肿瘤血管的规范化处理增强了胶质母细胞瘤的化疗免疫治疗效果

《Sustainable Materials and Technologies》：Normalization of tumor blood vessels boosted the chemoimmunotherapy of glioblastoma

本研究发现超小铜硒纳米颗粒（CS NPs）通过Fenton-like反应缓解胶质母细胞瘤缺氧，降低HIF-1α和VEGF-A表达，促进血管正常化，增强化疗和免疫治疗效果。

　　

郑鹏顾|刘华龙|姜志林|张浩|王婷婷|张卫国|李振

中国江苏省苏州市苏州医学院放射医学与防护学院放射医学与防护国家重点实验室，江苏高等教育机构放射医学协同创新中心，邮编215123

摘要

实体肿瘤的特点是其异常的血管结构，这导致了肿瘤独特微环境的形成，并限制了化疗和免疫疗法的效果。因此，调节血管生成和重编程肿瘤血管对肿瘤治疗至关重要。胶质母细胞瘤的血管密度更高，血管结构更为紊乱。然而，由于对抗血管生成药物的耐药性，传统的抗血管生成策略在胶质母细胞瘤的治疗中效果不佳。本文发现，超小Cu_2-xSe纳米颗粒（CS NPs）能够使胶质母细胞瘤的血管结构恢复正常，增加周细胞覆盖率并改善血液灌注，从而提高肿瘤药物的递送效果和化疗-免疫疗法的效果。CS NPs出色的Fenton样反应性能通过缓解肿瘤缺氧，减少了HIF-1α和VEGFA的表达，从而有助于血管结构的正常化。胶质母细胞瘤血管的正常化增加了药物和免疫细胞向肿瘤组织的浸润，显著抑制了肿瘤的生长。我们的研究为利用多功能纳米颗粒调节肿瘤血管、提高化疗和免疫疗法的效果提供了新的见解。

引言

胶质母细胞瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤[1]。它具有高度侵袭性，进展迅速且治疗效果差。根据世界卫生组织的统计，胶质母细胞瘤患者的 median survival period（中位生存期）不到15个月[2]。尽管目前采用手术、化疗、放疗和联合疗法等方法治疗胶质母细胞瘤，但由于预后较差，术后辅助放疗和化疗后的患者中位生存时间仅为14.6个月[3]。胶质母细胞瘤的不良预后可归因于其独特的位置和异常的血管结构，这些因素导致常规化疗和免疫疗法的效果大大降低，因为药物递送不足且免疫细胞浸润较少。

众所周知，血管生成对实体肿瘤的生长和转移至关重要。血管生成需要反应性毛细血管的存在，这些毛细血管体积小且结构异常。血管的内层由内皮细胞（ECs）及其紧密连接的连接处组成[4]。外层由周细胞[5] [6]包围和支持。周细胞和基底膜支持血管结构的发育和维持，并调节血流和血管通透性[7] [8]。特定的生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）、血管生成素-2（Ang-2）和血小板衍生生长因子（PDGF），调节内皮细胞的激活、分裂、增殖和迁移，这些都是肿瘤血管生成的关键步骤[9]。内皮细胞主要来源于内皮前体细胞[10]，肿瘤细胞分泌VEGF以支持其生长，提供氧气和营养。

除了VEGF之外，其他几种介质，如PDGF[11]、成纤维细胞生长因子（FGF）[12]、Ang-2[13]和趋化因子[14]也参与肿瘤血管生成。在胶质母细胞瘤中，内皮细胞和巨噬细胞[15]也可以通过分泌血管生成因子（如VEGFA、Ang-2、Tie-2和TGF-α/β）[16] [17]促进血管生成。这些血管生成因子可以刺激内皮细胞的增殖和迁移，导致肿瘤组织中的血管密度显著增加。新生成的血管通常表现出扭曲、异常的分支特征，这是由于内皮细胞连接不足和周细胞覆盖率低造成的，从而导致血流减少[18]、渗漏和不稳定。肿瘤内血流的减少加剧了缺氧[8]。不稳定的血管容易破裂和出血。此外，肿瘤血管通常具有高通透性，导致周围组织水肿和颅内压升高。

如前所述，血管生成在肿瘤细胞的生长和浸润中起着重要作用，仍然是肿瘤治疗的挑战，尤其是对于胶质母细胞瘤。因此，使胶质母细胞瘤血管恢复正常，以恢复血管形态、结构和功能[14]已成为一种潜在的治疗策略，因为它可以有效抑制血管生成，减少血管通透性，阻断营养供应，从而抑制肿瘤生长和转移。此外，由于血管正常化带来的改善的血管灌注功能可以增强抗肿瘤药物的递送和灌注，从而提高化疗的效果。总之，血管正常化在肿瘤的综合治疗中具有重要意义。

为了实现血管正常化，针对VEGF/VEGFR-2的抗血管生成药物已被广泛用于肿瘤治疗。尽管它们可以在初始阶段诱导血管正常化，但过度抑制也会导致肿瘤缺氧，进一步刺激肿瘤细胞释放其他血管生成因子，加剧血管网络的紊乱。抗血管生成药物可以通过多种途径诱导肿瘤血管正常化，例如抑制Ang-2/Tie-2通路[13] [19] [20]，通过PDGF-B/PDGFR通路增加周细胞的覆盖率[21]，增加VE-cadherin的表达[22] [23] [24]以增强内皮细胞之间的紧密连接，调节肿瘤缺氧[25] [26]，以及抑制TGF-β重塑CAFs/ECM[17] [27]。然而，不同肿瘤对抗血管生成药物的反应不同。此外，一些患者对抗血管生成药物产生耐受性，降低了治疗效果并影响了长期疗效。肿瘤细胞的基因突变也会影响血管正常化疗法的效果。更重要的是，传统的抗血管生成药物可能会引起一些副作用，如血管破裂、出血和血栓形成。总之，传统的抗血管生成药物在正常化肿瘤血管方面存在固有的缺点和局限性，需要解决。

另一方面，纳米抗血管生成药物近年来因其在肿瘤治疗中的显著优势而受到广泛关注。它们可以通过表面修饰或功能化精确作用于肿瘤血管，从而增强其靶向能力。此外，它们还可以作为载体，共同促进肿瘤血管的正常化。例如，负载有靶向VEGA-siRNA的脂质磷酸钙纳米颗粒（LCPNP）[28]、负载有Ang-2-siRNA的壳聚糖纳米颗粒（CMNP）[29]、负载有转化生长因子-β（TGF-β）受体抑制剂（SB431542）的生物响应纳米颗粒在肿瘤血管正常化方面表现出优异的效果[30]。与传统抗血管生成药物相比，纳米抗血管生成药物在正常化肿瘤血管方面具有显著优势，包括增强的靶向能力、改善的药物递送、可控释放、多功能性和降低的全身毒性。这些特点突显了它们在肿瘤治疗中的巨大潜力。

除了作为载体外，一些纳米颗粒本身也可以调节血管生成因子以促进血管正常化，例如基于铜的纳米颗粒可以通过其Fenton样性质催化H₂O₂产生O₂，缓解肿瘤缺氧，进而诱导血管正常化[31]。Au纳米颗粒可以通过减少PDGFR-β-mRNA的表达和周细胞从血管壁上的脱落来显著抑制肿瘤细胞的增殖[32]。叶酸修饰的Au纳米颗粒可以增加VE-cadherin蛋白的表达，增强血管内皮的紧密连接[33]。Ag纳米颗粒可以通过减少HIF-1α的表达来抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成[34]。因此，构建具有正常化肿瘤血管能力的纳米颗粒是提高联合肿瘤治疗效果的潜在策略。

在这方面，超小铜硒化物颗粒（CS NPs）由于其多功能性可能是一种优秀的抗血管生成剂。它们具有出色的Fenton样反应性能，可以有效缓解肿瘤缺氧[35]。此外，当它们与HIF-1α抑制剂结合使用时，CS NPs可以减少血管中CD31和VEGF的表达，表明其在血管正常化方面的潜力[36] [37]。

在本文中，我们报告称CS NPs可以诱导肿瘤血管正常化，显著提高胶质母细胞瘤的化疗和免疫疗法效果（图1）。它们可以通过其Fenton样性质与内源性H₂O₂反应生成O₂，缓解肿瘤微环境的缺氧，并减少肿瘤中HIF-1α和VEGFA的表达。肿瘤血管的正常化增加了化学药物的浓度和CD3⁺/CD8⁺ T细胞的浸润，从而提高了胶质母细胞瘤的化疗-免疫疗法效果。

材料

CuCl_2·2H₂O（≥ 99%）购自Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD。硒（Se）粉末（100目，≥ 99.5%）、硼氢化钠（NaBH₄，99%）和巯基琥珀酸（MSA，99%）购自Sigma-Aldrich。二巯基聚乙二醇（HS-PEG-SH，MW = 5000）购自J&K Scientific LTD。实验中使用Milli-Q水（> 18 MΩ cm）。所有试剂均未经纯化直接使用。

超小CS NPs的合成

CS NPs按照先前报道的方法[38] [39]制备。

CS NPs使胶质母细胞瘤的血管正常化

PEG化的CS NPs按照先前报道的方案[35] [38] [39]进行合成、修饰和表征。制备好的CS NPs的形态和大小通过透射电子显微镜（TEM）进行表征。如图1a和图S1a所示，纳米颗粒呈球形，平均尺寸为3.9 ± 1.0 nm。在代表性高分辨率图像中清晰观察到间距为0.2 nm的明显晶体晶格条纹。

结论

总之，超小CS NPs在胶质母细胞瘤中具有出色的血管正常化能力，可降低血管密度，增加周细胞覆盖率，改善血管灌注，并恢复血管结构和功能。它们不仅可以增加药物和α-PD-L1向肿瘤组织的浸润，还可以提高

作者贡献声明

郑鹏顾：撰写 – 原始稿，项目管理，研究。 刘华龙：撰写 – 原始稿，项目管理，研究。 姜志林：方法学，研究，正式分析。 张浩：方法学，研究，正式分析。 王婷婷：撰写 – 审稿与编辑，监督，方法学，正式分析。 张卫国：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。 李振：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金提供。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢以下机构的支持：国家自然科学基金（92374113，82472128），国家重点研发计划（2022YFA1104300），江苏省高等教育机构自然科学基金重大基础研究项目（22KJA310004），苏州应用基础研究（医学与健康）青年项目（SYW2024183），苏州基础研究项目（编号SJC2023001），跨学科基础前沿创新