《Journal of Hazardous Materials》：Dynamics and Drivers of Last-Resort Antibiotic Resistance Genes during Pilot-Scale Aerobic Fermentation of Municipal Sludge and Subsequent Bok Choy Pot Trials
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本研究针对污水厂污泥中最后一道防线抗生素耐药基因（LARGs）的动态及土壤-植物转移机制，通过 pilot 规模好氧发酵耦合白菜种植试验，结合 metagenomic 序列分析，揭示了发酵条件（>50℃持续10天）有效降低 LARGs 总量（49.19%降解率），但特定基因（如 KPC-22 和 poxtA）在成熟期反弹，与微生物群落演替及水平基因转移（HGT）相关。土壤应用10-15%发酵污泥可提升白菜产量并促进抗生素降解，LARGs 在土壤不同区域呈现差异分布，主要与 indigenous 细菌（如链霉菌属）相关，对核心传播网络影响较小。
周立涛|何大海|蒋莉|何若雪|马世金|龚光宇|邹晓双|李森|周友飞|胡伟杰
贵州大学资源与环境工程学院，教育部喀斯特地质资源与环境重点实验室，中国贵阳550025
摘要
污水处理厂产生的污泥在施用于土地时，可能会加剧最后手段抗生素抗性基因（LARGs）在环境中的传播。然而，LARGs在有氧污泥发酵过程中以及随后的土壤-植物转移过程中的行为仍不甚明了。本研究专门针对常见的ARGs之外的LARGs，结合小白菜种植进行了中试规模的发酵实验，以解析其动态和分布特征。通过宏基因组测序及相关网络分析，我们确定了环境因素并推断出潜在的宿主。优化后的发酵条件（保持温度超过50°C持续10天）使水分含量降至30%，碳氮比降至24.7，并使发芽率达到85%–90%。发酵促进了微生物演替，增强了金属钝化作用和有机物的腐殖化过程，并减少了抗生素和ARGs的浓度，在嗜热阶段抗生素总降解率达到了49.19%。在中温阶段，由于细胞裂解和移动遗传元件（MGEs）的释放，LARGs的浓度增加了47.6%，随后在嗜热阶段又下降了9.7%，在成熟阶段下降了47.8%。尽管发酵稳定了污泥，但某些特定基因（如KPC-22和poxtA）因水平基因转移和物理化学变化而重新活跃。后续的种植实验表明，10%-15%的污泥施用量能够优化小白菜的生长表现并提高土壤中抗生素的降解效率。在土壤、根际和叶际中，LARGs表现出明显的空间分布差异。网络分析进一步表明，LARGs主要与本土土壤微生物（如链霉菌属）相关，而非潜在病原体（如克雷伯菌属）。因此，适当处理的污泥对生态系统的影响较小，表明在研究条件下其安全利用是可行的。
引言
抗生素的持续滥用加速了耐药细菌（ARBs）和抗生素抗性基因（ARGs）的出现和传播，加剧了全球抗菌素耐药性（AMR）危机[1]。除了垂直遗传外，ARGs的传播主要通过移动遗传元件（MGEs）（包括质粒、转座子和整合子）进行水平基因转移（HGT）[2]。常规的抗生素抗性基因（CARGs），如四环素类、磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类，在各种环境介质中普遍存在。更令人担忧的是，越来越多地检测到最后手段抗生素抗性基因（LARGs），这些基因能够对抗其他抗生素失效时的药物产生抗性，包括多粘菌素类、碳青霉烯类、糖肽类（如万古霉素）和四环素衍生物[3],[4]。例如，质粒介导的MCR-1基因已被证明可使肠杆菌科细菌获得多粘菌素抗性[5]。随后，质粒编码的tet(X3)和(tet(X4)酶被报道能够使大肠杆菌产生高水平的美罗培南抗性[6]。这类LARGs的普遍存在对公共卫生构成了严重威胁，因此需要对其环境分布和传播进行重点研究[7]。
污水处理厂既是ARGs的重要来源，也是其汇。目前的处理工艺在去除抗生素方面能力有限，同时不断接收来自医院、制药行业和畜牧业的高抗生素含量废水[8]。污泥通过吸附有机物和胶体富集了疏水性和带电性的抗生素，从而在长时间停留期间促进了ARGs的增殖和HGT[9]。有氧发酵被广泛用于污泥稳定化，并能在不同程度上减少ARGs的浓度。一些研究显示有氧发酵过程中ARGs减少了约20%[10]，而另一些研究则观察到ARGs的数量和多样性增加[11]。这些变化可能与微生物演替有关，尤其是在后期阶段放线菌的数量增加[11]。这种矛盾的结果可能受到多种因素的影响，包括初始的ARGs负荷、微生物群落变化、残留抗生素的压力以及MGEs介导的HGT[12]。然而，大多数现有研究关注的是总ARGs，而LARGs在有氧污泥发酵过程中的阶段依赖性行为和反弹潜力尚未得到充分研究，尤其是在中试规模上[13]。
污泥施用于土地可以增加土壤养分和微生物活性，但也存在ARGs和ARBs积累和传播的风险。根据施用频率和剂量，改良土壤中的ARGs水平可能增加、保持稳定或增加[14],[15]。在停止外源输入后，土壤中的内源性ARGs可能通过减少转移载体活性、微生物群落演替和环境动态逐渐减少[16]，但长期改良的农田即使在多年休耕后仍可能保留高于自然背景水平的ARGs[17],[18]。土壤中的ARGs可以通过与植物相关的微生物群（涉及根际、叶际和内生组织）传递给作物[19],[20]。根系分泌物有助于ARGs在根际的积累和内生菌的吸收，随后这些基因通过木质部或细胞间隙转移到地上组织。同时，叶际微生物可以从土壤、气溶胶或灌溉水中获取ARGs，并在叶际微生物群中交换这些基因。
外源LARGs从土壤迁移到作物的过程受到植物种类、抗生素类型和微生物群落结构的影响。然而，关于LARGs在有氧污泥发酵过程中的阶段依赖性行为及其在土壤-植物系统中的分布特征，以及它们与本土微生物群与潜在病原体之间的关联，目前仍缺乏足够的证据[7],[21]。迄今为止，大多数关于LARGs的研究集中在临床和水产养殖环境中[3],[22],[23]，关于污泥有氧发酵及其后续土地应用中的污染水平和遗传特征的系统数据较少。因此，我们进行了中试规模的发酵实验和小白菜（Brassica chinensis L.）种植试验，包括：(1)宏基因组测序以表征微生物群落并量化ARGs浓度；(2)相关分析以确定关键的环境影响因素；(3)网络分析以推断关键LARGs的潜在宿主。研究目的包括：(1)探讨有氧发酵过程中抗性基因的动态变化及其与物理化学因素和外部选择压力的关系；(2)阐明发酵产物施用于土地后LARGs在土壤-小白菜系统中的分布特征和潜在宿主差异；(3)评估适量污泥施用对植物生长、抗性基因传播和叶际毒性的整体影响。
部分内容摘要
中试规模污泥发酵试验
污泥样本取自贵州省遵义市道真自治县第二污水处理厂的脱水污泥。其含水量为70%–85%，有机质含量为20%–30%，总氮含量为20%–40%。作为有氧发酵辅助材料的蘑菇基质包括玉米芯、木屑、小麦麸皮和棉籽壳。这些材料经过预处理去除杂质后，被机械粉碎至一定粒度。
有氧发酵产物和抗生素去除特性
根据温度变化，发酵过程分为三个阶段：0–4天（中温阶段SⅠ，29.1–53.5°C），5–16天（嗜热阶段SⅡ，53.5–67.9°C，随后降至50.7°C），以及17–26天（冷却和成熟阶段SⅢ，50.7–31.3°C），如图1a所示。温度波动导致pH值先升高，然后降低，最终稳定（图1b）。在SⅠ阶段，中温细菌分解了易于降解的有机质。
结论
本研究探讨了城市污水污泥在中试规模有氧发酵过程中LARGs的演变及其驱动因素。控制下的发酵有效稳定了污泥基质并降低了整体抗生素负荷。然而，在成熟阶段某些LARGs重新活跃。统计分析表明，这种现象与特定宿主细菌的再生和质粒介导的水平基因转移有关，而非其他因素。
环境影响
研究表明，城市污泥的有氧发酵为抑制LARGs在环境中的传播提供了可行的方法。保持温度超过50°C持续10天可以优化污泥性质，增强金属钝化作用、有机物的腐殖化过程和抗生素降解，确保发酵产品的安全性。将10–15%的发酵污泥施用于小白菜可以改善作物生长并提高土壤中抗生素的降解效率。特定微生物网络的分析显示
作者贡献声明
胡伟杰：验证、监督。周友飞：验证、监督。周立涛：撰写——初稿、可视化、数据分析、数据管理。何大海：撰写——审稿与编辑、软件使用、方法论设计、概念构建。何若雪：撰写——审稿与编辑、软件使用、数据分析。蒋莉：撰写——审稿与编辑、资源协调、项目管理、资金申请。龚光宇：可视化、数据分析。马世金：验证、监督。李森：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：5257101788）的支持。
