微寄生虫Perkinsus olseni对马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）生物扰动活动及其工程潜力的影响

《Journal of Invertebrate Pathology》：Effect of the microparasite Perkinsus olseni on the bioturbation activity and engineering potential of the Manila clam Ruditapes philippinarum

　　赫利亚兹·勒贝永（Héliaz Le Bayon）、埃莉莎·沙耶尔（Elisa Chailler）、莎拉·比罗（Sarah Bureau）、杰罗姆·库德雷（Jér?me Coudret）、卡罗琳·布罗丹（Caroline Broudin）、塞琳·乌班（Céline Houbin）、阿丽西亚·罗梅罗-拉米雷斯（Alicia Romero-Ramirez）、奥雷莉·尚布韦（Aurélie Chambouvet）、安娜贝尔·戴兰（Annabelle Dairain）
索邦大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、UMR7144 AD2M、ECOMAP – EDYMAR、罗斯科夫生物站（Station Biologique de Roscoff，29680 Roscoff，法国）

**摘要**
寄生虫引起的宿主行为改变可能产生深远的生态后果，尤其是当这些改变影响到生物扰动者（如生态系统工程师）时。虽然宏观寄生虫对宿主行为以及生态系统功能的影响已在海洋领域得到充分研究，但微观寄生虫的作用仍待探索。广泛存在的微真核寄生虫Perkinsus olseni与马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）之间的关联为研究这一被忽视的方面提供了一个有趣的模型。研究表明，P. olseni感染会改变蛤类的多种生理参数，如免疫反应、代谢活动和繁殖性能。然而，这些内部变化是否会导致行为改变（例如蛤类对沉积物颗粒搬运方式的改变）仍是一个未解之谜。在本研究中，我们探讨了P. olseni感染是否会影响马尼拉蛤的生物扰动活动，这一过程对沿海环境中的生态系统过程（如养分流动）具有重要意义。我们未发现非致命剂量的P. olseni感染会显著改变马尼拉蛤的工程能力，但观察到其沉积物搬运活动的强度略有增加，这可能反映了行为上的适应。鉴于马尼拉蛤作为底栖过程驱动者的生态作用，即使是微小的寄生虫诱导的行为变化也可能连锁影响沉积物动态和底栖群落结构等生态系统过程。探索此类相互作用为了解微观寄生虫如何通过生理干扰以及宿主功能特征的变化来影响生态系统功能提供了新的视角。

**1. 引言**
寄生现象是一种普遍存在的生物相互作用，几乎影响所有陆地和水生生态系统（Poulin, 2007; Lafferty et al., 2008）。长期以来，人们主要关注寄生虫的病理和生理后果，但它们也能诱导宿主行为显著改变（Poulin, 2010）。这些改变范围从觅食和运动活动的变化到繁殖和社会行为的改变（Thomas et al., 2005; Hughes et al., 2012）。在某些系统中，这些变化可能有利于寄生虫的传播或生存（所谓的适应性操纵，Lafferty & Shaw, 2013），而在其他系统中则反映了生理或免疫压力的间接结果（Adamo & Robinson, 2012）。寄生虫诱导的行为改变可能连锁影响生态过程，包括食物网动态、宿主种群结构甚至群落组成（Marcogliese, 2005; Hatcher et al., 2012）。在软底沿海环境中，底栖无脊椎动物（如生物扰动者）的行为变化可能影响沉积物地貌和动态、生物地球化学以及底栖-浮游耦合（Dairain et al., 2019）。例如，感染了大型寄生虫Bucephalus minimus的Cerastoderma edule蛤的体质指数低于未感染个体。由于B. minimus损害了宿主的生理状态，从而降低了其侵蚀能力，进而影响了蛤类在沉积物动态中的作用（Dairain et al., 2020）。越来越多的研究强调了寄生虫通过间接影响底栖生物在沿海软底环境中的作用（Mouritsen and Poulin, 2005; Pascal et al., 2020; Dairain et al., 2019）。然而，大多数研究集中在宏观寄生虫上，而微观寄生虫（如原生动物）对宿主行为和工程能力的影响仍需进一步研究。

马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）于20世纪70年代从印度-太平洋地区引入欧洲，用于支持水产养殖（Flassch & Leborgne, 1994）。这种双壳类动物迅速在当地自然化，成为欧洲潮间带最常见的物种之一（de Montaudouin et al., 2016）。马尼拉蛤在法国的商业价值很高，年产量约为2000至3000吨（Caill-Milly et al., 2025）。由于其生长速度快、繁殖力强且更能耐受环境压力，它的快速扩张导致了本地双壳类动物种群的减少（Cordero et al., 2017; Crespo et al., 2021）。除了与本地物种的生态竞争外，马尼拉蛤还作为重要的生态系统工程师（Sgro et al., 2005），通过物理改造栖息地来影响环境条件和其他生物的资源可用性（Jones et al., 1997）。作为穴居双壳类动物，马尼拉蛤会主动搬运沉积物颗粒（即沉积物重塑），从而影响沉积物稳定性、有机物循环以及底栖群落结构和动态（Sgro et al., 2005; Mermillod-Blondin and Rosenberg, 2006; de Moura Queirós et al., 2011）。常见的寄生虫（如吸虫）会感染马尼拉蛤，并削弱其搬运沉积物的能力（Thomas and Poulin, 1998; Dang et al., 2010, 2010, Nam et al., 2018）。然而，马尼拉蛤也寄生着多种微观寄生虫，包括原生动物Perkinsus olseni（Bathige et al., 2025）。这种微真核寄生虫会引起Perkinsosis病，导致Veneridae科物种（如R. decussatus、R. philippinarum或Venerupis pullastra）的死亡事件（Pretto et al., 2014; Azevedo, 1989; Sagristá et al., 1995; Villalba et al., 2005），造成重大经济损失（Villalba et al., 2004）。世界动物卫生组织（W.O.A.H., 2021）已将P. olseni列为需报告的病原体。该寄生虫通过过滤直接在宿主间传播，无需中间宿主（Ito?z et al., 2022）。在严重感染的情况下，蛤类可能出现外部皮肤结节（组织炎症）和较低的适应性，从而在环境压力下增加死亡率（Dittman et al., 2001; Choi and Park, 2010）。寄生虫不会系统性地杀死宿主。非致命感染通常伴随着一系列更微妙的影响，包括宿主生理的全面改变（Casas et al., 2002; Pretto et al., 2014; Waki et al., 2018）。迄今为止，只有两项研究关注了P. olseni对Veneridae行为的影响（Sim?o et al., 2010; Waki et al., 2018），但其对沉积物搬运和养分流动等生态过程的重要性仍需评估。

在本研究中，我们结合行为学和寄生虫学分析，评估了P. olseni感染对马尼拉蛤行为和工程能力的影响。我们重点关注了双壳类的沉积物重塑活动，并测量了沉积物-水界面的生物地球化学交换，以此作为养分循环的代理指标。这些发现有助于阐明寄生虫感染如何影响马尼拉蛤的生态系统工程功能，为了解非致命微观寄生虫感染在沿海软底环境中的生态后果提供了新的见解。

**2. 材料与方法**
我们采用离体实验方法，研究了实验感染和未感染P. olseni的马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）对沉积物颗粒搬运和沉积物-水界面养分流动的影响。实验设置了三种处理组：（1）“对照组”，即无蛤类；（2）“未感染组”，即未实验感染P. olseni的蛤类；（3）“感染组”，即实验感染P. olseni的蛤类。

**2.1. 马尼拉蛤和沉积物的采集**
我们在法国布列塔尼地区的莫莱湾（48°40′36.2″N 3°55′33.8″W）手工采集了约200只大小相似（35.9 ± 3.3 mm，平均值±标准差）的成年马尼拉蛤。采集后，蛤类被迅速运送到实验室，并在含有沉积物的小水箱中饲养，同时提供富含氧气的天然未过滤海水。同期还采集了泥沙沉积物（见补充图1）。

**2.2. 马尼拉蛤的P. olseni自然感染情况**
我们从采集的蛤类中随机选取50只，使用Ray的流体硫糖醇培养基（RFTM）方法和分子技术（Casas et al., 2002b）检测其自然感染强度。虽然RFTM方法是检测Perkinsosis和量化感染强度的标准方法（W.O.A.H., 2021），但该方法缺乏病原体物种特异性，因此需要分子分析来确认物种身份（Ito?z et al., 2021）。

**2.2.1. Ray的流体硫糖醇培养基检测**
我们按照Casas et al.（2002b）的方法诱导双壳类鳃部形成休眠孢子。具体步骤如下：首先切开闭壳肌以打开蛤类，然后用无菌剪刀切除其中一个鳃。将其置于含有抗生素（青霉素G，32 μg/mL；链霉素，66 μg/mL；制霉菌素，40 μg/mL；比例95:1:5）的RFTM溶液中，在室温下暗处培养5天。之后离心10分钟（113 g，20°C），弃去上清液。用氢氧化钠（2 M）在60°C下溶解鳃部沉淀物20分钟，再次离心10分钟（113 g，20°C），弃去上清液。加入1 mL PBS冲洗样本，再次离心10分钟（113 g，20°C），弃去上清液。重复此步骤两次。加入1 mL PBS并摇匀样本，使其完全溶解。将每个样本的1 mL液体接种到24孔板中，加入10 μL卢戈尔试剂（Lugol）染色休眠孢子。使用倒置立体显微镜检测休眠孢子的存在。

**2.2.2. 分子检测**
使用Chailler et al.（2025）描述的CTAB法从双壳类的第二个鳃中提取基因组DNA（gDNA）。具体步骤包括机械和化学裂解。样本在液氮中快速冷冻五次，然后用溴化丙基三甲铵裂解缓冲液（2% CTAB，100 mM Tris HCl，pH = 8，20 mM EDTA，1.4 mM NaCl）和溶菌酶（5 g/L）、蛋白酶K（0.1 g/L）及Na-sarcosyl（1%）研磨组织。在37°C下孵育一小时，加入β-巯基乙醇（0.2%）后再孵育30分钟（60°C）。将裂解液与氯仿/异戊醇（24:1，v/v）混合，然后在4°C下离心18,000 g 10分钟。水相用RNase溶液（Sigma-Aldrich，10 g/L）处理30分钟（37°C）。随后用冷异丙醇在4°C下沉淀DNA过夜。沉淀物用乙醇（76%）和醋酸铵（10 mM）冲洗两次。最后在室温下干燥沉淀物，并重新悬浮在150 μL无RNase的水中。使用Qubit dsDNA HS试剂盒（Invitrogen）测定gDNA浓度，并储存在-20°C待进一步处理。所有gDNA浓度均标准化为20 ng/μL，以避免鳃组织样本的抑制作用（Ito?z, 2021; Chailler et al., 2025）。对于dPCR分析，我们使用了特异性引物（P.olsF: 5′CAC-CAC-AAC-ACA-GTC-GGA-C3′; P.olsR: 5′TCG-TAT-TGT-AGC-CCC-TCC-G3′）和TaqMan水解探针（P.ols_probe: 5′AGA-CAC-TCA-CAG-GCG-CGG-TCC3′）（Ito?z et al., 2021），并按照制造商建议添加5′6-FAM和3′ BHQ1）。所有dPCR反应均在Qiagen的QIAcuity One Digital PCR系统和Qiagen 96孔8.5 K Nanoplate上进行（Chailler et al., 2025）。每个12 μL反应混合物包含以下成分：4x Qiagen QIAcuity Probe PCR Kit、每种引物0.8 μM、每种探针0.4 μM以及2 μL gDNA（标准化浓度为20 ng/μL）。热循环程序为初始变性95°C 2分钟，随后进行40个循环：95°C 15秒和58°C 30秒。所有反应至少重复三次，并设置一个无模板对照。空白限值（LOB）根据制造商说明，使用50个经RFTM和dPCR检测确认无P. olseni的马尼拉蛤gDNA模板确定（见补充表1）。这些dPCR检测中检测到的P. olseni平均浓度用于设定LOB，低于此阈值的浓度视为阴性，以避免假阳性。

**2.3. 寄生虫培养和实验感染**
单克隆P. olseni菌株（RCC7289，来自法国阿尔卡雄湾）在Perkinsus培养基（PBM，ATCC Medium 1886）中于26°C、黑暗条件下指数生长。实验前，菌株在PBM培养基中于20°C、黑暗条件下培养一周，直至细胞浓度达到4.8 × 10^5 cell/mL。实验感染前，向P. olseni培养基中加入L1培养基，以帮助分离聚集的营养体细胞。然后，通过以800 g（20°C）离心10分钟，将细胞浓度浓缩至5.0 × 10^6个寄生虫/毫升。共有12只成年蛤蜊被P. olseni感染。实验感染的蛤蜊总长度在33至36毫米之间，这对应于采样地点的主要大小类别（个人观察）。沿法国大西洋海岸的先前研究也报告称，在自然感染的蛤蜊种群中，Perkinsus spp.的数量在这些大小的成年蛤蜊中最高（Dang等人，2010年，Dang等人，2010年）。用含有5.0 × 10^6个寄生虫/毫升悬浮液的100微升液体将P. olseni注入蛤蜊的前闭壳肌中，相当于每只蛤蜊5.0 × 10^5个细胞的感染剂量（“感染”处理）。感染强度的选择依据了Romero等人（2015年）和Garcia等人（2022年）的研究。另有12只蛤蜊被注入100微升过滤后的海水到闭壳肌中（“未感染”处理）。注射后，未感染和感染的蛤蜊被放置在水中休息约一小时。然后它们被放入含有沉积物和过滤海水的容器中，持续15天。在这段预培养期间，每隔两天用Chaetoceros calcitrans和Isochrysis galbana（2:1的比例）混合物喂养蛤蜊，以达到最终浓度为50个细胞/毫升（Flye-Sainte-Marie等人，2007年）。在预培养期间，海水温度和盐度分别保持在11°C和35‰，以匹配现场条件（个人观察）。

2.4. 实验设置
泥沙沉积物通过1毫米的筛网过滤以去除碎屑和大型生物，然后均匀化后引入实验单元。这些单元由25厘米×9.4厘米（高度×内径）的有机玻璃管组成。这些单元被放置在一个容器中，并供应来自Morlaix湾的天然未过滤海水一个月，以重新建立生物地球化学梯度并在沉积物均匀化后达到最佳压实状态。沉积物的特性如下：沙子=90.1%，泥=9.9%，有机物=1.46%，D50=146.7微米。

2.4. 实验设置
泥沙沉积物通过1毫米的筛网过滤以去除碎屑和大型生物，然后均匀化后引入实验单元。这些单元由25厘米×9.4厘米（高度×内径）的有机玻璃管组成。这些单元被放置在一个容器中，并供应来自Morlaix湾的天然未过滤海水一个月，以重新建立生物地球化学梯度并在沉积物均匀化后达到最佳压实状态。沉积物的特性如下：沙子=90.1%，泥=9.9%，有机物=1.46%，D50=146.7微米。

2.4. 实验设置
在预培养期（见2.3节）之后，未感染和感染的蛤蜊分别被单独引入实验单元（每个单元一个双壳类动物，相当于每平方米144个个体）。然后将它们转移到100升的中型生态系统中。在中型生态系统中添加了气泡系统，以在整个培养期间保持水中的充分氧气。蛤蜊被允许挖掘两天。在第3天，在沉积物表面均匀分布了7克在紫外光下荧光的惰性颗粒（“发光剂”，尺寸范围=100-160微米，密度=2.6克/立方厘米），以评估颗粒的运输情况，即蛤蜊的沉积物重塑活动。每种处理有6个重复实验。还设置了6个“对照”单元，即不放置任何蛤蜊的单元，因此整个培养实验共有18个单元。

2.5. 营养物通量分析
在九天的培养期后，评估了沉积物-水界面（SWI）的生物地球化学通量。在每个实验单元的顶部添加了一个培养室（直径=10厘米，体积约600毫升），并加入来自中型生态系统的水（Enoksson & Ruden-Berg, 1983）。通过培养室的盖子将氧气探针（OXROB10，PyroScience）引入水柱。使用磁力搅拌器来均匀化水柱。培养持续最多5小时，并在水中的氧气水平降至80%以下时停止，因为水的氧气水平会影响沉积物-水界面的营养物化学转化和生物地球化学通量（Moore等人，1992年；Mermillod-Blondin等人，2024年）。在培养开始前，分别在抗坏血酸钠溶液和培养核心上方的饱和水中进行了0%和100%氧气的校准。在额外的培养期开始和结束时各采集50毫升水样，以量化营养物浓度。使用连续流分析仪（AA3-HR，Seal Analytical）测量溶解的NO2^-、NO3^-、PO4^3-和dSi浓度。氧气和营养物通量（净排放或消耗率）是根据培养期间的时间计算水柱中初始和最终浓度之间的差值得出的。

2.6. 沉积物颗粒混合分析
在测量了SWI的营养物通量（见2.5节）之后，确定了每个实验单元中发光剂的垂直分布。从表面到5厘米深度将沉积物芯切成0.5厘米厚的层，从5厘米到10厘米深度切成1厘米厚的层。在切片过程中，采集双壳类动物样本，并单独用海水保存，待后续解剖以量化P. olseni的数量（见2.7节）。同时记录了双壳类动物在沉积物柱中的挖掘深度。每个沉积物切片经过冷冻干燥，轻轻通过800微米筛网过滤，均匀化后取2.5克样品分散在培养皿中，然后在装有黄色滤光的数码相机下进行紫外光拍摄。半自动计数每个切片中的发光剂，从而计算出一维（1-D）的发光剂百分比垂直剖面。通过将垂直剖面与一维生物扩散模型（Maire等人，2008年）拟合来估算生物扩散Db（厘米^2·年^-1）。通过观察预测和实际发光剂垂直剖面之间的相似性以及使用最小二乘法来评估拟合的优度。还估算了最大穿透深度（MPD），即从表面开始99%的发光剂被发现的深度。

2.7. 感染摄入量的确定
我们解剖了蛤蜊的两个鳃，以分子水平确定感染量。如前所述（见2.2.2节），取样后，鳃被保存在80%的乙醇中，直到进行DNA提取。此时评估每个器官的湿重。提取gDNA，并根据每毫克湿重器官中的DNA拷贝数来确定感染强度。我们使用dPCR而不是RFTM方法来确定感染强度，以减少偏差并实现更敏感和准确的量化。dPCR提供了DNA拷贝的直接和绝对量化，确保结果的可重复性。通过dPCR获得的结果也可以与使用qPCR的先前研究进行比较，以量化Perkinsus spp.的感染情况，因为两者之间存在良好的相关性，但在高感染强度下存在低估（Chailler等人，2025年）。

2.8. 统计分析
我们进行了Wilcoxon检验，以比较未感染和实验感染蛤蜊中的P. olseni DNA负荷。使用Kruskal-Wallis检验评估了P. olseni实验感染对（1）沉积物颗粒运输（即发光剂最大穿透深度和生物扩散Db系数）和（2）SWI处营养物通量的影响。当检测到显著效应时，使用Dunn的事后检验和Bonferroni校正进行成对比较。通过进行非线性（Kendall系数）相关性分析，评估了寄生虫感染强度与MPD以及Db和沉积物柱内挖掘深度之间的关系。alpha风险阈值设定为0.05。所有统计分析均使用R（版本4.1.2，R Core Team，2022）进行。

3. 结果
3.1. 自然背景感染
在检查的50只蛤蜊中，我们没有观察到Perkinsus sp.的感染（补充表1）。

3.2. 实验感染
一只实验感染的蛤蜊没有挖掘行为，因此被排除在其余分析之外。未感染的蛤蜊没有检测到Perkinsus olseni DNA，而感染的蛤蜊显示出显著更多的寄生虫数量（Wilcoxon检验，W=15，p值=0.031）。感染强度各不相同，范围从每克湿鳃1.47 × 10^5到6.32 × 10^7个拷贝（图1）。确定了两个不同的感染强度组。第一组包括三只DNA拷贝数在10^5到10^6之间的蛤蜊，而第二组包含两只DNA计数超过10^6拷贝的蛤蜊。

3.3. 沉积物重塑活动
图2显示了每个实验单元中颗粒示踪剂的分布。第一层（0-0.5厘米）包含了大部分发光剂（64.9-98.9%）（补充图2），因此在图2中省略了这一层，以便突出更深的层次中的细微变化。

3.3. 沉积物重塑活动
图2显示了每个实验单元中颗粒示踪剂（发光剂，%）沿深度的垂直分布（不包括第一层）。在“对照”处理中，示踪剂仅限于前两层沉积物，表明沉积物混合最小。在“未感染”处理中，我们观察到发光剂相对百分比随深度呈指数下降，尽管有两个重复实验在2.75厘米深度处显示出一个小峰值（相对百分比：0.5%）。在“感染”处理中，我们也观察到发光剂相对百分比随深度呈指数下降。然而，与另外两种处理相比，深层沉积物中的重塑剖面显示出不同的趋势。在“感染”处理中，有几个重复实验在2.75厘米深度处出现了发光剂的次级峰值。实际上，在5个重复实验中有4个在1.75至3.75厘米深度之间有一个初始峰值，平均发光剂百分比为约3%。在一个重复实验中，在4.25厘米深度之后观察到了一个次级峰值，表明荧光示踪剂被更深入地埋藏。重复实验之间的变异性随深度增加，表明感染对沉积物混合动态有影响。

3.3. 沉积物重塑活动
图2显示了每个实验单元中颗粒示踪剂（发光剂）沿深度的垂直分布。第一层（0-0.5厘米）包含了大部分发光剂（64.9-98.9%），因此在图2中省略了这一层，以便突出更深的层次中的细微变化。

3.3. 沉积物重塑活动
图2显示了每个实验单元中颗粒示踪剂（发光剂，%）沿深度的垂直分布（不包括第一层）。在“对照”处理中，示踪剂仅限于前两层沉积物，表明沉积物混合最小。在“未感染”处理中，我们观察到发光剂相对百分比随深度呈指数下降，尽管有两个重复实验在2.75厘米深度处显示出一个小峰值（相对百分比：0.5%）。对于“感染”处理，我们也观察到发光剂相对百分比随深度呈指数下降。然而，与另外两种处理相比，深层沉积物中的重塑剖面显示出不同的趋势。在“感染”处理中，有几个重复实验在深层沉积物中出现了发光剂的次级峰值。实际上，在5个重复实验中有4个在1.75至3.75厘米深度之间有一个初始峰值，平均发光剂百分比为约3%。在一个重复实验中，在4.25厘米之后观察到了一个次级峰值，表明荧光示踪剂被更深入地埋藏。重复实验之间的变异性随深度增加，表明感染对沉积物混合动态有影响。

3.3. 沉积物重塑活动
从发光剂剖面（图3）中得出了最大穿透深度（MPD）为99%的发光剂和生物扩散率（Db）。在“对照”处理中，颗粒示踪剂的MPD从0.75厘米上升到“感染”处理中的平均3.35 ± 0.82厘米（平均值±标准差）（图3A）。与对照组相比，“感染”处理中的MPD显著更高。相比之下，“对照”和“未感染”处理之间的MPD没有显著差异（Kruskal-Wallis，χ^2=10.47，p值<0.01）。Db的范围在“对照”处理中为1.40 ± 0.34厘米^2·年^-1，在“感染”处理中为2.83 ± 0.66厘米^2·年^-1。与“对照”相比，“感染”处理中的Db显著更高（Kruskal-Wallis，χ^2=7.5232，p值=0.023；Dunn检验，p值=0.0189）。“对照”和“未感染”之间以及“未感染”和“感染”之间没有显著差异（Dunn检验，p值=0.0343；Dunn检验，p值=0.05）。我们观察到寄生虫感染强度与MPD之间存在显著相关性（Kendall检验，τ=0.58，p值=0.024）。相比之下，寄生虫感染强度与Db或双壳类动物的挖掘深度之间没有显著相关性（Kendall检验，p值>0.05）（补充图3）。

3.4. 沉积物-水界面的氧气吸收和营养物通量
“对照”处理中的沉积物氧气吸收量范围为14.51 ± 0.98毫米摩尔O2·平方米·天^-1，“未感染”处理中为27.20 ± 12.00毫米摩尔O2·平方米·天^-1，“感染”处理中为34.46 ± 9.32毫米摩尔O2·平方米·天^-1（图4A）。仅在“对照”和“感染”处理之间观察到氧气消耗的显著差异（Kruskal-Wallis，χ^2=8.36，p值=0.015）。无论是否感染P. olseni，蛤蜊对亚硝酸盐和硝酸盐（NO[x]）（图4B）、磷酸盐PO4^3-（图4C）和溶解硅酸盐dSi（图4D）在沉积物-水界面的通量没有显著影响（Kruskal-Wallis，p值>0.05）。没有观察到寄生虫感染强度与氧气吸收或任何测量到的营养物通量之间的显著相关性。

3.4. 沉积物-水界面的氧气吸收和营养物通量
“对照”处理中的沉积物氧气吸收量范围为14.51 ± 0.98毫米摩尔O2·平方米·天^-1，“未感染”处理中为27.20 ± 12.00毫米摩尔O2·平方米·天^-1，“感染”处理中为34.46 ± 9.32毫米摩尔O2·平方米·天^-1（图4A）。仅在“对照”和“感染”处理之间观察到氧气消耗的显著差异（Kruskal-Wallis，χ^2=8.36，p值=0.015）。无论是否感染P. olseni，蛤蜊对硝酸盐和硝酸盐（NO[x]）（图4B）、磷酸盐PO4^3-（图4C）和溶解硅酸盐dSi（图4D）在沉积物-水界面的通量没有显著影响（Kruskal-Wallis，p值>0.05）。**Ruditapes philippinarum 的原位感染与 Perkinsus olseni**
目前仅有两项研究调查了法国境内 Perkinsus 属物种的分布情况（Goggin 等人，1992 年；Arzul 等人，2012 年），且 Morlaix 海湾并未被纳入这两项研究的采样地点。本研究证明，用于实验的当地野生 Manila 蛤类种群未受到任何 Perkinsus 属物种的感染。在筛查的 50 只蛤蜊中，使用 RFTM 测定方法均未检测到休眠孢子阶段的阳性结果。这些结果通过 dPCR 测定得到了进一步验证，表明 Morlaix 海湾的蛤蜊种群适合进行离体实验感染。

**4.2. Ruditapes philippinarum 的 Perkinsus olseni 实验感染**
本研究中使用的 Perkinsus olseni 单克隆菌株来自法国 Arcachon 海湾。成年蛤蜊被暴露于 Perkinsus olseni 滋养体培养物中，感染强度在感染后三周通过 dPCR 进行了定量分析。结果显示感染强度范围广泛，每克湿润鳃组织中的 DNA 复制数从 10^5 到 10^7 不等。这些发现与 Chaillier 等人（2025 年）在法国多个大西洋沿岸站点（包括 Noirmoutier 和 Arcachon 海湾）自然感染成年蛤蜊的研究结果一致。尽管 dPCR 可能会低估高感染强度（与 Ito?z 等人（2024 年）在 Arcachon 海湾的观察结果一致），但其生物学和方法学上的可靠性仍与以往研究相当。为了与传统的检测方法（RFTM）进行比较，根据 Ito?z 等人（2021 年）的方法计算每克湿润组织中的细胞数量，本研究中样本的感染强度达到了每克湿润鳃组织 10^6 个细胞的水平。

本研究中观察到的蛤蜊间感染强度的差异不能归因于非生物因素，因为所有蛤蜊从采样到解剖过程都处于相同的条件下。此外，从沉积物中回收的 Perkinsus olseni 休眠孢子和/或前滋养体阶段的污染也不太可能发生，因为（i）沉积物在培养前已被混合；（ii）这些沉积物来自确认无 Perkinsus 的地点。因此，感染强度的差异更可能是由于个体间的易感性差异所致，这可能与蛤蜊初始免疫状态的变化有关（da Silva 等人，2008 年）。我们评估了蛤蜊鳃部的感染程度，因为鳃部被认为是评估感染强度的最相关器官（W.O.A.H., 2021）。双壳类的工程活动之一是其过滤作用，这会影响水柱中的光照可用性、生物沉积过程以及底栖生物群落组成（Pranovi 等人，2006 年；Sousa 等人，2009 年）。先前的研究表明，Perkinsus 寄生虫会降低幼年蛤蜊的过滤速率（Waki & Yoshinaga, 2018 年）。这些效应在成年蛤蜊中的影响尚待评估，可能会通过改变该双壳类物种在碳封存和底栖沉积中的作用而产生广泛影响（Zhang 等人，2025 年）。作为生物扰动者，R. philippinarum 的重要器官是足部。一旦感染建立，Perkinsus 寄生虫会在宿主器官中广泛分布（Cui 等人，2018 年；Ito?z 等人，2024 年），严重感染时受影响器官会出现白色结节（Park 和 Choi, 2001 年）。但在我们的研究中未观察到这些现象，这表明蛤蜊组织内的感染程度较低至中等，与鳃部已量化的感染强度相符。因此，可能需要更长的培养时间才能使寄生虫在宿主组织中完全发育，进一步研究感染的动态和器官趋向性有助于了解感染如何在蛤蜊器官内传播及其对宿主工程活动的影响。

**4.3. Perkinsus olseni 对 Ruditapes philippinarum 沉积物重塑活动的影响**
未感染和感染蛤蜊的发光蛋白谱相似，表明 Perkinsus olseni 并未改变其宿主的生物扰动方式。实际上，在“未感染”和“感染”处理组中，我们观察到发光蛋白沿沉积物柱的浓度呈指数下降，这是生物扩散型沉积物重塑的特征，即生物在短距离内随机运输沉积物颗粒（Fran?ois 等人，1997 年）。这一观察结果与 Norkko 和 Shumway（2011 年）的先前研究一致。尽管 Perkinsus olseni 不改变 R. philippinarum 的沉积物重塑类型，但它增强了宿主活动的强度。在“感染”处理组中，特别是在约 2.25 厘米深度处观察到了明显的峰值，而在“未感染”处理组中则没有这种现象。感染蛤蜊的发光蛋白最大穿透深度和生物扩散系数 Db 也高于“对照”处理组（即无蛤蜊的情况），而“未感染”和“对照”处理组之间没有显著差异。这一结果令人惊讶，因为先前的研究通常表明寄生虫感染会降低宿主的生物扰动活动强度（例如，Dairain 等人，2020 年；Pascal 等人，2020 年）。尽管这些研究涉及的是大型寄生虫，但迄今为止尚未有研究量化微寄生虫对底栖无脊椎动物生物扰动活动的影响。然而，Nam 等人（2018 年）报告称，高度感染 Perkinsus olseni 的 Manila 蛤类在浮出水面后无法挖掘，因此可以预期这些生物的生物扰动活动会减弱。研究之间的差异可能由感染强度的不同以及宿主对感染程度的非线性反应解释。可以假设寄生虫的有害效应存在一个阈值，而不是剂量依赖关系。事实上，我们观察到的感染强度有两个数量级，但感染强度与双壳类的沉积物重塑活动之间没有显著相关性。这些感染强度也低于那些影响生物体生理功能的感染强度（Fernández Boo 等人，2023 年）。

我们观察到未感染和感染蛤蜊的沉积物重塑活动存在显著的个体间差异，但在感染组中个体间差异较小。这表明感染可能引发了更一致的行为反应，可能是由感染引起的应激所驱动的。这种有限的个体间差异可能反映了典型的行为模式，这种模式可能抵消了与感染相关的能量损失，或者优化了能量消耗，因为蛤蜊无法承受因感染而产生的代谢成本（Soudant 等人，2013 年）。这种策略性的迟钝行为在脊椎动物中也有记录（Lopes 等人，2021 年；Nadler 等人，2023 年），这可能解释了我们的观察结果。

**4.4. 氧气释放**
我们未观察到未感染和感染蛤蜊之间的总氧气吸收量有显著差异。然而，“感染”处理组的总氧气吸收量高于“对照”处理组，而“对照”和“未感染”处理组之间没有显著差异。因此，当存在感染蛤蜊时，氧气消耗量似乎更高。先前的研究也报告了感染和未感染个体之间的这种差异（Casas, 2002 年），表明感染可以在实验条件下改变生理过程而不总是产生统计学上的显著效应。在我们的实验中，沉积物芯样本中只包含一只双壳类动物和重新建立的微生物群落。“感染”处理组中观察到的氧气消耗增加可能是由于（1）微生物的有氧呼吸；（2）双壳类的呼吸速率；或（3）这两种活动的结合。由于所有样本中的微生物群落来自相同的海水，我们假设不同处理组之间的微生物群落相似，因此微生物的代谢过程不太可能有显著差异。更合理的解释是 Perkinsus olseni 感染刺激了蛤蜊的代谢活动。先前的研究表明，Perkinsus olseni 感染会激活宿主的免疫系统、组织修复和维持，从而增加双壳类的氧气消耗（Soudant 等人，2013 年；Garcia 等人，2022 年；Fernández-Boo 等人，2023 年）。另一种解释可能是营养液培养时间的影响。由于这些蛤蜊是潮间带生物，未感染的蛤蜊可能大部分时间处于闭合状态，依靠壳内溶解的氧气进行呼吸，或者在这四小时内切换到厌氧代谢（Yin 等人，2017 年）。相比之下，受感染的压力可能导致感染蛤蜊需要更高的氧气水平，并更频繁地打开壳瓣，这也可能解释了我们观察到的更高沉积物颗粒运输速率。

**4.5. Perkinsus olseni 对生物地球化学循环的影响**
我们评估了蛤蜊对沉积物-水界面营养通量的影响，以评估它们作为生态系统工程师的作用。无论感染状态如何，我们均未发现蛤蜊对沉积物-水界面营养通量有显著影响。已知生物扩散型生物对营养通量的影响有限（Mermillod-Blondin & Rosenberg, 2006）。然而，先前的研究表明 Manila 蛤类可以增强沉积物的氧化和氮循环过程（Welsh 等人，2015 年）。本研究表明，感染 Perkinsus olseni 的蛤蜊表现出略高的沉积物重塑活动，因此可以预期 Perkinsus olseni 会促进有机物的循环和沉积物-水界面的生物地球化学交换。例如，R. decussatus 蛤类移动沉积铁的能力取决于 Perkinsus olseni 的感染程度（Sim?o 等人，2010 年），高度感染的个体移动的铁量少于轻度或未感染的蛤蜊。这些研究之间的差异可能是由于方法学上的差异。特别是，我们进行的短时间培养可能限制了我们检测双壳类沉积物重塑活动引起的营养通量变化的能力（Dairain 等人，2024 年）。不同研究之间沉积物特性的差异也可能解释这些差异，因为某些研究使用的沉积物含有更多有机物质（Welsh 等人，2015 年）。尽管目前难以对 Perkinsus olseni 对营养通量的影响得出明确结论，但我们应该指出，我们目前研究的是 Manila 蛤类作为生态系统工程师的一个方面。这种双壳类因其能够影响沉积物的生物地球化学性质和稳定性而被认为是工程师物种（Sgro 等人，2005 年）。其过滤作用还可以通过减少悬浮颗粒和浮游植物浓度来影响光照可用性（Sousa 等人，2009 年），Perkinsus olseni 感染是否会影响蛤蜊的其他结构活动仍有待研究。

**5. 结论**
本研究表明，非致命的 Perkinsus olseni 感染对 Manila 蛤类（Ruditapes philippinarum）的生物扰动活动影响有限。感染蛤蜊的沉积物重塑活动、氧气释放和营养通量与未感染蛤蜊基本相同。尽管受到感染引起的应激，蛤蜊仍继续作为生物扩散型生物扰动者发挥作用。轻微的趋势，如沉积物重塑活动的增加和感染蛤蜊间变异性的减少，表明可能存在行为适应。感染强度与行为之间缺乏相关性，以及与其他因素相关的个体间变异性的丧失，表明这些效应并非剂量依赖的，而是由阈值效应而非线性反应所主导。未来的研究应探讨更严重感染（包括可见结节的存在）对生物扰动和营养循环的影响。探索其他行为，如壳瓣开启频率和过滤速率，也将提供新的见解。这些努力将加深我们对寄生虫对生态系统工程师物种生态影响的理解。

**遵守伦理标准**
本研究遵循了所有适用的国际、国家和/或机构关于动物护理和使用的指南。

**未引用的参考文献**
Chiesa 等人，2017 年；Flassch 和 Leborgne，1992 年；Mouritsen，2002 年；Ruano 等人，2015 年。

**作者贡献声明**
Héliaz Le Bayon：撰写——原始草稿、方法学、数据分析；Elisa Chailler：数据分析；Sarah Bureau：数据分析；Jér?me Coudret：数据分析。卡罗琳·布劳丁（Caroline Broudin）：形式分析
塞琳·乌班（Céline Houbin）：形式分析
艾丽西亚·罗梅罗-拉米雷斯（Alicia Romero-Ramirez）：软件开发
奥蕾莉·尚布韦（Aurélie Chambouvet）：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、资源协调、项目管理、研究方法设计、资金筹措、概念构思
安娜贝尔·戴兰（Annabelle Dairain）：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、资源协调、项目管理、研究方法设计、资金筹措、形式分析、概念构思