Mg2+和CO2在己酸生物合成途径中的协同效应

《Process Safety and Environmental Protection》：Synergistic effects of Mg2+ and CO 2 in hexanoic acid biosynthesis pathways

己酸合成中添加51mmol/L MgCO3可使产量提升41%，但浓度增至68mmol/L时因高CO2导致乙醇过度氧化。MgCO3通过释放Mg2?促进电子传递并抑制ALDH基因表达，同时增强脂肪酸合成与逆β氧化途径活性。微生物群落以Clostridium、Massilibacterium为主。

　　

纪晓峰|王芳|沈英蒙|刘龙龙|杨森|朱继英

山东理工大学农业工程与食品科学学院，淄博255000，中国

摘要

在厌氧发酵系统中添加碳酸镁（MgCO₃）可以为延长碳链的微生物提供无机碳，并释放Mg²⁺以促进它们之间的电子转移。本研究探讨了添加MgCO₃对己酸生产的影响及其机制。结果表明，当MgCO₃的浓度为51 mmol/L时，己酸产量增加了41%。在MgCO₃浓度为68 mmol/L时，底物的总电子回收效率达到了90%。负责己酸合成的主要微生物群落包括Clostridium、Massilibacterium、Comamonas和Acinetobacter。宏基因组分析显示，添加51 mmol/L的MgCO₃会下调编码醛脱氢酶（ALDH）的基因相对丰度，导致乙酸产量减少了21%。然而，当MgCO₃浓度进一步增加到68 mmol/L时，系统中过高的初始CO₂浓度促进了乙醇的过度氧化。此外，添加MgCO₃后，脂肪酸生物合成（FAB）和反向β-氧化（RBO）途径的活性得到了增强。这一发现揭示了MgCO₃影响碳链延长的潜在机制，并确定了MgCO₃的最佳浓度。

引言

目前，己酸的生产可以通过化学合成和微生物发酵获得。传统的从化石燃料化学合成己酸需要大量的能源，并会造成环境污染（Akindolie等人，2023年）。微生物发酵是一种环保且经济可行的方法，可以将可再生有机资源转化为己酸。用于合成己酸的厌氧发酵是由厌氧细菌（如Clostridium kluyveri）催化的生物过程。乙醇已被确定为生产中链脂肪酸（MCFAs）的最有效还原底物（Liu等人，2017年）。通过多种微生物的协同作用，可以利用乙醇和短链脂肪酸（SCFAs）作为底物，通过碳链延长（CCE）反应生产己酸。己酸是一种由六个碳原子组成的直链羧酸，具有广泛的工业应用，包括作为绿色抗生素和生物燃料（Agler等人，2011年）。

CCE反应在厌氧发酵中起着关键作用，这一过程依赖于微生物之间的电子转移（Wu等人，2024年）。厌氧发酵系统中电子转移效率低下是限制己酸产量的重要因素。文献中广泛强调了产酸细菌之间种间电子转移的重要性。相关研究表明，通过调节反应系统内的电子转移可以改善发酵性能。向发酵系统中添加导电材料（如磁性生物炭）已被证明可以通过作为微生物间的电子传递媒介来增强电子转移（Yuan等人，2023年）。此外，Sha等人（2023年）发现，添加镍-石墨复合材料显著影响了微生物群落的结构，使电活性Bacteroidetes成为优势菌种。研究表明，Mg²⁺对厌氧发酵过程中的细胞生长和底物利用有积极作用（Zhao等人，2017年）。Zhao等人（2017年）证明，当Mg²⁺浓度达到10.5 mmol/L时，细胞生物量和挥发性脂肪酸（VFAs）的产量均有所增加。此外，Akindolie等人（2023年）发现，添加Mg²⁺可以缩短滞后时间并提高H₂产量，并促进厌氧发酵中氢气的快速释放。Ji等人（2024a）的结果表明，MgCO₃促进了系统中的电子转移并增强了己酸的产量。

乙醇主要用作反向β-氧化（RBO）过程中CCE反应的电子供体（ED）（Coma等人，2016年；Steinbusch等人，2011年）。在混合细菌发酵系统中，不同微生物会竞争底物和中间产物，这可能会引发不利于CCE反应的生化过程。在CCE过程中，理论上每六个参与碳链延长的乙醇分子中会有一个被氧化成乙酸（公式1）（Roghair等人，2018b）。然而，在实际的混合厌氧发酵系统中，通常有超过六分之一的乙醇被氧化成乙酸（Grootscholten等人，2014年）。这种现象称为过度乙醇氧化（EEO）（公式2）（Spirito等人，2018年），它是CCE过程的一个主要竞争分支。因此，电子供体的转化效率低下是己酸合成中的一个瓶颈。了解乙醇转化的机制对于建立高效的碳链延长过程至关重要。此外，抑制这些竞争过程也很重要，这可以通过添加化学催化剂或生物活性剂来实现（Roghair等人，2018a）。

RBO途径：5CH₃(CH₂)_nCOOH + 6CH₃CH₂OH → 5CH₃(CH₂)_n+2COOH + CH₃COOH + 4H₂O + 2H₂ 过度乙醇氧化（EEO）：C₂H₆O + H₂O → CH₃COOH + 2H₂

EEO会将更多的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）转化为乙酸，从而导致后续CCE过程中乙酰-CoA的耗尽，从而抑制己酸的合成（Roghair等人，2018a）。EEO的一个主要原因是过高的CO₂分压。根据Ji等人（2024a）的研究，添加无机碳酸盐不仅促进了延长碳链的微生物的繁殖，还影响了厌氧发酵系统中的EEO程度。此外，Ji等人（2024a）还表明，过高的CO₂浓度会促进产乙酸细菌的增殖。因此，维持发酵系统中适当的顶空CO₂浓度对于调节己酸的合成至关重要。最近的研究表明，金属离子也对乙酸的产量有显著影响。Zhao等人（2017年）的研究显示，随着MgCl₂浓度的增加，乙酸产量逐渐下降。Ribeiro-Filho等人（2021年）证明，添加K⁺、Cu²⁺和Mg²⁺离子分别导致乙酸产量减少了34%、38%和58%。同样，Ji等人（2024a）报告称，添加MgCO₃使乙酸浓度降低了51%。在发酵液中，MgCO₃不仅释放出Mg²⁺，还会释放CO₂。因此，需要进一步研究MgCO₃浓度对己酸产量的影响及其机制。

本研究旨在探索合适的MgCO₃浓度，并分析其在以乙醇为电子供体的CCE过程中的作用。研究了不同MgCO₃浓度下的己酸产量、产物分布和电化学性质，并进行了比较。此外，还利用宏基因组分析来区分功能性微生物群落并分析参与CCE途径的关键酶的丰度。期望这项研究能为提高己酸产量提供新的见解。

部分内容

发酵培养基、接种物和底物

接种物来源于一个在中温下运行的厌氧消化器，在4°C下保存，并在使用前在37°C下孵育6天。在孵育过程中，每千克接种物分三次（每隔两天）添加3 g/kg的牛肉膏、10 g/kg的蛋白胨、5 g/kg的NaCl和1 L/kg的水。发酵培养基包含酵母提取物、微量元素、维生素和其他必需成分。制备方法基于Wu描述的方法

厌氧发酵过程中的产物生成

本研究使用乙醇作为电子供体（ED），丁酸作为电子受体（EA），在微生物存在下进行CCE反应。如图1所示，除了目标产物己酸外，主要的发酵产物是乙酸。乙酸是作为乙醇氧化的副产物产生的。这一过程可以为发酵系统提供能量和ATP，但也会消耗电子供体乙醇。由于己酸的产生延迟，丁酸的产量受到影响

结论

在以乙醇和丁酸为底物的厌氧发酵系统中，己酸产量随MgCO₃浓度的增加而呈抛物线趋势，表明优化MgCO₃剂量可以作为一种简单有效的方法来提高MCFAs的产量。添加51 mmol/L的MgCO₃提高了底物的转化率，实现了最高的己酸产量。然而，随着MgCO₃浓度的增加，乙醇的氧化也加剧了。

未引用的参考文献

(Agler等人，2014年；Gumaelius等人，2001年；Seedorf等人，2007年)

CRediT作者贡献声明

沈英蒙：研究工作。 王芳：研究工作。 纪晓峰：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，数据管理，概念构思。 朱继英：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，资金筹集。 杨森：监督。 刘龙龙：监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国山东省自然科学基金（ZR2024ME187）的支持。