通过“锁定”策略对FAST-PETase进行合理重构，以实现高效的PET解聚

《Journal of Hazardous Materials》：Rational redesign of FAST-PETase via a “locking” strategy for efficient PET depolymerization

高效PET降解酶的理性设计及“锁定”策略研究。通过引入二硫键稳定FAST-PETase柔性区域，显著提升其降解效率（1.9倍）和热稳定性（熔点升高4.1℃），实现3天内完全降解未处理消费级PET薄膜。

　　

作者：朱志 | 天宗阳 | 郭泽辉 | 孙燕

单位：合成生物学国家重点实验室、合成生物学与生物制造学院、合成生物学前沿科学中心（教育部），以及天津大学系统生物工程重点实验室（教育部），中国天津 300350

摘要

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料废物的大量积累对全球环境造成了严重污染，开发高效的PET水解酶对于其酶促降解和生物回收至关重要。本文提出了一种“锁定”策略，用于合理重新设计迄今为止表现最佳的PET酶之一FAST-PETase，以进一步提升其性能。最佳变体FAST-PETase^DC（A171C/S193C）在50°C下的降解效率比FAST-PETase提高了1.9倍，熔点（T_m）升高了4.1°C。在50°C下，通过定期补充酶，FAST-PETase^DC可以在3天内几乎完全降解未经处理的消费后PET薄膜，速度是FAST-PETase的两倍。分子动力学模拟显示，该突变通过稳定的二硫键将Helix 5和Loop 10固定在一起，降低了突变位点及其连接区域的灵活性。这些结构变化促进了底物与酶的结合，增强了催化三联体的相互作用，并使酶的整体结构更加刚性，从而提高了降解效率和热稳定性。本研究强调了“锁定”策略在酶重新设计中的有效性，而工程化的FAST-PETase变体是处理和回收低至中等结晶度PET塑料废物的有前景的水解酶。

引言

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是日常生活中最重要的合成聚合物之一，占全球塑料产量的18%[1]、[2]。PET通常是通过将对苯二甲酸二甲酯（DMT）与乙二醇（EG）的酯交换反应或对苯二甲酸（TPA）与EG的缩聚反应制造的[3]。DMT中的芳香结构不仅降低了聚合物链的灵活性，还显著降低了酯键的亲水性[3]，从而阻碍了PET在自然环境中的降解。因此，大量PET塑料废物在陆地上堆积并最终进入海洋，对全球环境构成了严重威胁[4]、[5]、[6]。为解决这一问题，人们开发了多种PET的处理和回收策略，如填埋、焚烧、机械回收、化学回收和生物降解[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。其中，生物降解是一种在温和条件下可将PET塑料废物降解为TPA和EG的酶促反应过程[3]。此外，生物降解具有无二次污染、经济可行和可持续性等优点[3]、[14]。这些因素使得生物降解成为处理和回收PET塑料废物的优选方法。

迄今为止，已经发现了多种能够降解PET的酶，例如脂肪酶、酯酶、羧酸酯酶、角质酶和特异性PET水解酶（PETase），并研究了它们的生物化学和结构特性[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。然而，大多数酶在降解PET方面的性能较差，尤其是在室温下对于高结晶度PET塑料而言，这可能是由于它们对PET底物的特异性较低[22]、[23]。2016年，从Ideonella sakaiensis中分离出的PET特异性水解酶IsPETase被报道能够在常温下将PET降解为TPA和EG。IsPETase对PET薄膜的降解活性分别比叶枝腐生角质酶（LCC）、Fusarium solani角质酶（FsC）和Thermobifida fusca角质酶（TfH）高5.5倍、88倍和120倍[24]。此外，IsPETase对高结晶度PET塑料的降解性能优于其他酶[24]。这些特性凸显了IsPETase在处理和回收PET塑料废物方面的潜力，因为大多数PET废物都暴露在常温环境中。然而，IsPETase的活性和稳定性相对较低[7]、[25]，这限制了其在大规模处理和回收PET废物中的应用。

近年来，许多研究人员采用了多种方法来提高IsPETase的降解性能和热稳定性，包括理性设计、半理性设计、定向进化、机器学习、化学修饰和PET预处理等[7]、[8]、[12]、[22]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。例如，通过基于结构的理性设计策略改造的ThermoPETase在40°C下的降解活性比IsPETase提高了14倍[7]。DuraPETase、HotPETase和DepoPETase分别通过GRAPE策略[31]、基于UPLC（超高效液相色谱）的定向进化[8]和基于荧光的定向进化[32]获得。这三种变体的热稳定性（23.3°C – 34.5°C）均显著高于IsPETase[8]、[31]、[32]，从而在高温下表现出更好的酶促降解性能。值得注意的是，功能性强、活性高、稳定性好且耐热的PET酶变体FAST-PETase是一种嗜中温酶，它是利用ThermoPETase作为骨架通过机器学习算法设计的[30]、[33]。其熔点（T_m）比ThermoPETase高8.5°C，并且能够在50°C下在一周内几乎完全将51种不同的消费后PET塑料降解为TPA和EG[30]。这些显著进展表明，蛋白质工程是提高IsPETase及其变体酶学特性的有效方法，IsPETase变体可以作为设计更高效率、更稳定和更耐热的PET水解酶的起点。

据报道，酶的热稳定性取决于蛋白质某些区域的灵活性[33]、[34]、[35]。结构中柔性区域的高热波动可能导致酶在高温下展开和失活。根据最适温度，酶可以分为嗜冷型（< 25°C）、嗜中温型（≥ 25°C且≤ 50°C）和嗜热型（≥ 60°C且≤ 110°C）[33]、[36]、[37]。结构分析显示，嗜冷型酶比嗜中温型酶更灵活，而嗜中温型酶又比嗜热型酶更灵活[33]、[38]。因此，增加酶结构中柔性区域的刚性是提高其热稳定性的有效策略之一。最近，用于增强柔性区域刚性的主要方法包括迭代饱和突变、共识突变和虚拟饱和突变[38]。然而，这些方法主要依赖于广泛的筛选来识别具有增强结构刚性和稳定性的变体。据我们所知，尚未探索通过理性设计次级结构之间的相互作用来增强柔性区域的刚性。

因此，我们在此提出了一种合理的“锁定”策略，以增强FAST-PETase的柔性区域并提高其PET降解性能。确定了理性设计变体的降解活性、热稳定性和耐久性，并成功获得了性能更优的变体FAST-PETase^DC。然后，利用圆二色性（CD）、荧光光谱和分子动力学（MD）模拟揭示了FAST-PETase^DC比FAST-PETase具有更高降解效率的分子机制。此外，使用FAST-PETase^DC作为生物催化剂，我们能够在3天内几乎完全降解未经处理的消费后PET塑料。

材料

双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（BHET）和对苯二甲酸（TPA）购自Aladdin（中国上海）。单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（MHET）购自Molbase（中国上海）。PET塑料薄膜（透明，厚度0.25mm，结晶度28.34%）购自Goodfellow（英国剑桥）。两种用于水果包装的消费后PET塑料（结晶度分别为12.31%和16.42%）购自Xihui Store（中国天津）。

基于“锁定”策略的突变设计

多项研究表明，酶的高柔性区域对其功能至关重要[33]、[55]。然而，酶的热失活通常由酶表面的柔性区域引发。在高温下，柔性区域变得不稳定，导致酶展开和催化活性丧失[55]、[56]。对嗜热型、嗜中温型和嗜冷型酶的分析表明，嗜热型酶的结构刚性

结论

我们通过结合分子动力学模拟（MD）、BRIDGED方法和结构预测，开发了一种高效的“锁定-柔性-次级结构”策略，以增强FAST-PETase的降解性能。在引入二硫键的五个变体中，FAST-PETase^DC在50°C和60°C下的降解活性分别比FAST-PETase高1.4倍和1.5倍。此外，FAST-PETase^DC对PET薄膜的降解效率提高了1.9倍

环境影响

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最广泛使用的塑料之一，其废物的大量积累对全球环境造成了严重污染。因此，开发高效的PET水解酶对于其生物降解和回收至关重要。

本研究提出了一种“锁定”策略，用于合理重新设计迄今为止表现最佳的PET酶之一FAST-PETase的柔性区域，以提升其PET降解性能。最佳变体的降解效率提高了1.9倍

CRediT作者贡献声明

朱志：撰写原始稿件、验证、软件开发、实验研究、数据分析、数据管理。天宗阳：验证、方法学设计、实验研究。郭泽辉：验证、数据管理。孙燕：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调、方法学设计、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22578323）的支持。