《Journal of Hazardous Materials》：Concurrent biodegradation of tylosin and tilmicosin by a novel
Paracoccus versutus 4-B-2
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发现新型菌株Paracoccus versutus 4-B-2可同时高效降解tylosin和tilmicosin，144小时内完成共降解，其关键酶Est-4151为新型MBL fold金属水解酶，具有广谱环境适应性及高降解效率。
陈正彦|刘安琪|崔俊哲|刘春辉|李慧娟|权子怡|刘雅旭|郭晓|王晓宇|范丽玲|王博
山东科技大学化学与生物工程学院生物工程系，中国青岛266590
摘要
大环内酯类抗生素泰乐菌素（TYL）和替米考星（TLM）的共污染对环境构成了持续性的威胁，加剧了抗菌素耐药性的传播。由于缺乏能够同时降解这两种化合物的微生物，有效的生物修复工作受到了阻碍。本文报道了一种新型细菌菌株Paracoccus versutus 4-B-2的发现，该菌株能够在144小时内完全降解TYL和TLM，TLM的一级降解半衰期分别为1.28天，TYL为1.47天，这一效果比之前报道的菌株提高了1.6倍。途径分析表明，降解过程的第一步和限速步骤是大环内酯内酯键的水解，这一反应由一种新型的胞外MBL折叠金属水解酶Est-4151催化。该酶在40°C和pH 8.0条件下活性最佳，在广泛的pH范围（6.0–10.0）内仍保持超过50%的活性，并且被EDTA和PMSF强烈抑制，表明它是一种丝氨酸依赖性的金属酶。结构建模显示，存在一个保守的H96-D98-H163基序，该基序与MBL折叠水解酶中的催化锌离子结合。这种酶可将降解产物的抗菌活性降低20%以上。转录组分析证实了gene4151（编码Est-4151）的基底诱导表达，以及氧化还原酶、脱糖酶和水解酶的上调。该菌株具有很强的环境适用性，能够耐受高浓度的抗生素（500 mg/L）和较高的硫酸盐水平（6% Na?SO?）。此外，在添加了色氨酸的污水中，其降解效率最高可达21.43%，生物量（OD???）达到2.1。我们的研究鉴定出了一种独特的双重降解生物催化剂，并提供了一种基于内酯环裂解的酶促策略，以减轻受污染废水中的抗生素持久性和耐药性选择问题。
引言
抗菌剂在现代医学和农业中至关重要，其中兽医用抗生素的使用量远超过人类消费量。预计到2030年，全球兽医用抗生素的使用量将从2017年的93,309吨增加到104,079吨[1]，其中大环内酯类抗生素是一大类。大环内酯类抗生素（如红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素（TYL）、替米考星（TLM）含有14到16个成员的大环内酯环，通过结合50S核糖体亚单位的新生肽出口通道来抑制细菌蛋白质合成[2]、[3]。替米考星（TLM）是由Streptomyces fradiae产生的半合成衍生物，广泛用于牲畜的呼吸道感染治疗[4]。由于结构相似性和在集约化养殖中的共同应用——尤其是在呼吸道疾病管理方面——TLM和TYL经常共同存在于农业废弃物中，包括牲畜废水、粪便和受污染的环境中[5]。这种共污染是系统性的，由共同的来源和使用模式驱动。此外，TYL可能在环境中部分转化为类似TLM的中间体，进一步复杂化了污染状况。TLM生产过程中的废水通常同时含有TLM和未反应的TYL，给修复工作带来了挑战。因此，这两种物质的共存对抗菌素耐药性（AMR）的选择产生了持续的选择压力，迫切需要有效的协同修复策略。
能够同时降解TLM和TYL的微生物菌株的发现解决了一个关键的环境问题。鉴于它们的结构相似性和共同存在，仅针对一种化合物的修复策略是不足的，因为残留的抗生素会继续促进耐药性的选择。一种能够同时降解这两种化合物的生物体提供了一个变革性的解决方案，通过同步消除这两种污染物，从而降低耐药性病原体的富集风险，并更好地反映现实世界的污染情况。除了直接的生物修复应用外，这种菌株可能还具有新颖的、广谱的酶学特性——可能涉及协同作用途径——值得进行机制探索。因此，这种生物催化剂不仅代表了渐进式的改进，也是全面管理大环内酯类污染的必要进步。
大环内酯类抗生素（MALs）是新兴的环境污染物，通过制药废水、医疗设施、不当的废水处理和集约化畜牧业进入生态系统[6]、[7]。从施用到在环境中的积累，它们的持久性带来了双重威胁：直接的生态毒性以及通过富集耐药细菌和水平基因转移间接促进抗菌素耐药性（AMR）[8]、[9]。值得注意的是，MALs通过产生活性氧物种引起剂量依赖性的氧化应激。在斑马鱼中，TLM暴露（≥1.0 μg/mL）会导致心律失常、畸形和细胞凋亡[10]。在Chlorella PY-ZU1中，TLM浓度≥5 mg/L时观察到植物毒性效应，包括超微结构损伤和丙二醛水平升高[11]。长期暴露于TLM（43.6 μg/mL，7天）可以在Enterococcus faecalis中选择出大环内酯耐药性（ermB）和毒力（gelE）基因[12]。TLM的半合成结构进一步阻碍了其生物降解，相比TYL更为复杂[13]，这突显了需要先进的修复策略。
生物降解为减轻抗生素污染提供了一种可持续的方法[8]、[14]。虽然某些微生物可以降解TYL（例如Citrobacter amalonaticus [15]、Burkholderia vietnamiensis [16]、Klebsiella pneumoniae [17]、Klebsiella oxytoca [18]、Providencia stuartii [19]，以及一些藻类可以通过生物吸收部分去除TLM[11]，但目前尚无已知菌群能够同时降解这两种化合物。营养补充可以增强TLM的降解（例如Glutamicibacter nicotianae AT6通过内酯裂解和脱糖作用[4]）；然而，TYL和TLM的有效协同降解仍是一个未解决的问题。
我们分离出了Paracoccus versutus 4-B-2，该菌株通过一种新型的胞外酯酶同时代谢TYL和TLM。考虑到转化产物的潜在毒性，我们使用纸片扩散试验评估了残留的抗菌活性[20]。高分辨率质谱分析鉴定出了十一种新的生物转化产物，有助于阐明降解途径。转录组分析揭示了降解机制，即由MBL折叠金属水解酶切割关键的大环内酯键[21]，这与已知的Ere-或Est型酯酶不同[14]、[21]、[22]、[23]。这一发现填补了环境微生物学中的一个关键空白：细菌对复杂抗生素混合物的适应性。
TYL和TLM降解菌株的富集、分离与鉴定
Paracoccus versutus 4-B-2菌株是根据Li等人的方法[4]，从中国山东省济南某制药废水处理设施收集的活性污泥中富集、筛选并分离得到的。通过16S rRNA基因测序（NCBI登录号：OR668775）和系统发育分析确认了菌株身份。生理特性测试包括过氧化氢酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脲酶、脂肪酶、明胶液化试验。
菌株特性与降解效率
Paracoccus versutus 4-B-2从活性污泥中分离出来，表现出对TYL和TLM的卓越降解能力（表S1）。菌落呈白色、圆形且不透明（图S1A）；细胞为无鞭毛的杆状（图S1B）。生理测试显示过氧化氢酶、纤维素酶和蛋白酶活性阳性，而淀粉酶、脲酶、脂肪酶、明胶液化试验及甲基红/Voges-Proskauer试验呈阴性。最佳生长条件为LB培养基（pH 4.0–8.0；Na?SO? ≤12% w/v）。
结论
Paracoccus versutus 4-B-2的发现解决了环境生物修复中的一个长期难题：能够同时降解结构不同的大环内酯类抗生素TYL和TLM。这种胞外酶促策略能够处理高浓度的抗生素（500 mg/L），并且具有耐盐性（≤12% Na?SO?），适合直接应用于含硫酸盐的废水中，规避了细胞吸收的限制。该菌株能够降解稀释后的抗生素
环境影响
泰乐菌素和替米考星在牲畜和制药废水中的共存加剧了抗菌素耐药性（AMR）的风险。本研究鉴定了Paracoccus versutus 4-B-2，该菌株通过一种新型的胞外酯酶Est-4151同时降解这两种抗生素，通过水解生物活性内酯环。这一过程显著降低了抗菌活性（>20%），并且在高硫酸盐和抗生素浓度下仍能有效发挥作用。这提供了一种实用的酶促方法
CRediT作者贡献声明
王博和李慧娟构思并监督了整个项目。陈正彦和李慧娟设计了实验。范丽玲、陈正彦、刘安琪和刘雅旭负责菌株分离、降解实验和生理特性分析。陈正彦、权子怡和刘春辉进行了代谢物提取、UPLC-MS分析和降解途径的阐明。崔俊哲、郭晓和王晓宇进行了酶的定位和亚细胞分级实验。
CRediT作者贡献声明
权子怡：资源调查。
刘雅旭：撰写——初稿。
郭晓：验证。
王博：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。
陈正彦：方法学研究。
王晓宇：数据管理。
范丽玲：调查。
刘春辉：正式分析、数据管理。
李慧娟：资金获取、概念构思。
刘安琪：数据管理。
崔俊哲：正式分析。
利益冲突声明
我们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2024QB243, ZR2024QB246, ZR2023MB138）、国家自然科学基金（21868011）、国家重点研发计划（2017YFC1103800）以及山东科技大学人才青年计划的资助。我们感谢山东科技大学分析中心提供的仪器支持。
