综述：通过酶法和微生物途径生产生物塑料：生物聚合物的绿色化学前沿

《FEBS Open Bio》：Enzymatic and microbial routes to bioplastics: The green chemistry frontier of biopolymers

　　摘要

全球塑料消费的迅速增加，加上石化聚合物对环境的影响，引发了对生物塑料的极大兴趣，尤其是那些通过微生物和酶促过程制成的生物塑料。本综述全面概述了塑造下一代生物塑料的代谢途径、结构特性和新兴技术创新，特别关注聚羟基烷酸酯（PHA）。以下部分详细介绍了基于生物的和可生物降解的塑料之间的概念区别，以及负责PHA生物合成、PLA前体、细菌纤维素、微生物聚酰胺和其他生物衍生聚合物的关键细菌途径。同时分析了基于PHA的材料的物理化学和形态特征，包括单体组成、结晶度、共聚物结构和分子量。随后探讨了这些特征与材料机械性能和热性能之间的关系。专门有一节讨论了体外酶促PHA合成的最新进展，涵盖了PHA合成酶（PhaC）的类别、工程化变体、无细胞代谢工程平台、酶固定化以及实现完全可编程和模块化聚合的表面展示策略。最后，我们讨论了未来的发展方向，特别强调了可持续原料、通过合成生物学提高工艺效率以及大规模应用所需的监管环境。本综述整合了生化、结构和生物加工方面的见解，以描绘当前进展并确定策略方向，使酶促生物塑料成为循环生物经济框架内可扩展、可定制且环保的替代品。

**影响声明**

本综述重点介绍了通过微生物和酶促途径生产聚羟基烷酸酯基生物塑料的最新进展，特别是工程化酶和无细胞系统。通过整合生化和生物加工方面的见解，它提出了在循环生物经济框架内实现可扩展和可持续生物聚合物生产的策略。

**缩写**

3HV：3-羟基戊酸酯
3HB：3-羟基丁酸酯
3HH：3-羟基己酸酯
3HHx：3-羟基己酸酯单元
BDO：1,4-丁二醇
CFME：无细胞代谢工程
CoA：辅酶A
FDCA：2,5-呋喃二羧酸
GRAS：公认安全（Generally Recognised As Safe）
HA：羟基酰
LCA：生命周期分析（Life-Cycle Analysis）
LA：乳酸
LCL-PHA：长链长度聚羟基烷酸酯
LPE：乳酸聚合酶；中链长度聚羟基烷酸酯
Mw：分子量
P(3HB-4HB)-3HV：聚(3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)
P(3HB-co-3HV)：聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)
P(3HB-co-3HHx)：聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)
PBAT：聚(丁酸乙二醇酯-共-对苯二甲酸)
PBS：聚(丁酸琥珀酸)
PCL：聚己内酯
PE：聚乙烯
PEF：聚(乙烯呋喃酸)
PET：聚(对苯二甲酸乙二醇酯)
PHA：聚羟基烷酸酯
PhaC：PHA合成酶
PHB：聚(3-羟基丁酸酯)
PHBH：聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)
PHBV：聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)
PLA：聚乳酸
PP：聚丙烯
SCL-PHA：短链长度聚羟基烷酸酯
SpyTag/SpyCatcher：分子标记/支架系统
Tg：玻璃化转变温度（Glass Transition Temperature）
Tm：熔化温度（Melting Temperature）
γ-PGA：聚-γ-谷氨酸
ε-PL：ε-聚-L-赖氨酸

**基于生物的和可生物降解的塑料：概念与区别**

生物塑料的定义包括可能是基于生物的和/或可生物降解的聚合物材料。具体来说，如果一种塑料材料（即使部分）是由可再生生物质生产的，或者它能够被微生物降解（或同时具备这两种特性），则被归类为生物塑料[[1]]。必须明确区分“基于生物的”和“可生物降解的”这两个概念，因为它们并不相互蕴含。需要澄清的是，并非所有来自可再生资源的塑料都是可生物降解的，反之亦然，并非所有可生物降解的塑料都来源于生物质[[2]]。例如，有些基于生物的聚合物在化学上与石油基塑料相同（如从生物资源中获得的聚乙烯或PET），也有一些合成聚合物是化石来源的，但被设计为可生物降解的（如聚(丁酸乙二醇酯-共-对苯二甲酸)，PBAT）。前缀“bio”仅表示用于生产的原材料是可再生的，并不保证最终的聚合物材料本身具有生物降解性。“生物塑料”这一术语涵盖了具有多种原材料来源和最终处理方式的多样化聚合物家族（图1）。开发生物塑料的动机有两个方面：环境和工业需求。其目标是双重的：首先，减轻传统塑料的影响；其次，使这一材料行业更加环保。目前全球传统塑料的年产量约为4亿吨，但其中不到10%被回收；其余部分堆积在垃圾填埋场或分散到陆地和海洋生态系统中，从而导致塑料废物和微塑料的广泛污染[[3]]。这一严重的环境问题，加上化石资源的枯竭，促使人们探索更可持续的替代品。据推测，基于生物的聚合物的碳足迹低于石化塑料，因为它们生产和降解过程中释放的CO2可以被植物在生长过程中吸收的CO2所抵消。总之，使用可再生原材料有助于部分闭合碳循环，从而将塑料生产纳入循环经济模式。公众对环境问题的日益关注，以及日益严格的环境法规（例如禁止一次性塑料和回收目标），也促进了生物塑料的采用，以减少对化石燃料的依赖和塑料循环对环境的影响。截至2022年，全球可生物降解生物塑料的产量已达到约220万吨，并预计到2027年将增加三倍。这反映了工业投资和监管压力向可持续材料方向的转变[[4, 5]]。在这一快速发展的领域中，聚羟基烷酸酯（PHA）虽然占比较小，但正在增长。尽管在全球产量中所占份额有限，PHA具有独特的优势，包括完全可生物降解性、生物相容性和微生物来源，使其特别适合高价值应用，如包装、农业和生物医学设备[[6]]。越来越多的工业规模PHA生产设施的出现，以及跨国公司的进入，表明这类聚合物正在获得经济动力。同时，国家和超国家政策框架为可生物降解和基于生物的塑料的采用创造了有利条件[[7]]。例如，欧盟的《一次性塑料指令》禁止使用多种化石基一次性产品，最近的立法提案提倡在特定应用中使用认证的可堆肥包装。加州和加拿大等地区也实施了明确鼓励使用可堆肥包装的法规[[5]]。这些措施与日益统一的组成标准（如EN 13432、ASTM D6400）以及公众对塑料污染意识的提高相结合，促使人们转向PHA和其他酶促衍生的聚合物作为循环经济中的可行、可扩展的解决方案[[8]]。

**塑料的分类（按来源和可生物降解性）**
该图通过交叉来源（基于生物的 vs 化石基）和可生物降解性来区分四种类型的塑料。例如，基于生物但不可生物降解的塑料（如bio-PE（聚乙烯）和bio-PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）虽然由可再生原料生产，但在化学上与化石衍生聚合物相同。基于生物且可生物降解的塑料（如PLA（聚乳酸）、PHA（聚羟基烷酸酯）、PBS（聚丁酸琥珀酸）等结合了可再生来源和微生物降解性。化石基但不可生物降解的塑料（如PE、PP（聚丙烯）、PET）代表了具有持续环境影响的传统聚合物。化石基但可生物降解的塑料（如PBAT（聚(丁酸乙二醇酯-共-对苯二甲酸)）、PCL（聚己内酯）表明可生物降解性并不取决于生物来源。该图明确了“基于生物的”和“可生物降解的”是独立的属性。生物塑料被推广为传统塑料的“绿色”替代品，具有促进可持续性的潜力[[4]]。然而，它们的实际使用仍需要适当的生命周期管理系统和符合循环性标准的设计。在这方面，专注于可持续性的新聚合物和生产过程的发展正在推动化学工业创新，以生产环境影响较小的产品。从技术角度来看，生物塑料可以分为两大类：可生物降解的聚合物（通常是基于生物的）和不可生物降解的基于生物的聚合物[[9]]。前者包括各种来自可再生资源的脂肪族聚酯或通过发酵生产的聚合物。值得注意的例子包括聚乳酸（PLA）、PHA（如聚(3-羟基丁酸酯)、聚(丁酸琥珀酸)（PBS）以及基于淀粉和其他天然多糖的复合材料。这些基于生物的、可生物降解的聚合物表现出与传统塑料相似的特性，占总生物塑料生产能力的50%以上。相反，该行业的相当大比例（约40-45%）是由生物原料制成的传统合成聚合物[[7]]。例如，bio-PE（从生物乙醇中提取的聚乙烯，化学上与传统聚乙烯相同）和bio-PET（部分来自生物质的聚对苯二甲酸乙二醇酯），以及生物聚酰胺和其他来自可再生资源的不可生物降解的热塑性塑料。使用这些材料可以减少对化石资源的依赖，同时保持与传统产品相当的性能[[10]]。此外，这些材料需要与传统的化石基塑料相同的回收渠道[[8]]。重要的是，PHA已经实现了商业化生产，证明了它们是可行的工业生物塑料，而不仅仅是实验室级别的材料。日本Kaneka公司就是一个显著的例子，该公司大规模生产PHA共聚物聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)（PHBH?），并以“Kaneka Green Planet”品牌销售[[8]]。PHBH?是通过使用可再生原料（主要是植物油）进行微生物发酵生产的，已在包括日本、欧盟和美国在内的多个地区获得用于食品接触应用的批准。目前的年生产能力已达数万吨级别，并计划进一步扩大以满足对可生物降解包装材料不断增长的需求。其他几家公司也进入了PHA市场，包括Danimer Scientific、CJ Biomaterials、RWDC Industries和TianAn Biologic Materials，这表明这一类聚合物正在获得经济动力[[7]]。这些生产商使用多种原料，包括植物油、糖类、废物衍生底物和甲烷。这突显了原料选择对生产成本和可持续性的重要性。到目前为止，市场应用主要集中在包装、食品服务用品、农业薄膜和选定的生物医学用途上，其中可生物降解性、生物相容性和监管压力的结合提供了明确的价值主张[[9]]。目前，PHA的生产成本仍高于传统石化塑料，主要是由于原料成本、发酵效率和下游回收过程的成本。因此，迄今为止的工业成功突显了工艺优化、使用低成本或废物基碳源以及以应用为导向的材料设计在实现经济可行的大规模生产方面的重要性。现有的商业例子为PHA在循环经济中的大规模应用提供了宝贵的见解[[11]]。尽管可生物降解性常被视为PHA的重要优势，但必须认识到有效的生物降解在很大程度上取决于环境条件。PHA在工业堆肥条件下（50-60°C，高微生物活性）会迅速矿化，符合国际标准（如EN 13432和ASTM D6400）。然而，在家庭堆肥、土壤或海洋环境中的降解通常较慢，并受温度、湿度、微生物群落组成、聚合物结晶度和材料厚度等因素的影响[[11, 12]]。与其他大多数可生物降解塑料相比，PHA在自然环境（包括土壤和海洋环境）中也表现出可生物降解性。这支持了它们适用于无法完全避免环境泄漏的应用[[9]]。最后，值得注意的是，许多具有重大意义的生物塑料，特别是PHA，是由微生物通过特定代谢途径自然产生的。PHA是一类由多种细菌在碳源过剩和其他营养物质有限的情况下在细胞内合成和积累的微生物聚酯。这种内在的生物能力为利用发酵和代谢工程从可再生资源高效生产可生物降解塑料提供了重要机会。因此，全面了解负责制造这些生物塑料的细菌生物合成途径（例如导致PHA在细菌中积累的酶促机制）至关重要[[11]]。下一段将探讨参与生物塑料合成的微生物代谢途径，特别关注优化细菌生产PHA和其他可生物降解聚合物的生化和遗传策略。这种结合工业微生物学和材料科学的综合方法对于开发下一代可持续生物塑料和促进其全球传播至关重要[[12]]。

**微生物生物聚合物生产的最新进展**

代谢工程和合成生物学的最新进展促进了通过多种生物合成途径的生物塑料的微生物生产。这些途径的分类可以大致分为两类：第一类是微生物自身合成最终聚合物；第二类是通过发酵产生的生物基单体进行组装（见表1）。这种区分对于理解每种方法的技术、环境和经济影响至关重要。显然，微生物，尤其是细菌，具有通过高度特异性的酶促途径合成多种聚合物材料的能力。细菌生产生物塑料的策略可以分为两种主要方法[[13]]。第一种是直接聚合物合成，表现为细胞内积累（例如聚酯颗粒，如PHA）或细胞外分泌（例如多糖，如黄原胶和纤维素）。第二种方法利用微生物对前体的发酵，将可再生底物转化为单体构建块[例如乳酸、琥珀酸和1,4-丁二醇（BDO）]，然后这些单体在体外（通常通过化学方法）聚合成为聚合物，如PLA或PBS[[14]]。这些生物合成途径与发酵过程紧密相关，选择合适的微生物菌株、进行基因优化以及严格控制生长参数（例如pH值、温度、营养物质的可用性和氧气）对于最大化产量至关重要[[15, 16]]。表1概述了主要的微生物生产的生物聚合物，包括它们的化学类别、生物合成途径、代表性生产微生物、关键特性和典型应用。mcl-PHA=中链长度聚羟基烷酸酯，PBS=聚丁ylene succinate，PEF=聚乙烯呋喃酸酯，PHA=聚羟基烷酸酯，PHB=聚(3-羟基丁酸酯)，PHBV=（聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)），PLA=聚乳酸，γ-PGA=聚-γ-谷氨酸，ε-PL=ε-聚-L-赖氨酸。

聚合物类别 | 生物步骤（微生物实际执行的操作） | 典型生产微生物/平台 | 体外步骤（如果存在） | 关键特性/典型用途 | 参考文献
------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|----------------|
PHA（例如PHB、PHBV、mcl-PHA） | 细胞将羟基酰基-CoA聚合为PHA颗粒（细胞内积累） | Cupriavidus necator, Azohydromonas lata, Halomonas spp., Pseudomonas spp. | 无（聚合物已形成；后续步骤=回收/纯化） | 完全可生物降解/生物相容；包装、农业、生物医学 | [[17, 18]]
细菌纤维素 | 细胞将葡萄糖聚合为纤维素（细胞外分泌） | Komagataeibacter spp. | 无 | 高纯度水凝胶；食品、伤口敷料、生物材料 | [[99]]
黄原胶 | 细胞合成并分泌黄原胶 | Xanthomonas campestris | 无 | 增稠剂/流变改性剂；食品/工业 | [[19]]
海藻酸盐 | 细胞合成并分泌海藻酸盐 | Azotobacter vinelandii（一般文献中也提到Pseudomonas spp.） | 无 | 粘稠凝胶；封装、生物医学 | [[100]]
γ-PGA | 细胞将谷氨酸聚合为γ-PGA（胞外） | Bacillus subtilis | 无 | 增稠剂、保湿剂；化妆品/食品 | [[101]]
ε-PL | 细胞将赖氨酸聚合为ε-PL（细胞外） | Streptomyces albulus | 无 | 抗菌剂；食品防腐剂 | [[102]]
蓝藻菌素 | 类聚酰胺（聚氨基酸） | 蓝细菌 | 无 | 氮储备；潜在的肥料前体 | [[103]]
PLA | 微生物产生乳酸（LA）（单体），而不是PLA | Lactobacillus spp.（工业乳酸）；用于乳酸-CoA途径的工程菌株是单独的情况 | 化学聚合（通常通过内酯的开环聚合）；在特定情况下也可以使用酶促途径 | 可生物降解；包装、一次性用品、生物医学 | [[27]]
PBS | 微生物通过发酵产生琥珀酸和/或BDO（单体） | Actinobacillus succinogenes, Corynebacterium glutamicum（琥珀酸/BDO的供应示例） | 琥珀酸+BDO的缩聚（化学催化；也有酶促替代方法） | 可塑性强且可生物降解；包装、农业薄膜 | [[32]]
PEF | 可再生路线提供FDCA + EG（生物基单体；根据工艺不同，可采用微生物/酶促/化学-生物途径） | “微生物从糖/乙醇转化”（除非指明具体微生物/工艺，否则保持通用） | 化学聚合 | PET的替代品；不易生物降解 | [[33]]

值得注意的是，有些聚合物完全是在发酵过程中由微生物合成的，微生物将底物直接转化为成品聚合物，无需外部聚合步骤。在这种情况下，聚合物在微生物细胞内积累或分泌到周围介质中。PHA就是一个典型的例子，这是一种由许多细菌产生的可生物降解的聚酯类物质，用作细胞内的碳和能量储存材料。这些PHA[例如聚(3-羟基丁酸酯)及其共聚物]直接由细菌聚合，并以颗粒形式储存在细胞质中。例如，Cupriavidus necator中的聚羟基丁酸酯（PHB）的积累或Komagataeibacter产生的纤维素就是通过这种方式合成的[[17-19]]（表1）。其他由微生物合成的聚合物还包括某些多糖（例如细菌纤维素、黄原胶和右旋糖酐）以及聚酰胺或聚氨基酸（例如由Bacillus物种产生的聚-γ-谷氨酸）（表1）。在所有这些情况下，微生物的新陈代谢过程本身构建了聚合物链，从而可以直接从发酵液或细胞生物质中收获生物聚合物。这种仅涉及发酵的一步过程由于在单一生物反应器中进行聚合物生产而具有优势。然而，需要注意的是，为了实现最大产量，可能需要仔细优化培养条件。例如，营养限制常常会诱导PHA的积累作为对压力的响应。尽管微生物合成具有更高的特异性，并且在比石化合成更温和的条件下进行，但实现高产量和浓度仍然是一个工程挑战。合成生物学和代谢工程的进步对于重新定向代谢流和增强细胞稳定性至关重要[[20]]。此外，可能存在超出细胞能力的聚合物分子量或组成的限制。PHA是一类受到广泛关注的微生物衍生聚酯，作为完全可生物降解的生物塑料。这些聚合物在许多细菌中作为碳和能量储备，以不溶性颗粒的形式在细胞质中积累[[21]]。据估计，已经鉴定出超过150种PHA单体，从而产生了具有不同性质的最终聚合物，包括刚性热塑性塑料（例如PHB）和弹性体，其中PHB的机械性能可与聚丙烯（PP）相媲美[[22]]。这些材料的吸引力在于它们的可生物降解性（在各种自然环境中通过PHA解聚酶的作用）和生物相容性。PHB的生物合成由三种关键酶催化：β-酮硫醇酶、乙酰乙酰-CoA还原酶，以及至关重要的PHA合成酶（由phaC基因编码），该酶负责聚合3-羟基酰基-CoA底物。这些合成酶的特异性决定了聚合物链的长度[[23]]。例如，Cupriavidus necator主要产生PHB（C4单体），而Pseudomonas putida可以从脂肪酸中积累中链PHA，利用β-氧化途径。在这些生产者中，mcl-PHA的组成受到所提供碳源（例如脂肪酸与糖）和激活的代谢途径（β-氧化与从头脂肪酸合成）的强烈影响，这些因素决定了PhaC可用的(R)-3-羟基酰基-CoA单体的种类。PHA的积累通常是由营养限制（例如氮或磷缺乏）在碳过剩的情况下诱导的[[21]]。据估计，有超过300种细菌可以产生PHA。例如Azohydromonas lata和Cupriavidus necator已被证明可以积累高达其干细胞重量80–90%的PHA[[21, 24]]。特别是在高细胞密度的批次培养中，优化过程已经使得生物反应器中的产量接近100克/升。为了降低成本并提高可持续性，研究集中在利用极端微生物（例如Halomonas spp.）上，这些微生物能够在非无菌条件下促进发酵并通过盐诱导的细胞裂解简化提取过程[[25, 26]]。

大量的生物基聚合物是通过两步过程合成的。首先，微生物发酵可再生原料以产生单体前体。其次，这些单体在细胞外通过化学或酶促反应聚合。在这种方法中，微生物的作用是高效生成构建块（单体，如有机酸和二醇或二胺），而不是聚合物本身。PLA就是一个显著的例子。在这个过程中，乳酸最初通过乳酸菌的发酵大规模生产，以Lactobacillus菌株为模型。这种生物来源的乳酸主要以L-异构体形式存在，随后在体外通过化学方法转化为内酯，然后通过开环聚合反应聚合为PLA聚合物。需要注意的是，在传统的工业路线中，微生物并不直接合成PLA；相反，它们提供乳酸，随后在工业反应器中聚合。尽管这种方法已被证明是有效的，但代谢工程的最新进展为直接微生物合成PLA铺平了道路[[27]]。这种“一锅法”策略涉及在工程细菌菌株（例如大肠杆菌）中表达关键酶（例如丙酰-CoA转移酶和PHA合成酶），使得细胞内的乳酸能够直接聚合为PLA链或混合共聚物[例如聚（乳酸-共-3-羟基丁酸酯）]，从而绕过了中间的化学和纯化步骤。除了PLA之外，细菌还在生产其他聚酯所需的生物基单体的供应链中发挥着关键作用。值得注意的是，作为可生物降解的聚酯，PLA也可以通过酶促解聚[[28]]，最近的研究表明，定制的水解酶和氧化酶组合可以在温和条件下显著加速其分解[[29]]，为PLA的高效回收提供了有前景的生物催化途径。类似地，琥珀酸、1,3-丙二醇、己二酸、乙二醇和其他分子也可以通过工程微生物从可再生原料中发酵。这些分子可以作为合成聚酯或聚酰胺等聚合物的前体。例如，基于生物的琥珀酸和BDO的组合已被证明可以生成聚（丁ylene succinate），而基于生物的1,3-丙二醇已被用于生产聚（对苯二甲酸乙二醇酯）。PBS是通过琥珀酸和BDO的缩聚合成的。这些前体可以通过发酵过程获得[[30, 31]]。例如Actinobacillus succinogenes和工程Corynebacterium glutamicum已被证明可以产生高浓度的琥珀酸（超过100克/升），BDO也可以从葡萄糖生物生产[[32]]。生物琥珀酸和生物BDO的混合物有助于合成主要是生物基的PBS，这是一种可塑性强且可生物降解的聚合物，用于制造农业薄膜和包装。类似的原则也适用于新一代聚酯聚（聚乙烯呋喃酸酯）（PEF），其单体2,5-呋喃二羧酸（FDCA）和乙二醇来自微生物或酶促过程，从糖和生物乙醇开始。然而，PEF并不容易生物降解[[33]]。在第二步中也可以使用酶促聚合方法，例如使用脂肪酶作为催化剂来形成聚酯，这在某些情况下提供了比化学催化剂更温和的替代方案。

PHA是可生物降解、生物相容、无毒的热塑性塑料，不溶于水但可溶于各种氯化溶剂。PHA最早由法国研究人员Maurice Lemoigne在1926年发现，他在Azotobacter chroococcum和Bacillus megaterium中识别出这些物质作为细胞内的包涵体。这种聚合物后来被鉴定为PHB[[34]]。PHA由线性羟基脂肪酸单体组成。每个单体中的侧链（R基团）的长度和结构强烈影响最终聚合物的整体结构和物理化学性质[[35-37]]。当单体含有3-5个碳原子时，所得聚合物被归类为短链长度PHA（SCL-PHA）。这些聚合物类似于传统热塑性塑料，通常脆且硬，具有较高的结晶度（60–80%）。中链长度PHA（MCL-PHA）由含有6-14个碳原子的单体组成，其性质更接近弹性体[[38]]。含有超过14个碳原子的单体组成的聚合物被称为长链长度PHA（LCL-PHA）（表2）。MCL-PHA和LCL-PHA通常具有较低的结晶度（约25%）、较高的断裂伸长率和较低的熔点[[39, 40]]。SCL-PHA主要由PHB组成，这是一种硬而脆的聚合物，熔点（Tm）约为179°C。这个值接近其分解温度（200–300°C）[[41, 42]]，这限制了其热加工窗口。提高PHA的热和机械性能的一种常见策略是合成随机共聚物，例如聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯）（PHBV）和三元共聚物聚（3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯）（P(3HB-4HB)-3HV）[[40, 43]]。PHA还可以根据生产过程中使用的碳源进行分类。第一类是从传统碳源（如糖、植物油和动物脂肪酸）生产的，这些碳源含有形成PHA聚合物链的羟基酸[[44]]。此外，第二类是从改性碳源生产的，可以创建具有不同侧链功能基团和改变的形态及物理性质的新的聚合物[[45]]。羧基化、羟基化和接枝共聚可以改变这些聚合物的结构，从而微调其关键性能，如疏水性和生物相容性，使这些聚合物在更广泛的应用中具有更大的灵活性[[46]]。表2总结了结构已确定的PHA聚合物及其性能。PHA = 聚3-羟基丁酸酯（poly3-hydroxybutyrate），PHBV = 聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯）（poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBH = 聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基己酸酯）（poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate）。

| 类型 | 链长 | 形态 | 热性能 | 力学性能 | 参考文献 |
|------------|-----------------|-----------------|-----------------|----------------------|
| PHB | 短链（C4） | α/β晶体，球晶，串烧结构 | 高熔点（170–180 °C） | 高强度（30–40 MPa），高硬度，高脆性，断裂伸长率低 | [[43]] |
| PHBV | 中短链（C4–C5） | 半结晶/非结晶（取决于3HV含量） | 一步降解（非自由基随机断裂过程） | 高3HV含量提高柔韧性，但拉伸强度和模量降低 | [[59, 60]] |
| PHBH | 中链（C6–C14） | 随机/嵌段共聚物 | 3HH共聚单体含量增加显著降低Tm | 高3HH含量提高断裂伸长率，但降低强度和模量 | [[61, 62]] |

PHA可以具有不同的晶体形态。1997年，Yoshiharu等人从氯仿-甲醇混合溶液（1/7）中获得了PHA的单晶[[47]]。最常见的晶体形式是球晶。这种结构通常在PHA从熔体中快速冷却或从浓缩溶液中沉淀时形成。这种结晶过程首先通过初级成核形成球晶核心，然后纤维状晶体以恒定速率径向生长[[40]]。此外，结晶温度的升高会导致PHA晶体形态从带状球晶变为非带状球晶[[48]]。文献中还报道了第三种PHA形态——串烧结构，可以通过连续搅拌稀释的聚合物溶液获得。尽管其形成机制尚未完全明了，但据认为与卷曲-拉伸转变机制有关[[49]]。Masahiro及其同事在用氯仿溶液溶解超高分子量PHA制备的超薄薄膜中观察到了串烧结构[[50]]。细菌产生的PHA可以结晶为α型和β型两种形式。PHA最常见的晶体结构是α型，通常通过控制熔融、冷却或溶液结晶获得。β型PHA可以通过改变α型层状晶体之间的自由链或连接链的方向，或通过结构修饰从α型转变为β型。由于其结构，β型具有更好的机械强度，并且由于抑制了二次结晶过程，其性能可以保持稳定数月[[51]]。PHA聚合物的性能受多种因素影响，如极性、几何结构和立体化学。化学和物理性能与聚合物结构密切相关，微小的变化会对整体特性和行为产生深远影响。近年来，PHA的力学和热性能得到了很好的描述，表明它们与传统的石油基塑料（如PET、PP和PE）相当[[52, 53]]。已知PHA在超过170°C的温度下热稳定性较低，且其机械性能受成核密度和结晶速率的强烈影响。因此，通过引入共聚单体单元并形成共聚物材料（如PHBV、P3HB4HB和PHBHHx）可以改善PHA的性能。这样可以在降低强度和硬度的同时提高所得聚合物薄膜的断裂伸长率和韧性[[54]]。PHA聚合物的主要性能还受其链分子量的影响。据报道，当链分子量超过400 kDa时，PHA表现出更好的机械性能，对于热塑性应用，分子量应高于600 kDa[[55, 56]]。Luo等人的研究表明[[57]]，PHBV共聚物的不同性能（如熔点、层状和非晶厚度以及拉伸强度）随晶体分子量的增加而增加。在PHA类型中，PHB是最常见的生物聚酯，其晶体结构已通过X射线研究在定向纤维上得到解析（表2）。纤维图显示链轴上的重复单元长度为0.596 nm，相当于两个反平行链在正交晶胞中的长度[[43]]。基于分子内能量计算的构象分析表明，聚合物链采用左手螺旋构象。PHA通常形成板条状晶体，短轴尺寸约为0.3–2 μm，长轴尺寸约为5–10 μm。这些单层晶体的厚度根据分子量、溶剂和结晶温度等因素介于4到10 nm之间。研究人员发现，某些细菌（如Ralstonia eutropha）在补充葡萄糖和丙酸时不仅能产生羟基丁酸单元，还能产生3-羟基戊酸单元（3HV）[[58]]。由此产生了PHBV共聚物，与PHB相比具有更高的柔韧性（表2）。实际上，通过调整3HB与3HV单体的比例，可以微调聚合物的性能，以生产柔性薄膜或刚性物体[[59, 60]]。PHBV由两种单体合成：3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基戊酸（3HV）。两种单体比例的变化可以显著改变聚合物的力学和热性能。聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基己酸酯）是一种由3-HB和3-羟基己酸（3-HH）单元组成的随机共聚物。3-HH单元的摩尔百分比越高，熔点越低，结晶度降低，储存模量和整体强度下降；而3-HH含量较低的PHBH共聚物则倾向于随时间发生物理老化，导致模量和强度增加，但延展性降低[[61]]。PHBH可以以随机（最常用）和嵌段两种形式存在。纯PHB的熔点约为170°C，而不同3-HH浓度的随机PHBH共聚物可能在较低温度下表现出两个接近的熔点。随着3-HH共聚单体比例的增加，玻璃化转变温度（Tg）降低，熔点（Tm）和最终结晶度显著降低（表2）。PHBH样品在室温下也可能因老化而发生二次结晶，这种现象常被称为冷结晶。此外，PHBH共聚物的热降解温度受3-HH含量的强烈影响：3-HH含量的增加提高了断裂伸长率，但由于3-HH段赋予的更高柔韧性，降低了拉伸强度和模量[[62]]。

体外PHA生物合成：酶、变体和反应平台
生物技术的进步越来越关注减轻传统塑料对环境的影响，从而实现了从可再生碳源工业规模生物合成生物基单体的技术突破。为了开发下一代生物基聚酯，研究不仅需要确保可持续性，还需要通过优化技术性能和改进功能特性来提高竞争力[[63]]。PHA的体外合成已成为传统微生物发酵的有希望的替代方案，旨在克服细胞代谢、产物回收和过程控制的限制。在活细胞外重建PHA生物合成途径提供了设计完全可控、模块化且无细胞的系统的机会，这些系统能够实现更高的产量和定制的聚合物组成。PHA的生产成本仍显著高于传统石化塑料。因此，开发更高效且经济可行的生产过程至关重要。无细胞代谢工程（CFME）已经在优化多种生物合成途径方面显示出巨大潜力，表明类似的无细胞系统可以战略性地用于提高PHA的生物合成效率和产量[[64]]。体外酶催化的聚酯合成是一种新兴方法，在过去十年中得到了积极研究，它在效率、可持续性和反应条件方面提供了多种优势。酶促聚合是一种体外过程，通过非生物合成途径进行，并由分离的酶催化。在直接酶促聚合中，纯化的PHA合成酶（PhaC）催化活化底物羟基酰辅酶A（R）-HA-CoA聚合为PHA。根据其主要序列、底物特异性和亚基组成，PhaC酶被分为四类[[65]]。I类、III类和IV类产生SCL-PHA，分别以丙酸、丁酸、戊酸和己酸为前体；而II类PhaC则以烷烃（C6–C14）前体为基础合成MCL-PHA[[66]]。I类PhaC由两个相同的PhaC亚基组成，优先使用SCL羟基酰辅酶A底物（如3-羟基丁酰辅酶A（C3–C5）来合成PHA及其共聚物。来自Cupriavidus necator（前身为Ralstonia eutropha）的PhaC_Re/Cn、Chromobacterium sp. USM2—PhaC_Cs和Aeromonas caviae—PhaC_Ac属于这一类[[68, 69]]。这些酶的活性在体外进行了测试，并评估了它们对3HB-CoA聚合的特异性活性。就特异性活性而言，PhaC_Cs的催化速率比PhaC_Cn高约5倍（在可比测试中）[[70]]。关于底物特异性，PhaC_Ac值得注意，因为工程变体增加了共聚物中C6单体（3HHx）的比例[[71]]。还研究了辅助蛋白对PhaC_Ac和PhaC_Re的PHA合成酶活性的调节作用。在phasins（PhaP）存在下，PhaC_Ac的活性显著增强，这些phasins调节酶活性和聚合物颗粒的形成。相比之下，PhaC_Re没有表现出激活效应。phasins与某些PhaC酶特异性相互作用，改善了聚合物链的伸长和释放，在PHA生物合成中起关键的调节作用[[69]]（图2）。

聚羟基烷酸酯（PHA）合成酶的分类。不同类别的PHA合成酶及其相关底物和形成最终聚合物的单体单元的碳链长度的示意图[[66-69, 72, 73, 75, 80, 81]]。3HV-CoA = 3-羟基戊酰辅酶A，3HB-CoA = 3-羟基丁酰辅酶A，3HHx-CoA = 3-羟基己酰辅酶A，kDa = 千道尔顿；mcl-HA-CoA = 中链长度羟基酰辅酶A，mcl-PHA = 中链长度聚羟基烷酸酯；PHB = 聚(3-羟基丁酸酯）；PHB-co-HHx = 聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基己酸酯）；PHBV = 聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)；scl-HA-CoA = 短链长度羟基酰辅酶A。PhaC、PhaE和PhaR表示不同的合成酶亚基[[66, 71, 73, 80, 81]]。II类PhaC酶专门用于生产MCL-PHA，通常含有6–14个碳原子的单体（例如3-HH、3-羟基辛酸和3-羟基癸酸）。由于II类酶主要存在于假单胞菌中，因此最常在体外研究的属于这一类的PhaC来自Pseudomonas putida（GPo1）PhaC1/PhaC2和Pseudomonas aeruginosa—PhaC1/PhaC2[[72-74]]。Pseudomonas putida PhaC1是主要的活性酶，在体外Vmax约为40 μmol·min?1，KM约为125 μmol·min?1（针对(R)-3-羟基辛酰辅酶A）；PhaC2的转化率较低（约2–3 μmol·min?1），但亲和力较高[[66, 74]]。这些酶强烈偏好C6–C10底物，对C8–C10底物（3HO, 3HD-CoA）的活性最高。纯化的可溶性形式会迅速失去活性，而颗粒结合的酶仍具有催化能力。Pseudomonas aeruginosa PhaC1/2显示出类似的MCL特异性，但对短链3HB-CoA几乎没有活性[[73]]。这些酶的体外活性主要在粗提物中检测到，证实了其对颗粒环境的依赖性。这两种系统都表现出II类PhaC典型的滞后阶段，需要引发和CoA循环利用。在这两种情况下，所得聚合物都是非晶态和弹性的，不同于I类酶产生的结晶PHA。它们共同定义了体外研究II类PHA合成酶的生化标准（图2）。III类PHA合成酶是由PhaC（催化亚基）和PhaE（结构亚基）组成的异二聚体酶[[66]]。它们主要存在于光合和嗜盐细菌中，如Allochromatium vinosum、Thiocapsa pfennigii、Synechocystis sp. PCC 6803和Haloferax mediterranei。与主要合成SCL-PHA或PHBV的II类酶不同，I类酶使用(R)-3HB-CoA和(R)-3HV-CoA作为底物。在Allochromatium vinosum中表征最好的体外模型是PhaEC[[75]]。如果省略PhaE，活性完全丧失，证实了两个亚基的严格依赖性。Thiocapsa pfennigii、Synechocystis和Haloferax mediterranei酶在体外表现出相似的行为[[76-78]]。因此，III类合成酶定义了一种独特的PHA生物合成机制，结合了催化和结构调节[[79]]（图2）。最后，IV类PhaC酶是由PhaC（催化亚基）和PhaR（调节/辅助亚基）组成的异二聚体酶。它们主要存在于革兰氏阳性杆菌中，如Bacillus megaterium和Bacillus cereus[[80, 81]]。该酶催化SCL 3-羟基酰辅酶（C3–C5）的聚合，生成PHA或PHBV聚合物。IV类酶作为αβ异二聚体起作用，不同于I类单体或II类同源二聚体。他们的催化机制涉及(R)-3-羟基酰基-CoA硫酯的顺序酯交换反应。在IV类PHA合成酶中，PhaR是一个不可或缺的催化伙伴，而不是调节因子[[82]]。它负责折叠、稳定并固定PhaC催化核心，形成一个能够将(R)-3HB-CoA聚合为PHA的功能性异二聚体。没有PhaR，体外实验中检测不到任何活性，这证实了PhaR对于IV类PhaC的功能是必不可少的（图2）。尽管概念上很简单，但体外系统受到CoA激活底物的高成本和不稳定性的限制，这限制了其可扩展性。工程化的PhaC是用于在无细胞（体外）系统中创建定制PHA聚合物的关键生物催化剂，克服了天然微生物宿主的代谢限制和底物限制。所有PhaC酶的主要功能元件是一个保守的α/β-水解酶结构域，其中包含催化三联体，通常是半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）和组氨酸（His），这些通常嵌入在一个特征性的PhaC框序列([GS]-X-C-X-[GA]-G)中[[83]]。催化半胱氨酸残基作为亲核试剂，与羟基酰基-CoA单体形成共价硫酯中间体。因此，工程化新的PhaC变体对于推进PHA技术至关重要。这样的变体可以精确控制单体组成，例如调整3HB与3HV的比例，或者引入非天然单体（如乳酸（LA）来调节聚合物的热性能、机械性能和降解性能。此外，工程化的PhaC酶对于生产高级聚合物结构也是必不可少的，包括定义明确的嵌段共聚物和高选择性的随机共聚物，这些是天然酶无法实现的。工程化还可以专注于改善酶的固有性质，如提高其催化效率（kcat）和增强热稳定性，以实现稳健的体外合成。最后，变体使研究人员能够控制链终止，从而精确调整最终聚合物的分子量和多分散性。工程化的PhaC变体展示了PHA合成酶在体外生物聚合物合成方面日益提高的精确度（表3）。PhaC (Ac) NSDG突变体（N149S, D171G来自Aeromonas caviae）显著增强了3HHx的掺入，扩大了单体多样性，并使得形成更灵活的共聚物成为可能[[84]]。乳酸聚合酶（LPE），如来自Pseudomonas sp. 61–3的PhaC1 (Ps6-19)，催化乳酸-CoA的体外聚合，促进了PLA及相关LA共聚物的酶促合成[[85]]。序列调控型PhaC (AR)来自Allochromatium vinosum和Ralstonia eutropha，可以对聚合物微观结构进行精确控制，从而合成具有明确序列和段长的嵌段共聚物，如P(3HB)-co-P(3HV)[[86]]。最后，来自Pseudomonas sp. SG4502的热稳定PhaC1 (SG) (STQK)变体引入了一个改良的STQK环，在高温体外条件下赋予了稳定性和持续的催化活性[[87]]。这些工程化酶共同提供了一个分子工具包，可以精确调节聚合动力学、单体组成和链长，有效地将PHA合成从一个自然代谢过程转变为一个可编程的酶学平台，用于可持续的无细胞生物聚合物生产。表3. 工程化PhaC变体的概述，包括具体突变、来源微生物和体外功能。3HHx = 3-羟基己酸酯，LA = 乳酸，LPE = 乳酸聚合酶，P(3HV) = 聚(3-羟基戊酸酯)，P(3HB-co-3HHx) = 聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯)，P(LA-co-3HB) = 聚(乳酸-co-3-羟基丁酸酯)，PHA = 聚羟基烷酸酯，PhaC = PHA合成酶，PLA = 聚乳酸。PhaC变体名称 突变和来源 主要体外功能 参考文献 PhaC Ac NSDG N149S, D171G (A. caviae) 显著增加了P(3HB-co-3HHx)共聚物中3-羟基己酸酯（3HHx）的比例 [[84]] PhaC1 Ps6–19 (LPE) 进化/多重突变（Pseudomonas sp. 61–3） 高度利用的乳酸聚合酶（LPE），能够生物合成聚乳酸（PLA）或LA共聚物（P(LA-co-3HB） [[85]] PhaC AR 多重突变（A. vinosum，III类） 通过控制单体插入来工程化序列调控，能够合成定义明确的PHA结构，如嵌段共聚物（例如P(3HB)–co–P(3HV) [[86]] PhaC1 (SG) (STQK) S324T, Q480K (Pseudomonas sp. SG4502) 增强了热稳定性和乳酸聚合活性，非常适合高温下的持续体外合成 [[87]] CFME平台取得了重大进展。这些系统在一个反应混合物中整合了多达14种酶，包括能量和辅因子再生模块（例如NADPH回收），使得像葡萄糖或麦芽糊精这样的低成本底物可以直接转化为PHA，而无需外部ATP补充。这种“一锅法”策略最近展示了超过90%的理论产率，标志着向工业可行性迈出的重要一步[[88]]。同时，提出了混合化学-酶学系统，将羟基酸的化学活化与PhaC的酶促聚合相结合，提供了底物选择的灵活性，并促进了共聚物（如P(3HB-co-3HV）的合成。其他创新包括将酶固定在固体支持物上以提高稳定性和可重复使用性，使用合成或电化学再生的辅因子来降低运营成本，以及通过蛋白质工程或合成化学设计的人工PhaC模拟[[64]]。由于从细胞中提取PHA通常需要破坏细胞，这既耗时又依赖于苛刻的化学处理，并且需要重新培养新的细菌细胞以进行后续生产循环，因此另一个有前景的方向是使用酶表面展示系统，这些系统在固体或生物表面上空间组织催化级联反应。在这种方法中，如PhaA、PhaB和PhaC等酶通过工程化的连接子或锚定域固定在载体基质、蛋白质支架或微生物细胞表面上。通过将连续的酶限制在纳米级范围内，这些组装促进了底物通道化，最小化了扩散损失，并显著提高了多步骤途径的催化效率。表面展示可以使用无细胞支架蛋白（例如SpyTag/SpyCatcher系统）或通过半细胞系统中的细菌外膜锚定来实现。在PHA合成的背景下，将PhaC与其上游酶共展示可以加速聚合物链的延长并提高单体转化率。当与CFME或固定化酶技术结合时，表面展示提供了一种强大的途径，用于构建紧凑、可重复使用且空间有序的生物催化系统，弥合了自由溶液酶反应和结构化生物反应器之间的差距[[89]]。PHA合成体外方法的不断发展正在从根本上重塑生物塑料的生产方式。通过超越依赖细胞的发酵，研究人员正在构建模块化、可编程的酶学系统，能够精确控制从单体选择到链结构的每个聚合物形成阶段。这一转变标志着生物聚合物工程的新时代的开始，在这个新时代中，效率和环境责任可以在一个平台上共存。最终，这些进步为生产经济可行且环境可持续的定制设计生物降解材料打开了大门。尽管有这些有前景的解决方案，但由于技术、经济和基础设施的限制，生物聚合物的商业可用性仍然有限。实际上，生产和纯化生物基单体的技术尚未完全成熟。许多生物衍生构建块是通过发酵或复杂的生物质转化过程获得的，这往往导致产量低和下游纯化步骤具有挑战性。达到聚合物级纯度需要能源密集和成本高昂的分离技术，使得大规模实施变得困难。用于生产生物基单体的原材料经常与食品和饲料资源竞争。虽然PHA提供了传统塑料的可持续替代品，但其生产面临影响经济可行性的挑战。许多当前的过程依赖于第一代生物质，如糖、玉米或植物油。这引发了关于土地使用、食品安全和可持续性的担忧，特别是当农业资源被分配给工业用途而不是食品生产时。此外，纯化酶及其用于PHA体外合成的底物的高生产成本可能限制了这些方法的大规模采用。PHA的商业化受到其相对于石油基塑料显著更高的生产成本的制约[[90]]。聚丙烯和聚乙烯的价格约为每公斤1.25–2.53美元，而PHA的价格据报道比主要石油基聚合物高出16倍[[91, 92]]。生物基单体及其随后聚合为生物基聚酯的总体生产成本相对于化石基产品仍然较高，这加剧了这一经济差距。研究正朝着降低成本策略的方向发展，以增加PHA的竞争力，包括将之前描述的体外解决方案引入现有过程，以提高其生产力并允许这些高成本技术的规模化，并改善其可持续性[[93]]。还需要考虑的是，PHA的广泛采用将强烈依赖于可降解塑料的国际标准的制定，以及废物管理基础设施的改进。明确的全球认证框架对于确保材料性能的一致性、避免误导性的环境声明以及在消费者、制造商和监管机构之间建立信任至关重要。如果没有适当的处置和处理途径，即使是可降解材料也可能无法实现其预期的可持续性优势[[90]]。考虑到这一点，将PHA合成与废物增值策略相结合可以增强经济可行性和环境性能。尽管在微生物和酶学PHA生产方面取得了显著进展，但这些技术向工业规模过程的转化仍然受到特定技术和经济限制的制约。特别是，CoA激活底物的高成本、PHA合成酶在无细胞系统中的有限长期稳定性和周转率，以及缺乏可扩展的多酶级联反应器概念是阻碍工业实施的主要因素。此外，下游处理和聚合物回收仍然是重要的成本驱动因素，即使对于先进的酶学或混合生产平台也是如此。解决这些挑战将需要在酶工程、辅因子再生、过程强化和反应器设计等领域进行综合改进，而不仅仅是单个酶层面的渐进式改进。酶学生物塑料生产的未来将取决于合成生物学、代谢工程和酶设计的有效整合，以克服当前在酶稳定性、底物可用性和过程可扩展性方面的限制。这些学科的融合促进了新型生物合成途径的构建和定制酶的开发，从而扩展了PHA的多样性并提高了过程产量。诸如无细胞多酶系统和酶表面展示等创新已被证明有助于克服与细胞内过程相关的限制，从而提高催化效率、稳定性和对聚合物组成的控制[[94]]。此外，强调提高底物灵活性的重要性至关重要，以确保可持续生产的连续性。使用工程化微生物转化替代原料（包括但不限于CO2、CH4和木质纤维素生物质）已被证明是解决目前依赖食品资源和高生产成本问题的可行方案。结合连续和高细胞密度发酵的进步，以及极端微生物的利用，这些策略促进了稳健、可扩展且资源消耗较少的生物过程的发展[[95, 96]]。尽管有这些创新，经济可行性仍然是一个重大挑战。目前生产PHA的成本超过了石化塑料，主要是由于原料成本和回收方法的复杂性。因此，提高菌株的稳健性、优化生物反应器效率和简化下游处理对于实现工业竞争力至关重要。可持续性评估，包括生命周期分析（LCAs），对于验证新兴技术的环境效益是必要的，特别是在碳足迹和可降解性方面[[97]]。最后，必须强调政策和监管支持在促进市场采用方面的关键作用。这包括提供财政激励、建立明确的可降解性标准以及实施有利于生物基替代品的政策。公共部门和私营部门之间的合作进一步促进了规模化和商业化的加速[[98]]。只有当生物催化剂的性能得到提高、辅因子管理具有成本效益以及过程设计可扩展时，酶学PHA的生产才能在经济上具有竞争力。科学创新与经济和政策框架的整合对于将酶学生物塑料从利基材料发展为循环经济的基础要素至关重要。致谢 本研究由意大利大学和研究部（MUR）在下一代欧盟行动框架下资助。项目名称：“发现和工程化改进的生物催化剂用于合成可降解塑料共聚物（BioCat4BioPol）”，资助编号：“CUP B53D23015130001”。作者撰写了原始手稿，并在后期使用ChatGPT（OpenAI）来提高可读性、语言和清晰度。作者仔细审查、编辑并验证了所有AI辅助的修改，并对出版物的内容负全责。开放获取出版由维罗纳大学（Universita degli Studi di Verona）作为Wiley - CRUI-CARE协议的一部分提供。利益冲突 作者声明没有利益冲突。作者贡献

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