生物活性酰肼衍生物的发现及其作为农用杀菌剂候选物的评价

《Advanced Agrochem》：Discovery of Bioactive Hydrazide Derivatives and Their Evaluation as Agricultural Fungicide Candidates

　　

随着病原菌抗性问题的日益严峻和全球杀菌剂市场的持续扩大，发现新型杀菌剂先导结构变得愈发紧迫。受前期研究发现酰肼基团是一种有前景的杀菌药效团的启发，研究人员设计并合成了三个新型系列的酰肼衍生物，以进一步探究结构修饰对杀菌活性和生态安全性的影响。大多数化合物表现出优异且广谱的杀菌活性。其中，化合物B5在50 μg/mL浓度下对六种植物病原真菌达到了100%的抑制率，其半数有效浓度（EC50）、杀菌谱和活体预防效果与戊唑醇（tebuconazole）相当。作用机制研究表明，化合物B5导致立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌丝萎缩、脂滴消失和总脂含量降低。定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析表明，糖酵解/糖异生和脂质代谢相关通路中的关键基因表达下调，同时甾醇生物合成通路基因表达上调。生态毒理学评估表明，化合物B5对斑马鱼具有高毒性，在10 μg/mL浓度下2天内死亡率达100%。同时，它在碱性环境中快速降解，2天内浓度从70 μg/mL降至5.5 μg/mL，这表明其结构有待进一步优化。这些发现将为开发基于酰肼结构的新型杀菌剂候选物提供重要的理论指导。

一、研究背景、问题与研究目的

植物真菌病害是威胁全球粮食安全和农业生产力的主要因素之一，化学杀菌剂是主要的防治手段。然而，其长期、大量使用导致了病原菌抗性、药效降低和生态环境安全等严峻挑战。例如，甲氧基丙烯酸酯类（QoI）、琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）和脱甲基化抑制剂（DMI）等主要作用机制的杀菌剂已出现广泛的抗性。此外，传统杀菌剂对非靶标生物的毒性以及对土壤和水资源的污染，也影响了生物多样性并带来潜在的人类健康风险。因此，开发具有新颖作用机制、高效且低风险的新型杀菌剂候选物，对促进农业可持续发展至关重要。

酰肼基团（hydrazide moiety）因其广泛的生物活性已被识别为一个关键的杀菌药效团。本研究团队的前期工作发现，基于酰胺结构的先导化合物I-1杀菌谱较窄。通过将酰胺替换为酰肼基团，成功发现了具有优异广谱杀菌活性的酰肼先导化合物II-1，并进一步通过延伸酰肼桥和引入取代基，开发了化合物III-1和IV。前期构效关系研究发现，在酰肼桥右侧苯环上引入小的吸电子基团（如F、Cl）有利于提高杀菌活性，而供电子基团（如CH₃、OCH₃）或大体积吸电子基团（如CF₃）则不利。此外，延伸酰肼桥会增加化合物对斑马鱼的毒性，而在酰肼桥上引入取代基则可显著调节毒性水平。

基于以上发现，本研究设计合成了三个在右侧苯环上带有吸电子取代基的新型酰肼衍生物系列A1-A3、B1-B8和C1-C10，旨在系统探究酰肼桥结构变化对杀菌活性和生态安全性的影响。特别是，化合物B1-B8的结构虽在涉及杀虫和除草应用的专利中被提及，但其结构表征数据、杀虫除草活性以及农用杀菌活性此前均未见报道。本研究首次系统阐明了B1-B8的结构特征及其在农用杀菌领域的应用潜力，为开发高效、低风险的酰肼类杀菌剂候选物提供重要的理论基础和分子设计思路。本论文发表于《Advanced Agrochem》。

二、主要关键技术方法

为开展研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在化合物合成与表征方面，采用缩合反应等合成路线制备了目标化合物，并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振碳谱（¹³C NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行了结构确证。在杀菌活性评价方面，采用菌丝生长抑制法测定了目标化合物在50 μg/mL和5 μg/mL浓度下对八种植物病原真菌（如禾谷镰孢菌Fusarium graminearum、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、立枯丝核菌Rhizoctonia solani等）的体外抑制率，并计算了半数有效浓度（EC₅₀）；同时，在小麦和葫芦幼苗上评估了化合物对立枯丝核菌和Apiospora paraphaeosperma的活体预防效果。在作用机制探究方面，利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察了化合物B5处理对立枯丝核菌菌丝超微结构的影响；通过测量菌丝液电导率评估了细胞膜通透性变化；采用qRT-PCR技术分析了糖代谢和脂代谢相关关键基因的表达水平；并利用脂质组学（基于超高效液相色谱-串联质谱UPLC-MS/MS）分析了总脂及各类脂质分子的含量变化，同时通过高效液相色谱（HPLC）定量了麦角甾醇含量。在生态安全性评估方面，采用静态暴露法测试了化合物B5对斑马鱼的急性毒性；在不同pH缓冲液中考察了其水解稳定性；并通过叶面喷施和根际浸泡处理，评估了化合物对小麦幼苗生长的影响。

三、研究结果

3.1. 合成化学

所有目标化合物均通过图2所示路线成功合成，并得到充分表征。化合物C1-C10系列中部分化合物具有水溶性，纯化过程需特殊处理。

3.2. 杀菌活性

体外杀菌活性筛选表明，多数化合物表现出优异且广谱的杀菌效果。在50 μg/mL浓度下，化合物B5和C4对供试的六种病原真菌均达到了100%的抑制率。其中，化合物B5的杀菌谱和EC₅₀值与商品化杀菌剂戊唑醇相当甚至更优。在5 μg/mL的低浓度下，化合物B2和B5对禾谷镰孢菌仍保持超过94%的抑制率。活体试验进一步证明，化合物A3、B5和C4能有效预防立枯丝核菌对小麦幼苗的侵染，化合物B5和C4对葫芦上的Apiospora paraphaeosperma也具有显著的保护效果。构效关系分析进一步证实酰肼基团是关键的杀菌药效团，且4-F和3,4-二氟取代通常有利于增强杀菌效力。

3.3. 杀菌作用机制

3.3.1. SEM和TEM分析：SEM观察发现，化合物B5处理导致立枯丝核菌菌丝显著萎缩、皱缩。TEM观察显示，处理后的菌丝细胞内线粒体和脂滴消失，但细胞核和核仁仍清晰可见。这表明B5可能影响了细胞的脂质稳态和能量合成。

3.3.2. 相对电导率测定：B5处理显著增加了立枯丝核菌菌丝悬浮液的电导率，且呈浓度依赖性，表明其破坏了细胞膜完整性，导致胞内物质泄漏。

3.3.3. qRT-PCR分析：qRT-PCR结果表明，B5处理显著下调了糖酵解/糖异生途径中的己糖激酶基因（AG1IA_04168）和6-磷酸果糖激酶1基因（AG1IA_05192）的表达。同时，下调了甘油磷脂代谢（如磷脂酰丝氨酸脱羧酶基因AG1IA_06916）和鞘脂代谢（如鞘氨醇-1-磷酸醛缩酶基因AG1IA_09768）相关的关键基因，但上调了甾醇生物合成途径中的角鲨烯环氧酶基因（AG1IA_02324）、甾醇C-24甲基转移酶基因（AG1IA_06235）和Δ24(24(1))-甾醇还原酶基因（AG1IA_02524）。

3.3.4. 脂质组学分析：脂质组学分析发现，B5处理48小时后，立枯丝核菌的总脂含量显著降低。从脂质亚类看，单酰基甘油（MG）、甘油磷脂、脂肪酸和鞘脂含量下降，而二酰基甘油（DG）和三酰基甘油（TG）含量显著增加。对碳链长度和不饱和度的分析进一步揭示了各类脂质分子的具体变化。

3.3.5. 麦角甾醇含量测定：尽管甾醇合成途径关键基因表达上调，但HPLC定量分析显示，B5处理24小时和48小时后，立枯丝核菌的麦角甾醇含量与空白对照组相比无显著差异。

3.4. 对斑马鱼的毒性

斑马鱼急性毒性试验表明，化合物B5具有高毒性。在10 μg/mL浓度下，2天内死亡率达100%；5 μg/mL时，第3天死亡率为50%；1 μg/mL时，死亡率维持在10%。结合前期研究，发现酰肼桥的长度与毒性相关，直接连接两侧芳环的结构会提高毒性，而在桥上引入甲基等取代基可有效降低毒性。

3.5. 在不同pH缓冲液中的水解行为

化合物B5在碱性（pH 9.18）缓冲液中快速降解，但在中性和酸性缓冲液中相对稳定。结合前期研究，延伸酰肼桥或在桥上引入小取代基可以提高酰肼化合物在碱性条件下的稳定性。

3.6. 对小麦幼苗的安全性

叶面喷施和根际浸泡处理表明，在50 μg/mL浓度下，化合物B5和C4对小麦幼苗的株高、根长、鲜重和干重均无显著负面影响，表明此类新型化合物可能不影响作物的正常生长。

四、讨论与结论总结

综合讨论表明，酰肼桥的结构修饰（如长度、取代基）显著影响目标化合物的杀菌活性、生态毒性和环境行为。引入小取代基可能降低毒性并提高碱性环境下的稳定性，这为下一代低毒、稳定的酰肼类杀菌剂候选物的分子设计提供了方向。作用机制研究的多项结果（菌丝超微结构变化、脂滴消失、总脂含量降低、糖代谢和脂代谢关键基因表达扰动）具有一致性，共同指向酰肼结构可能通过干扰真菌的能量代谢和脂质代谢，特别是调控脂质稳态，来发挥其杀菌作用。这与团队前期的研究结论相符。

研究结论部分翻译如下：

总之，研究人员设计合成了总计21个新型的基于酰肼结构的目标化合物，以阐明酰肼桥的结构修饰对杀菌效力和生态毒性的影响。化合物B5表现出最有前景的杀菌效力，然而它也显示出对斑马鱼毒性高以及在碱性条件下不稳定等问题，表明其结构需要进一步优化。结合我们前期的发现，进一步证实了对酰肼桥的修饰会显著影响目标化合物的毒性和稳定性。值得注意的是，在酰肼桥上引入小取代基可能会显著降低目标化合物的毒性并增强其在碱性环境中的稳定性，这为设计下一代酰肼类杀菌剂候选物提供了方向。杀菌机制研究表明，化合物B5诱导脂滴消失和总脂含量显著降低，同时还显著下调了与能量代谢相关的关键基因（如糖酵解/糖异生和脂质代谢相关基因）的表达。这与我们先前的研究结论一致。因此，我们假设酰肼结构通过调节脂质代谢来发挥其杀菌作用。本研究将为开发具有独特分子靶标的新型酰肼类杀菌剂候选物提供重要的理论指导。