的基因包括4个糖基水解酶（GH），它们催化糖苷键的水解；1个糖基转移酶（GT）；2个豆科凝集素结构域（LLD）基因；1个海藻糖-磷酸酶（TPP）基因和1个α-淀粉酶（AMY）基因，它们催化淀粉的水解。下调的基因包括3个GH、7个GT和1个海藻糖-6-磷酸酶（TPP）基因。在SiNPs+48CT与CK+48CT比较组中，3个基因上调：2个GT基因和1个SPP基因。

3.6 与核糖体通路相关的DEGs
在冷胁迫下，SiNPs处理的E. nutans中与核糖体通路相关的基因被诱导。在SiNPs+48CT与CK+48CT比较组中，我们确定了126个显著上调的DEGs（图5）。其中，77个DEGs调节大亚基核糖体蛋白，而34个DEGs调节小亚基核糖体蛋白。有趣的是，在SiNPs+3CT与CK+3CT比较组中，这126个与核糖体通路相关的DEGs没有表现出上调或下调。这表明SiNPs处理在早期冷胁迫暴露期间保持了相对稳定的核糖体功能。然而，在长期冷胁迫（48小时）下，它促进了核糖体的重建，从而实现了更全面和有效的应激响应。

3.7 与氨基酸生物合成通路相关的DEGs
氨基酸作为天然抗氧化剂，通过清除ROS、发挥协同抗氧化作用、促进抗氧化次生代谢物的合成以及抑制氧自由基的生成等机制，帮助植物抵抗非生物胁迫引起的氧化应激。基于KEGG富集分析，我们确定了与氨基酸生物合成相关的DEGs（图6）。本研究共确定了37个DEGs。在SiNPs+3CT与CK+3CT比较组中，10个基因上调，而27个基因基本保持不变。上调的基因包括4个支链氨基酸氨基转移酶（ILVE）、4个精氨酸酶（ARG）和2个柠檬酸合成酶（CS）。在SiNPs+48CT与CK+48CT比较组中，27个DEGs上调，10个基因下调。上调的基因包括2个核酮糖-磷酸-3-异构酶（RPE）、1个核糖-5-磷酸异构酶A（RPIA）、1个咪唑甘油-磷酸合成酶（HIS7）、1个3-脱氢奎宁酸脱水酶（aroDE）、1个天冬氨酸-预苯酸氨基转移酶（PAT）、2个丙酮酸激酶（PK）、2个二羟基酸脱水酶（ILVD）、2个苏氨酸脱水酶（ILVA）、2个丝氨酸O-乙酰转移酶（CYSE）、2个半胱氨酸合成酶（CYSK）、2个丙氨酸转氨酶（GPT）、1个乙酰鸟氨酸脱乙酰酶（ARGE）和3个精氨酸琥珀酸裂解酶（ARGH）以及2个丙氨酸转氨酶（ALT）。下调的基因与SiNPs+3CT与CK+3CT中上调的基因一致。

3.8 WGCNA分析
在过滤掉低表达基因后，WGCNA保留了12,924个DEGs。为了确保网络是无尺度的且生物学上有意义，当平方相关系数达到0.8时，选择了一个15的软阈值来定义邻接矩阵（图7A）。随后，使用动态树切割算法生成了基因模块，最小模块基因计数为30，最大模块距离为0.25。相似度高的模块进一步合并（图7B）。如图7C所示，最终分析得到了20个基因模块。Chl模块和skyblue模块之间存在强烈的正相关，而MDA、Pro、SOD和ABA与该模块表现出强烈的负相关。Pro和SOD与floralwhite模块表现出强烈的正相关。

3.8 硅纳米颗粒（SiNPs）对E. nutans幼苗在冷胁迫下响应的加权基因共表达网络分析（WGCNA）。(A) 无尺度软阈值分布图；(B) WGCNA基因聚类树；(C) WGCNA模块与性状之间的相关热图；(D) skyblue模块中差异表达基因（DEGs）的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；(E) floralwhite模块中DEGs的KEGG通路富集分析；(F) floralwhite模块的共表达网络分析；(G) floralwhite模块的共表达网络分析；(H) 八个选定枢纽基因的表达热图。对skyblue和floralwhite模块进行了GO富集分析（图S4）和KEGG富集分析。结果表明，“叶绿体类囊体”和“核糖体结构成分”是skyblue和floralwhite模块中最为显著的GO类别。skyblue模块中富集程度最高的KEGG通路是昼夜节律-植物、苯丙素生物合成和黄酮类生物合成通路（图7D）；而floralwhite模块中富集程度最高的通路是核糖体和真核生物中的核糖体生物合成通路（图7E）。此外，我们还可视化了skyblue和floralwhite模块的共表达网络，以识别这些模块中的枢纽基因。skyblue模块中的关键基因包括ZQL_transcript_189758、ZQL_transcript_12100、ZQL_transcript_9190和ZQL_transcript_10070（图7F）；而floralwhite模块中的关键基因包括ZQL_transcript_119149、ZQL_transcript_48209、ZQL_transcript_41423和ZQL_transcript_185635（图7G）。根据这8个关键基因的热图，在SiNPs+48CT与CK+48CT中，有5个基因上调（图7H）。这些在模块内具有高连通性的8个枢纽基因与生理参数测量结果一致，为后续研究E. sibiricus的耐寒响应基因奠定了基础。

3.9 qRT-PCR验证RNA-Seq结果
为了验证转录组测序数据的准确性和可重复性，我们随机选择了9个DEGs进行qRT-PCR验证分析，结果如图8所示。使用FPKM和qRT-PCR方法评估基因表达模式后发现，尽管DEGs的倍数变化并不完全一致，但大多数候选基因的表达趋势与RNA-Seq数据一致。这些发现证实了本研究中RNA-Seq数据的可靠性和准确性。

4 讨论
冷胁迫作为农业生态系统中普遍存在的非生物胁迫因素，对农业生产的可持续性产生了重大不利影响（Zhao等人，2025年）。近年来，随着农业与纳米技术的逐步结合，纳米颗粒（NPs）在作物生产中的应用已被证明是一种有效的农艺方法，能够满足不断增长的全球食物需求。在各种NPs中，SiNPs在纳米农业中表现出特别显著的优势和适用性，增强了植物的抗胁迫能力并确保了稳定的作物产量（Dhakate等人，2022年）。本研究通过生理和转录组分析，在冷处理（3小时和48小时）以及SiNPs暴露下，结合WGCNA等生物信息学方法，研究了SiNPs介导的E. nutans QL品种的冷响应的分子机制。研究结果表明，SiNPs通过调节参与多个通路的基因表达来增强E. nutans的耐寒性，包括光合作用、蔗糖和淀粉代谢、核糖体通路以及氨基酸生物合成。此外，SiNPs在不同冷胁迫处理持续时间下表现出不同的响应机制。

4.1 SiNPs对E. nutans幼苗在冷胁迫下的生理参数的影响
膜脂质过氧化是冷胁迫引起的细胞损伤的标志（Qian等人，2024年），MDA含量被广泛认为是评估非生物胁迫下氧化损伤和细胞损伤程度的可靠指标（Zhou等人，2023年）。与未经处理的冷胁迫植物（CK+CT）相比，SiNPs预处理过的幼苗（SiNPs+CT）中MDA含量的一致减少表明SiNPs有效抑制了膜脂质过氧化（图1B）。这种保护作用可能归因于SiNPs增强了细胞壁结构并稳定了质膜完整性，这一机制在之前对Si处理的苜蓿（Rahman等人，2024年）和玉米（Sun等人，2021年）在冷胁迫下的研究中有报道。此外，SOD作为植物抗氧化防御系统的核心组成部分，在清除超氧阴离子以减轻氧化损伤中起着关键作用（Yan等人，2023年）。SiNPs+CT在48小时时的SOD活性升高（图1C）表明SiNPs在冷胁迫中期特异性激活了抗氧化响应，这与观察结果一致，即Si在冷暴露植物中上调了抗氧化酶活性以维持ROS平衡。SiNPs+CT在3小时时Pro含量的短暂增加（图1D）进一步支持了SiNPs参与渗透调节的作用，因为Pro的积累有助于在胁迫条件下维持细胞膨压和稳定生物分子（Singh等人，2022年）。冷胁迫通常通过降解叶绿素色素和抑制光系统（PS）活性来降低光合作用效率（Shanker等人，2024年）。SiNPs预处理过的幼苗中叶绿素损失的减少，特别是在48小时时的最大差异（22.74%）（图1E），突显了SiNPs在维持光合装置功能方面的保护作用（Iqbal等人，2021年）。这与最近的研究结果一致，即SiNPs通过调节气孔动态和增强碳同化酶活性来改善棉花在冷胁迫下的叶绿素含量（Liang等人，2023年）。SiNPs对叶绿素含量的保护也可能与减少PSI和PSII的光抑制有关，正如在冷胁迫下的Camellia oleifera中报道的那样，维持色素稳定性对于维持光合电子传输和能量供应至关重要（Xu等人，2022年）。对于高山生态系统中的主要牧草E. nutans来说，SiNPs介导的光合能力的保护确保了持续的光合产物生产，这对于抵抗冷胁迫和维持生长活力至关重要。ABA作为植物非生物胁迫响应中的核心信号分子，协调下游防御机制同时平衡生长与减缓生长之间的权衡（Guo等人，2021年）。SiNPs+CT在早期阶段（3小时和24小时）的ABA积累模式高于CK+CT，在后期阶段（48小时和72小时）较低（图1F），表明SiNPs微调了ABA信号以优化冷胁迫适应。在初始应激阶段，经过SiNPs预处理的植物中ABA水平的升高可能会加速气孔关闭，并诱导冷响应基因的表达，正如在苜蓿中Si增强耐寒性研究中报道的那样（Mangena 2022）。随后在48小时和72小时时ABA含量的下降可能反映了一种脱敏机制，以防止过度生长抑制，这与最近发现的涉及SnRK2激酶降解和B-RAF磷酸化调节的ABA信号系统一致（Vilela等人2015）。SiNPs对ABA动态的精确调节强调了其在平衡抗逆性和生长维持中的作用，这是植物在长期冷胁迫下的关键适应策略。

4.2 SiNPs介导的光合作用相关基因的转录激活增强了短期冷适应
光系统I（PS I）和II（PS II）是光合作用电子传递链的核心组成部分，它们的功能稳定性对于在非生物胁迫下维持光合作用能力至关重要（Mohammadi等人2021）。在冷胁迫3小时后，SiNPs预处理的幼苗中2个PS I、8个PS II和4个细胞色素（Cyt）基因的上调表明SiNPs特异性激活了与光能吸收和电子转移相关的基因表达。这种转录激活可能有助于稳定光系统的结构和功能，从而减轻冷诱导的光抑制。值得注意的是，在冷胁迫48小时后没有观察到不同表达的光合作用相关基因，这表明SiNPs对光合作用基因表达的调节作用仅限于短期应激响应。这种时间依赖性的模式可能反映了E. nutans对长期冷胁迫的动态适应：SiNPs迅速诱导光合作用基因表达以抵消光合作用装置的初始损伤，而在长期胁迫下植物会转向其他适应策略。在3小时时，少数PS I、PS II、铁氧还蛋白-NADP还原酶（FNR）和质体蓝蛋白（PC）基因的下调可能代表了一种精细调节机制，以平衡电子传递效率和活性氧（ROS）的产生，因为冷胁迫下光系统的过度电子泄漏会加剧氧化损伤。Gu等人（2025）证明，ABA通过WRKY22转录因子介导的PS II相关基因（如PsbA）的上调可以减轻冷胁迫下的光合作用损伤。

4.3 SiNPs在48小时低温胁迫下调节E. nutans叶片中的核糖体途径
核糖体作为植物细胞中蛋白质合成的核心分子机器，在维持细胞稳态和通过调节翻译效率和蛋白质合成特异性来介导应激适应方面起着关键作用（Guillaume-Sch?pfer等人2020）。本研究揭示了SiNPs在E. nutans幼苗冷胁迫下对核糖体途径的显著时间依赖性调节模式；在冷暴露3小时时没有观察到核糖体相关基因的差异表达，而在48小时时有126个基因显著上调（图5）。SiNPs+3CT与CK+3CT对比组中没有差异表达的核糖体相关基因表明，SiNPs预处理在冷胁迫的初始阶段有效保持了核糖体的结构和功能完整性。这与先前的研究结果一致，即外源Si化合物通过减少核糖体组分的氧化损伤并维持翻译保真度来保护玉米（Sun等人2025）和小麦（Mustafa等人2021）在非生物胁迫下的核糖体功能。在冷胁迫48小时时核糖体相关基因的大规模上调表明，SiNPs在长期冷暴露期间驱动核糖体的生物发生和功能重塑。大亚基和小亚基的核糖体蛋白（RPs）对于核糖体组装、mRNA结合和翻译延伸至关重要；它们的协调上调表明核糖体的从头合成和重建，形成了适应寒冷的翻译系统（Hussain等人2023）。Martinez-Seidel等人（2022）证明，冷诱导的拟南芥核糖体组成重塑促进了应激响应转录本的选择性翻译，我们的发现将这一机制扩展到了E. nutans，并强调了SiNPs在此过程中的调节作用。此外，核糖体生物发生是一个能量密集的过程，这些基因在48小时时的上调表明SiNPs也可能优化能量代谢，以支持核糖体的重建，形成了碳代谢和蛋白质合成之间的协同调节网络。

4.4 SiNPs在冷胁迫下协调E. nutans叶片中的氨基酸生物合成途径
氨基酸生物合成是支持植物非生物胁迫耐受性的核心代谢途径，因为氨基酸既作为渗透调节剂，又是抗氧化剂前体，以及信号分子，用于减轻氧化损伤和在冷胁迫下维持细胞稳态（Fuganti-Pagliarini等人2017；Qari等人2022）。在SiNPs预处理的幼苗中，3小时时4种支链氨基酸氨基转移酶（ILVE）、4种精氨酸酶（ARG）和2种柠檬酸合成酶（CS）的上调反映了早期应激的策略性反应。通过ILVE催化的反应合成的支链氨基酸对于植物的冷适应至关重要，它们在代谢抑制下作为替代能量底物，并通过降低相变温度来稳定膜脂质。ARG基因的诱导突显了精氨酸代谢的重要性，因为精氨酸是多胺（腐胺和亚精胺）和一氧化氮（NO）的前体，这些分子可以直接清除活性氧（ROS）并激活冷响应信号通路（Liang等人2018）。值得注意的是，连接糖酵解和三羧酸（TCA）循环的CS基因在两个时间点都一致上调，表明SiNPs增强了氨基酸生物合成的碳骨架供应，这一机制在之前对冷冻胁迫下的柑橘处理中也有所报道（Iqbal等人2024）。在3小时时没有广泛的DEG激活表明SiNPs在初始冷暴露期间优先考虑能量保存，专注于合成一小部分高优先级的氨基酸，以迅速抵消ROS爆发和膜损伤。这种有针对性的调节与植物在急性胁迫下的节能策略一致，其中非必需的代谢途径暂时被抑制，以将资源分配给核心防御机制（Divekar等人2022）。在48小时时27个氨基酸生物合成相关DEG的广泛上调表明SiNPs增强了氨基酸代谢，以支持长期冷适应。激活的基因涵盖了氨基酸合成的多个关键分支，包括碳骨架供应、必需氨基酸合成、抗氧化剂前体合成和精氨酸代谢的增强。值得注意的是，在48小时时10个DEG的下调与早期上调的基因（ILVE和ARG）一致，表明代谢从支链氨基酸和精氨酸的优先转向了更平衡的氨基酸谱型。这种动态调整避免了特定氨基酸的过度积累，这可能会产生代谢成本，并确保了蛋白质合成所需的多种氨基酸的合成（Aubert等人2025）。

4.5 WGCNA选定的耐寒性枢纽基因
在本研究中，通过对E. nutans幼苗在冷胁迫下的12,924个高置信度DEG进行WGCNA分析，识别出20个基因共表达模块，其中skyblue和floralwhite模块与关键的冷响应生理特征显示出强相关性（图7）。功能富集和枢纽基因分析进一步揭示了这两个模块通过不同的但协同的途径共同调节SiNPs介导的耐寒性：光合作用保护和次级代谢（skyblue模块）以及核糖体生物发生（floralwhite模块）。skyblue模块与叶绿素含量之间的强正相关，以及其与MDA、Pro、SOD和ABA的负相关，突显了其在维持光合作用完整性和减轻冷胁迫下氧化损伤中的关键作用。GO富集分析确定“叶绿体类囊体”是该模块中最高富集的术语。KEGG富集进一步显示skyblue模块在昼夜节律-植物、苯丙素生物合成和黄酮类生物合成途径中富集（图7D）。昼夜节律途径调节冷响应基因表达的时间，以优化生长和应激防御之间的能量分配，而苯丙素和黄酮类是关键的次级抗氧化剂，可以清除活性氧（ROS）并在非生物胁迫下稳定细胞膜。这些途径在skyblue模块中的富集表明SiNPs可能调节该模块以（1）维持类囊体膜稳定性和光合作用能力，（2）增强次级抗氧化剂生物合成以减轻氧化损伤，以及（3）微调昼夜节律以适应冷诱导的代谢扰动。这得到了最近研究的支持，这些研究表明Si介导的黄酮类生物合成基因的上调通过减少ROS积累增强了Camellia sinensis（Xie等人2024）和柑橘（Iqbal等人2024）的耐寒性。floralwhite模块与Pro/SOD含量之间的强正相关表明其在长期冷暴露期间增强应激防御中的关键作用。GO富集确定“核糖体结构成分”是最高富集的术语，KEGG分析确认了核糖体和核糖体生物发生途径的富集，这与我们之前的转录组发现一致，即SiNPs在冷胁迫48小时时促进核糖体重建。核糖体生物发生是一个能量密集的过程，它支持通过形成“冷特异性核糖体”来新合成冷响应蛋白，这些核糖体优先翻译应激相关的mRNA。该模块与Pro/SOD之间的正相关进一步表明，由floralwhite模块调节的核糖体生物发生直接支持参与渗透调节和ROS清除的蛋白质合成，增强了植物对长期冷胁迫的适应反应。skyblue和floralwhite模块之间的协同作用强调了SiNPs的整体调节网络；skyblue模块维持光合作用能量供应并在冷胁迫下减少氧化损伤，而floralwhite模块通过核糖体生物发生确保应激响应蛋白的有效合成。这两个过程紧密耦合，以优化资源分配并增强耐寒性。这种协同调节是植物在非生物胁迫下的常见适应策略，其中光合作用维持和蛋白质合成协调以平衡能量生产和防御。在skyblue和floralwhite模块中识别的八个枢纽基因在其各自模块内具有高连通性，可能是SiNPs介导的冷响应的核心调节因子。在SiNPs+48CT与CK+48CT对比组中五个枢纽基因的上调进一步表明，SiNPs在长期冷胁迫期间特异性激活了这些关键调节因子。例如，skyblue模块中的枢纽基因可能调节叶绿体类囊体稳定性或黄酮类生物合成，而floralwhite模块中的基因可能控制核糖体蛋白合成或亚基组装，这些假设需要进一步的功能验证。先前的研究表明，核糖体和光合作用相关模块中的枢纽基因对于Si介导的耐寒性至关重要；例如，Si诱导的核糖体蛋白枢纽基因的上调通过促进应激响应蛋白合成增强了Lolium perenne的耐寒性（Mukarram等人2022）。

4.6 研究局限性和未来展望
本研究通过生理和转录组分析阐明了SiNPs在增强E. nutans cv. QL20-04耐寒性中的调节机制，但仍存在一些局限性。具体来说，研究仅关注了一个对冷敏感的品种，没有比较不同种质资源；仅应用了200 mg/L的SiNPs浓度，因此SiNPs与植物耐寒性之间的剂量效应关系以及高浓度SiNPs的毒性效应尚不清楚；并且没有进行多组学整合分析，SiNPs的转录后和翻译后调节机制仍有待阐明。对于未来的研究，我们将扩大种质资源调查的范围，筛选对SiNPs敏感的品种，设置SiNPs浓度梯度处理以确定最佳应用方案，并采用多组学技术构建基因-蛋白质-代谢物调节网络。

5 结论
总之，本研究表明SiNPs通过调节冷胁迫下的生长、生理和基因表达来增强E. nutans幼苗的耐寒性。我们提出了一个简化模型来阐明SiNPs在耐寒性中的机制（图9）。应用200 mg/L的SiNPs可以减少MDA积累，增加SOD活性，维持叶绿素含量，并调节ABA动态以平衡应激反应和生长，有效减轻冷诱导的细胞损伤。此外，SiNPs在不同冷胁迫条件下对冷适应表现出显著的时间依赖性调节效应。短期冷胁迫激活光合作用相关基因的转录以抵消初始的光抑制，而长期冷胁迫促进核糖体生物合成和氨基酸合成途径。这促进了新的耐寒性蛋白的合成和通过核糖体重塑和氨基酸代谢积累的渗透调节剂。WGCNA分析进一步确定了两个核心共表达模块，它们协同介导SiNPs诱导的耐寒性。总体而言，这项研究揭示了SiNPs通过协调时间依赖的多途径调节网络来增强E. nutans cv. QL的耐寒性。这项研究为E. nutans的耐寒性遗传改良和SiNPs在可持续高山草地农业中的合理应用提供了新的见解和理论基础。图9在图查看器中打开PowerPoint
外源SiNPs调节Elymus nutans幼苗不同耐寒机制的示意图。向上箭头：增强；向下箭头：减弱；蓝色箭头：不变。作者贡献
Yancui Zhao：撰写原始草稿、软件使用、方法论、数据分析、数据管理和概念化。廖浩钦：数据验证、资源获取、研究方法及数据整理。卢环环：数据可视化、验证及软件开发。唐柳班：研究方法与形式化分析。邱永森：研究方法与数据整理。王若飞：论文撰写、审稿与编辑工作。谢文刚：论文撰写、审稿与编辑、资金申请及项目构思。

本研究得到了以下项目的支持：CARS专项基金（CARS-34）、青海省领军科学家项目（2023-NK-147）、草种产业核心技术攻关项目（SJCZFY 2025-0305）以及甘肃省领军科学家项目（23ZDKA013）。

作者声明：不存在任何利益冲突。

数据公开声明：
本研究生成的数据集可在中国国家生物信息中心获取（数据访问编号：PRJCA0054312，网址：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsub/submit/bioproject/list）。