Effect-directed analysis with high-throughput fractionation and a 4-tiered bioassay battery for identification of toxic drivers in WWTP effluent

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Effect-directed analysis with high-throughput fractionation and a 4-tiered bioassay battery for identification of toxic drivers in WWTP effluent

　　

本研究开发、验证并应用了一种采用4层级生物测定组合的高通量效应导向分析（EDA）方法，用于评估污水处理厂（WWTP）出水及受纳河水。该EDA方法利用具有雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）、芳烃受体（AhR）或Nrf2活性的化合物，通过加标超纯水、河水、WWTP出水和进水样品进行了验证。在能力验证期间，确认该WWTP出水中含有炔雌醇（EE2）（0.010 ppb）、双酚A（BPA）（0.150 ppb）和尼莫地平（0.002 ppb），进水中含有BPA（0.152 ppb）和雄烯二酮（0.090 ppb）。当应用于另一WWTP出水时，全提取物生物测定检测到ER、AhR和Nrf2活性，但未检测到AR活性。分级揭示了ER活性组分，预测存在四种潜在的ER结合化合物，但它们不太可能完全解释检测到的活性。这潜在表明存在低浓度的另一种ER激动剂（0.00038 ppb < x < 0.006 ppb E2当量）。对天然废水样品的疑似筛查鉴定出38种置信度水平2的化合物和277种置信度水平3.1的化合物。在ER活性组分中鉴定的置信度水平2的化合物中，发现了四种药物（贝佐纳酯、异丙嗪N-氧化物、索尔卡诺和霍喹齐尔）。在121种置信度水平2和3.1的鉴定化合物中，82%在WWTP进水中持续存在，而60%在下游河水中发现，仅1种化合物在上游被检测到，表明出水排放影响了微污染物的分布。本文强调了利用多种生物分析终点建立和改进水环境及人类暴露相关EDA方法的重要性。

### 论文解读：基于高通量分级与四层级生物测定组合的污水处理厂出水毒性驱动因子识别

本研究由瑞典农业科学大学的研究团队完成，发表于《Journal of Hazardous Materials Advances》。论文针对污水处理厂（WWTP）出水及其对受纳水体造成的微污染风险，开发并验证了一种结合高通量分级与四层级生物测定组合的效应导向分析（EDA）方法，旨在识别环境水体中的关键毒性驱动因子。

研究背景与现状

随着人为化学品使用的增加，水环境中新兴污染物（CECs）的数量显著上升，对水生生态系统和人类健康构成威胁。污水处理厂作为这些污染物进入环境的主要途径，其常规处理工艺主要针对营养盐和病原体，而非有机微污染物。尽管高级处理技术（如活性炭、臭氧化）存在，但许多微污染物（如全氟烷基物质PFAS）仍难以有效去除。传统的靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析仅能检测已知化合物，无法识别未知毒物。因此，结合生物分析与化学分析的非靶向效应导向分析（EDA）成为优先筛选有毒物质的必要策略。

关键技术方法

研究人员建立了一种新颖的高通量EDA方法。首先，从瑞典某河流及WWTP采集水样，经固相萃取（SPE）浓缩后，利用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）进行分析。样品经自动馏分收集器（FractioMate?）分为54个馏分，随后通过四种受体介导的生物测定进行评估，包括雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）、芳烃受体（AhR）和Nrf2通路活性。此外，利用Compound Discoverer软件对HRMS数据进行疑似物筛查，并结合CompTox Chemicals Dashboard进行ER结合能力的计算机预测。

研究结果

3.1. EDA方法的开发与能力验证

研究人员通过加标实验评估了方法的性能。结果显示，ER激动剂（E2、EE2、BPA）在各类基质中回收率良好，相对回收率均大于50%。相比之下，AhR和Nrf2的参考化合物表现出较低的回收率，这归因于其结构多样性导致的分析难度。通过比较发现，ER和AR生物测定的灵敏度高于LC-HRMS方法，而Nrf2生物测定则相反。此外，通过保留时间匹配确认了化学参考化合物在馏分中的分布情况。

3.2. 实际样品分析

3.2.1. WWTP出水的疑似筛查

对实际WWTP出水提取物的分析共鉴定出38种置信度水平2的化合物。其中包括多种肽类、糖衍生物和表面活性剂，如聚甘油基-4油酸酯（polyglyceryl-4 oleate）和肉豆蔻硫酸盐。值得注意的是，还识别出四种药物成分：贝佐纳酯（benzonatate）、异丙嗪N-氧化物（promethazine N-oxide）、索尔卡诺（solpecainol）和霍喹齐尔（hoquizil）。

3.2.2. WWTP处理效率及河流影响评估

通过对121种高置信度化合物（水平2和3.1）的分布分析发现，82%的化合物在WWTP进水中存在，60%在出水排放点的下游河水中检出，而上游仅检出1种。这表明WWTP出水显著改变了受纳河流的微污染物谱，且这些化合物能够长距离传输至饮用水源水库。

3.2.3. WWTP出水中毒性驱动因子的识别

生物分析显示，全提取物表现出ER、AhR和Nrf2活性，但无AR活性。经馏分分级后，仅在ER活性馏分（保留时间RT 10.10-11.50）中检测到活性。在该活性窗口内鉴定的化合物中，化合物16（3-苄基-7-甲基辛酸）、27（N,N'-[1,2-二(4-吡啶基)-1,2-乙二基]双(4-甲氧基苯甲酰胺)）和35（ascr#3）被计算机模型预测具有潜在的ER结合能力，但其结合亲和力远低于炔雌醇（EE2）和双酚A（BPA）。由于LC-HRMS未能检测到典型的ER激动剂（如E2或EE2），研究人员推测出水存在极低浓度（0.00038 ppb < x < 0.006 ppb E2当量）的其他ER激动剂，其结构可能与E2/EE2相似，但因浓度过低超出了化学分析的检出限。

结论与讨论

本研究成功开发并验证了一种用于水环境样品的高通量EDA方法。研究发现，尽管AhR和Nrf2在全提取物中呈阳性，但在馏分中失活，这可能是由于化合物在馏分过程中分散或损失所致。ER活性的鉴定表明，当前的化学分析方法在灵敏度上仍存在与生物分析之间的差距。研究证实，WWTP出水是河流中微污染物的主要来源，尤其是药物类污染物，对下游饮用水源构成潜在风险。未来的研究应致力于提高HPLC-HRMS的检测灵敏度，并结合计算机模拟保留时间预测等手段优化特征过滤，以实现更全面的有毒物质识别。