亚致死剂量的吡虫啉会通过干扰嗅觉基因的转录和功能，破坏斑纹草蛉（Hippodamia variegata）依靠嗅觉进行宿主定位的能力

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Sublethal imidacloprid exposure disrupts olfactory-mediated host location in Hippodamia variegata through transcriptional and functional impairment of olfactory genes

　　尤玲东|常建谢|北北杜|洪亮刘|淑静张|秋香庞|德生张
山东理工大学生命科学与医学院抗衰老与再生医学研究所，中国淄博255049

**摘要**
苯甲酸钠（SB）是一种广泛使用的合成食品防腐剂，具有广谱抗菌活性。尽管在规定的使用水平下通常被认为是安全的，但人们对其高浓度下的潜在毒性仍存在担忧。我们之前的研究表明，长期暴露于高剂量SB（2000 ppm）会显著延迟黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的蛹化时间和成虫出现时间，并改变其肠道微生物群组成。然而，这些发育和微生物方面的紊乱是否会遗传给下一代尚不清楚。因此，在本研究中，我们调查了SB对F1后代发育和肠道微生物群动态的跨代影响。值得注意的是，来自SB暴露父母的F1后代的幼虫蛹化和成虫出现时间显著延迟。值得注意的是，父母代果蝇中观察到的肠道微生物群失调在F1代中有所缓解。然而，F1后代的Shannon和Simpson多样性指数显著升高，表明微生物群发生了深刻的重构，这可能反映了过度补偿或另一种失调状态，而不是完全恢复正常。基因表达分析进一步显示，虽然大多数由SB引起的转录变化在后代中得到了恢复，但四个关键基因Yp2、TOR、E74B和CAT仍持续上调，表明存在持续的跨代失调。总体而言，这些发现提供了新的证据，表明SB暴露可以引起跨代发育毒性，这种毒性可能是由于基因失调持续存在所致，即使肠道微生物群已经恢复。这些发现强调了未来工作中需要进一步探讨其机制的必要性。

**1. 引言**
食品变质是一个全球性的问题，严重威胁食品安全并导致大量食物浪费（Karanth等人，2023年）。这种恶化主要由微生物污染、生长和代谢活动引起，可能导致严重的公共卫生风险并造成巨大的经济损失（Machado等人，2020年；Snyder等人，2024年）。为了应对这些挑战，食品防腐剂被广泛用作添加剂，以抑制导致变质的微生物（包括细菌、酵母和霉菌）的生长和繁殖，从而提高食品稳定性并延长保质期（Mpountoukas等人，2008年）。鉴于其广泛使用，食品防腐剂的安全性与公共卫生密切相关，并在食品工业的可持续发展中起着关键作用。

苯甲酸钠（SB）是苯甲酸的钠盐（化学式：C7H5NaO2），是一种广泛使用的合成食品防腐剂。作为一种广谱抗菌剂，SB对酵母、霉菌以及某些革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有高效抗菌作用（Davidson等人，2005年；Davidson等人，2012年）。SB发挥防腐作用的主要机制是通过抑制微生物生长。苯甲酸及其盐类会干扰微生物细胞膜和细胞质中的精细pH平衡，从而破坏营养吸收和能量产生等细胞过程（Kluge等人，2006年；Mwale，2023年）。由于其抑制特性，SB被添加到各种食品和饮料产品中，包括腌制蔬菜、罐头食品、果酱、果泥、果冻、即食沙拉、人造黄油、调味品、啤酒、碳酸饮料和果汁（Chipley，2020年）。值得注意的是，SB的抗菌效果高度依赖于pH值，在pH 2.5–4.0时效果最佳。在中性或碱性条件下，SB会分解成离子形式，无法轻易穿过微生物膜，导致防腐效果显著降低（Naseer Ahmed等人，2013年）。

安全性是SB作为食品添加剂的主要考虑因素。美国食品药品监督管理局（FDA）将SB归类为“公认安全”（GRAS）（FDA，2017年），这一分类得到了世界卫生组织（WHO）的认可。FDA和WHO都制定了SB允许使用量的具体指南，规定限量为0.1%（Lennerz等人，2015年）。此外，联合国粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会将苯甲酸盐的每日可接受摄入量（ADI）定义为0–5 mg/kg体重（bw）（Azuma等人，2020年）。尽管有这些监管措施，加工食品消费量的增加引发了人们对人类累积暴露于SB的担忧。新兴证据表明，长期或过量摄入SB可能对宿主生理产生不利影响（Xiao等人，2023年；Alabi等人，2025年）。然而，SB引起的毒性是否可以跨代传递仍不清楚，这揭示了一个重要的知识空白。因此，迫切需要全面的安全性评估，特别是关于高剂量SB暴露及其潜在的遗传或跨代效应。

肠道微生物群是一个复杂的动态生态系统，由定植在胃肠道中的共生微生物组成，包括细菌、古菌、真菌、病毒和原生动物（Clemente等人，2012年）。据估计，这些微生物的数量约为1013至101?个，涵盖超过1000种细菌。肠道微生物群失调与30多种疾病有关，包括炎症性肠病、肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝病、阿尔茨海默病、自闭症和多种癌症（Sekirov等人，2010年；Shen等人，2025年）。肠道微生物群通过执行多种关键生理功能在促进宿主健康方面发挥着重要作用，包括营养吸收和能量获取（Turnbaugh等人，2006年；Muramatsu和Winter，2024年）、抵御病原体（Pickard等人，2017年；Deng和Wang，2024年）、调节宿主免疫（Rooks和Garrett，2016年；Lee等人，2024a）以及增强肠道完整性或塑造肠上皮（Fassarella等人，2021年）。随着人们对肠道微生物群与宿主健康之间联系的认识日益增强，重新评估食品防腐剂的安全性变得尤为重要，尤其是它们对肠道微生物生态的影响。尽管欧洲食品安全局在其2021年的指南中强调了微生物组相关安全数据的重要性，但当前的监管框架仍缺乏评估防腐剂如何影响肠道微生物群组成和功能的特定指南（Merten等人，2020年；Moreno等人，2024年）。因此，SB对肠道微生物群组成和功能的潜在影响，尤其是跨代影响，仍知之甚少。

在我们之前的研究中，我们发现暴露于2000 ppm SB会显著延迟黑腹果蝇的蛹化和成虫羽化时间，缩短寿命，并改变其肠道微生物群组成，这表明SB具有发育和肠道微生物毒性。然而，这些不良影响是否可以传递给后代仍不清楚。因此，本研究旨在评估父母代SB暴露对后代生长和发育的跨代影响。此外，我们还研究了这种暴露如何影响后代的肠道微生物群组成和功能潜力。通过阐明这些跨代效应，我们的研究试图提供关于SB暴露的长期健康影响及其对宿主相关微生物群更广泛后果的关键见解。

**2. 材料与方法**
**2.1. 黑腹果蝇的饲养**
本研究使用的黑腹果蝇品系为Canton-S-iso3A，来自布卢明顿果蝇资源中心（BDSC #9516，美国印第安纳州布卢明顿）。果蝇在标准玉米粉基饲料上饲养，每升饲料含有以下成分：25 g酵母、40 g蔗糖、42.4 g麦芽糖、66.825 g玉米粉、9.18 g大豆粉、6 g琼脂、0.25 g尼帕金（甲基对羟基苯甲酸酯）和6.875 mL丙酸。我们之前的研究结果表明，只有2000 ppm或更高浓度的SB才会显著延迟亲代果蝇幼虫的生长和发育，因此我们将跨代研究集中在2000 ppm这一剂量上，该剂量能够可靠地产生明显的亲代表型。实验组在标准饲料中添加SB（Aladdin，AR级，纯度≥99%，中国上海）进行饲养，最终浓度分别为0 ppm（对照组）和2000 ppm。

为了评估SB暴露对后代发育的跨代影响，将先前暴露于2000 ppm SB的交配雌性果蝇转移到新鲜的产卵培养基中。产卵期结束后，收集F1后代并在不含SB的标准饲料上饲养，以促进其正常生长和发育。所有果蝇都在受控的环境条件下饲养：25°C、65%相对湿度和12小时光照-黑暗周期。

**2.2. 发育时间测量**
通过定期监测和记录蛹化和成虫羽化时间，评估暴露于0 ppm或2000 ppm SB的个体从幼虫到蛹和从蛹到成虫的变态过程。使用一天大的成虫个体来评估其体重。对于每个实验条件，使用精密天平（Mettler Toledo，型号MS105DU，瑞士苏黎世）测量十只成虫的总体重。图表上的每个数据点代表至少六个独立生物重复实验的平均值，每个重复实验至少包含十只果蝇。

**2.3. 16S rRNA基因扩增子序列分析**
**2.3.1. 样本收集和DNA提取**
从0 ppm和2000 ppm SB喂养组中收集成虫，分别用50%（v/v）家用漂白剂和70%乙醇短暂冲洗。表面消毒后，用磷酸盐缓冲液（PBS）彻底清洗果蝇至少2分钟，然后进行解剖。对于每个样本，使用无菌镊子在无菌PBS中解剖30–35只果蝇的肠道，并小心去除非肠道组织，包括气管、马尔皮基管和嗉囊。

为了提取基因组DNA，将解剖后的肠道收集在冰上的PBS中，并使用电动组织研磨机（Tiangen，型号OSE-Y20，中国北京）和配套的研杵（Tiangen，型号OSE-Y001）进行至少1分钟的匀浆。匀浆液立即储存在-80°C。按照制造商的说明，使用BioBase动物组织DNA提取试剂盒（M2012–01，中国成都）提取基因组DNA。冷冻样本在37°C下解冻45分钟，然后转移到含有600 μL LWA缓冲液（BioBase，目录号M2012–01，中国成都）的2 mL试管中。离心后，将上清液转移到含有30 μL Tissue Beads（BioBase，目录号M2012–01）的新2 mL试管中。然后用WB和SPW缓冲液（BioBase，目录号M2012–01）依次洗涤珠子，在室温下风干，最后重新悬浮在EB缓冲液（BioBase，目录号M2012–01）中用于DNA洗脱。使用NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific，美国沃尔瑟姆）测定DNA浓度和纯度，并通过1%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。根据测得的浓度，用无核酸酶的水将DNA样本稀释至工作浓度1 ng/μL。

**2.3.2. Illumina NovaSeq测序**
测序由Wekemo Tech Group Co., Ltd.（中国深圳）完成。为了扩增16S rRNA基因的V3–V4区域，使用了特定的引物：341 F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806 R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’），每个引物都带有唯一的条形码。每次PCR扩增的最终体积为30 μL，包括15 μL Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）、0.2 μM的每个条形码引物（正向和反向）、10 ng的基因组DNA（以10 μL的量添加）和3 μL的无核酸酶水。为了监测潜在的污染和扩增偏差，每次提取和PCR批次中都包含了无模板对照，即用无核酸酶水替代DNA模板。热循环条件如下：初始变性98°C 1分钟，然后是30个循环的98°C变性10秒、50°C退火30秒、72°C延伸30秒，最后在72°C下延伸5分钟。PCR产物与6 × DNA加载染料混合，并在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，使用与运行缓冲液相同的缓冲液。PCR产物按等摩尔比例混合，然后使用Universal DNA Purification Kit（TianGen，中国）进行纯化。

**2.3.3. 生物信息学分析**
测序数据的生物信息学分析遵循QIIME2文档中提供的“Atacama Soil Microbiome Tutorial”协议，并结合了自定义程序脚本（https://docs.qiime2.org/2019.1/）。首先对每个样本的序列进行解复用，然后进行质量过滤和修剪以确保数据完整性。接着对序列进行去噪、合并，并使用QIIME2 DADA2插件识别和消除嵌合序列。这导致生成了一个包含扩增子序列变异（ASVs）的特征表（Callahan等人，2016年）。为了对ASVs进行分类，使用QIIME 2的特征分类器插件创建了一个分类表，该插件将ASV序列与预训练的GREENGENES 13_8 99%数据库对齐，以进行分类分配（Bokulich等人，2018年）。QIIME 2中的core-diversity插件被用来计算多样性指标，包括特征级别的alpha多样性指数，如Chao1丰富度估计器、Faith的PD、Shannon多样性指数和Simpson多样性指数。这些指标提供了关于单个样本中微生物多样性的见解。为了检查不同样本之间微生物群落的结构差异，进行了beta多样性距离测量，并使用主坐标分析（PCoA）（Vázquez-Baeza等人，2013年）和非度量多维缩放（NMDS）分析来可视化结果。此外，还使用Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2（PICRUSt2）方法（Langille等人，2013年）预测了肠道微生物群的潜在KEGG同源功能谱型。为了识别生物标志物并评估不同组之间微生物特征的统计显著性，在在线Galaxy平台上使用LEfSe模块进行了线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析。

2.3.4. 定量逆转录-PCR（qRT-PCR）用于评估黑腹果蝇后代的基因表达
根据孵化时间在8小时内的成年果蝇及其父母暴露于不同浓度SB培养基的情况（0 ppm（对照）和2000 ppm）进行选择。为了分析这些果蝇的基因表达，收集了整个身体，每个样本包含15-20只果蝇。使用BioBase提供的裂解缓冲液TLB（N1002-01）和相应的研钵（Tiangen，OSE-Y20）及杵（Tiangen，OSE-Y001）将样本均质化。然后按照RNA提取试剂盒（BioBase，N1002）提供的制造商说明处理匀浆液以提取总RNA。使用Nanodrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，美国）评估提取的RNA的数量和纯度。对于每个样本，使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，K1622，美国）将1 μg的总RNA逆转录成cDNA。然后使用这种cDNA作为模板进行定量实时PCR（qRT-PCR）来测量目标基因的表达水平。qRT-PCR反应使用Roche LightCycler 480 II实时PCR系统（Roche，Basel，瑞士）和2 × Q3 QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix（TOLOBIO，22204-1）进行。通过将目标基因与参考基因rp49进行比较来确定其相对表达水平，rp49用于标准化。使用比较ΔΔCt方法计算mRNA表达的倍数变化，相对于对照组（0 ppm SB）。用于qRT-PCR的引物序列是针对目标基因的，列在补充表1中。

2.4. 统计分析
使用GraphPad Prism 7软件（GraphPad Software，La Jolla，CA，美国）进行发育时间分析。在比较两个样本时，使用双尾Student’s t检验来确定统计显著性。在涉及多个样本比较的情况下，使用单因素方差分析（ANOVA），然后使用Tukey的多重比较检验来识别组间的差异。在所呈现的图表中，除非另有说明，数据平均值用表示标准差（SD）的误差条表示。这些分析中的统计显著性水平用星号表示：* p < 0.05，** p < 0.01。

3. 结果
3.1. 发育时间测量
在我们之前的研究中，我们系统地测试了从200到5000 ppm范围内的SB浓度对黑腹果蝇父母代的影响。我们发现，只有高剂量（≥ 2000 ppm）一致地引起了显著的发育延迟，包括幼虫期延长和成虫孵化延迟，以及肠道微生物群组成和基因表达的显著变化。相比之下，200、500和1000 ppm的暴露与对照组相比没有产生统计学上显著的表型效应。然而，目前尚不清楚这种发育毒性是否会在没有SB补充的标准饮食下传递给后代。鉴于跨代遗传通常需要父母代受到强烈的初次伤害以触发下游的表观遗传、微生物或生理级联反应，我们认为如果较低剂量未能干扰父母代，它们不太可能在F1后代中引起可检测到的效应。因此，我们将跨代研究集中在2000 ppm的条件上，这是可靠地产生明显父母表型的剂量。因此，我们评估了SB对黑腹果蝇后代的发育毒性。父母代在幼虫发育期间暴露于SB，孵化后允许它们产卵。然后将这些卵转移到不含SB的标准培养基中，在恢复条件下饲养F1代。测量了关键的生长和发育相关参数，以确定父母代SB暴露的发育效应是否在完全不含SB的饮食中饲养的后代中持续存在（图1A）。结果显示，与对照组（0 ppm SB）相比，暴露于2000 ppm SB的父母代的F1后代的化蛹时间显著延迟。具体来说，2000 ppm组的化蛹率（图1B）和平均化蛹时间（图1C）都受到了不利影响。在成虫出现方面也观察到了类似的延迟，出现率降低（图1D）和成虫孵化时间显著延长（图1E）。相比之下，无论是雌性还是雄性F1成虫的体重都没有显著差异（图1F-G）。这些发现表明，即使后代在完全不含SB的环境中饲养，父母代对SB的暴露也会导致可传递的发育延迟。

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图1. SB对黑腹果蝇后代幼虫发育的影响。(A) 实验设计。(B) 暴露于2000 ppm SB的果蝇后代的化蛹时间。(C) 暴露于2000 ppm SB的果蝇后代的平均化蛹时间。(D) 暴露于2000 ppm SB的果蝇后代的成虫出现时间。(E) 暴露于2000 ppm SB的果蝇后代的平均成虫出现时间。(F) 暴露于2000 ppm SB的雌性后代的成虫体重。(G) 暴露于2000 ppm SB的雄性后代的成虫体重。
为了进一步测试跨代发育效应的幅度是否随着父母代SB暴露时间的延长而增加，我们使用在收集卵之前连续10天喂食2000 ppm SB的新孵化成年果蝇重复了实验（图2A）。与之前的发现一致，这些父母代的后代也表现出化蛹延迟（图2B-C）和成虫出现延迟（图2D-E），而雌性和雄性F1成虫的体重保持不变（图2F-G）。当我们将仅在发育期间暴露于SB的父母代的后代与在成年后额外暴露10天的后代进行比较时，观察到化蛹时间略有延长（图2H），但成虫出现时间没有显著变化（图2I）。这些结果表明，父母代对SB的延长暴露可能会加剧下一代的某些发育延迟，尽管这种效应似乎仅限于早期变态阶段，并不会在所有发育终点都均匀增强。

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图2. SB暴露持续时间对黑腹果蝇后代幼虫发育的影响。(A) 实验设计。(B) 暴露于2000 ppm SB额外10天的果蝇后代的化蛹时间。(C) 暴露于2000 ppm SB额外10天的果蝇后代的平均化蛹时间。(D) 暴露于2000 ppm SB额外10天的果蝇后代的成虫出现时间。(E) 暴露于2000 ppm SB额外10天的果蝇后代的平均成虫出现时间。(F) 暴露于2000 ppm SB额外10天的雌性后代的成虫体重。(G) 暴露于2000 ppm SB额外10天的雄性后代的成虫体重。(H) 新孵化成年果蝇后代与额外暴露10天的后代之间的平均化蛹时间比较。(I) 新孵化成年果蝇后代与额外暴露10天的后代之间的平均成虫出现时间比较。

3.2. 肠道微生物群
3.2.1. 暴露于2000 ppm SB的父母代果蝇后代的肠道微生物组成改变
为了研究暴露于2000 ppm SB的果蝇后代的肠道微生物群的变化，我们进行了16S rRNA基因扩增子测序。这一过程共产生了3687,518个高质量序列。每个ASV通过QIIME2的DADA2管道以大于99%的同一性阈值进行定义。每个样本的ASV数量从54到118不等。本研究获得的16S rRNA基因序列数据已存入NCBI Sequence Read Archive（SRA）数据库，访问号为PRJNA1216764。
与暴露于2000 ppm SB的父母代果蝇的肠道微生物群组成一致，它们的F1后代中的主要细菌门类是Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes（图3A）。在属水平上，主要分类单元包括Acetobacter、Gluconacetobacter、Bergeyella、Lactobacillus、Ruminococcus、Stenotrophomonas和Bacteroides（图3B）。值得注意的是，暴露于0 ppm SB的对照组父母代的后代显示出特定分类单元的富集，包括Lactobacillus、Lactobacillus plantarum、Acetobacter、Acetobacter aceti以及Acetobacteraceae科的成员，其中大多数属于Proteobacteria和Firmicutes门（图3C, 3E）。相比之下，暴露于2000 ppm SB的父母代在F1后代中表现出不同的微生物谱型，其特征是在相同的三个主要门类中富集了多个其他分类单元（图3C, 3E），表明肠道微生物群发生了生态转变或生态位重组。尽管存在这些组成差异，但F1后代的总微生物丰度在0 ppm和2000 ppm SB组之间没有显著差异（图3D, 3F），表明SB暴露主要改变了群落结构而不是总细菌负荷。

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图3. 暴露于SB的父母代果蝇及其后代的肠道微生物组成和物种富集分析。(A) 暴露于SB的父母代果蝇及其后代的肠道微生物组成在门水平上。(B) 暴露于SB的父母代果蝇及其后代的肠道微生物组成在属水平上。(C) 暴露于0 ppm和2000 ppm SB的果蝇的肠道微生物物种的线性判别分析（LDA）得分。(D) 暴露于0 ppm和2000 ppm SB的果蝇后代的肠道微生物物种的LDA得分。(E) 暴露于0 ppm和2000 ppm SB的果蝇中富集物种的系统发育树。(F) 暴露于0 ppm和2000 ppm SB的后代中富集物种的系统发育树。
关于肠道微生物群的α多样性，在Chao1（物种丰富度）或Faith的Phylogenetic Diversity（PD）方面，暴露于2000 ppm SB的父母代果蝇与对照组之间没有显著差异（图4A-B）。然而，在F1代中出现了显著的模式：虽然父母代SB暴露没有改变Shannon或Simpson指数，但来自SB暴露父母代的后代显示出比对照组后代更高的Shannon和Simpson多样性（图4C-D）。这表明SB的跨代效应不是表现为多样性的丧失，而是表现为下一代微生物分类单元的均匀性和/或均衡性的提高。

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图4. 暴露于SB的父母代果蝇及其后代的肠道微生物群的α多样性。(A) Chao1。(B) Faith’s PD。(C) Shannon。(D) Simpson。
与我们之前的发现（Dong等人，2022年）一致，β多样性分析（未加权UniFrac PCoA和Bray–Curtis NMDS）显示对照组和暴露于SB的父母代果蝇之间的肠道微生物群组成有明显的分离（图5A-B；PERMANOVA，表1，表2），证实高剂量SB破坏了原有的微生物群落，特别是通过耗尽Acetobacteraceae和Lactobacillaceae。相比之下，对照组和暴露于SB的父母代的F1后代之间没有检测到显著的组成差异（图5A-B；PERMANOVA，表1，表2），表明微生物群的基本分类结构在下一代中基本得到恢复。

表1. 基于Bray-Curtis距离的微生物群PERMANOVA。
组1 组2
样本量 排列次数 伪F值 q值
SB0_F1 10 999 3.29 20.01 0.01
SB0_F1SB0_P0 13 999 34.12 60.00 10.00
2SB0_P0SB2000_P0 16 999 12.45 0.00 10.00
2SB0_P0SB2000_P0 16 999 2.31 30.00 10.00

表2. 基于未加权-unifrac距离的微生物群PERMANOVA。
组1 组2
样本量 排列次数 伪F值 q值
SB0_F1 10 999 1.25 50.24 90.24
SB0_F1SB0_P0 13 999 4.56 30.00 10.00
2SB0_P0SB2000_P0 16 999 2.31 30.002000 ppm SB暴露的亲本果蝇后代的肠道微生物功能改变
我们进一步使用PICRUSt2预测了肠道微生物功能的变化。在KEGG第三级（L3）水平上，2000 ppm SB暴露的亲本果蝇及其后代共有的主要功能途径包括：萜类和类固醇的生物合成；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；生物素代谢；脂肪酸生物合成；细菌趋化性；鞭毛组装；硫辛酸代谢；细胞周期–Caulobacter；链霉素生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；氨基酸生物合成；蛋白质输出；氨基酰-tRNA生物合成；D-丙氨酸代谢；泛酸和CoA生物合成；柠檬酸循环（TCA循环）；错配修复；硫胺素代谢；硫传递系统；以及谷胱甘肽代谢（图6A）。对这些功能谱的主成分分析（PCA）显示，SB暴露亲本的后代与对照组之间的肠道微生物群没有明显差异（图6B），这表明尽管存在分类学上的变化，但微生物组的整体预测代谢潜力在各个组间基本保持一致。

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图6. SB暴露的亲本果蝇及其后代的肠道微生物群功能预测。（A）KEGG第三级途径。（B）肠道微生物功能的主成分分析（PCA）。

对预测的微生物途径进行ANOVA分析后发现，2000 ppm SB暴露显著改变了亲本果蝇的多个功能途径，而在其后代中部分恢复。具体来说，与环境信息处理相关的ABC转运蛋白途径在SB暴露的亲本肠道微生物群中显著上调，但在F1后代中恢复到基线水平。相反，细菌分泌系统途径在暴露的亲本及其后代中均显著下调（图7A）。同样，群体感应途径在SB暴露的果蝇中显著增强，但在下一代中恢复正常（图7B）。大多数显著变化的途径主要集中在代谢途径上。例如，氨基苯甲酸降解；不饱和脂肪酸的生物合成；生物素代谢；原核生物中的碳固定；碳代谢；D-丙氨酸代谢；D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢；谷胱甘肽代谢；戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化；肽聚糖生物合成；类固醇激素生物合成；以及萜类骨架生物合成都受到亲本SB暴露的显著影响。然而，这些变化在F1后代中大部分恢复到正常水平（图7C）。值得注意的是，一些代谢途径在SB暴露的亲本后代中仍然显著改变，包括精氨酸生物合成、β-丙氨酸代谢、光合生物中的碳固定、类胡萝卜素生物合成、N-糖胺聚糖生物合成、硝基甲苯降解以及泛酸和CoA生物合成（图7C）。

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图7. SB暴露的亲本果蝇及其后代肠道微生物功能的显著途径（ANOVA分析）。这里，条形图上相同的字母（a, b, c）表示具有相同字母的组之间没有显著差异。相反，不同的字母表示相应组之间存在显著差异。

3.3. 2000 ppm SB暴露的亲本果蝇后代的基因表达
我们重新检查了在2000 ppm SB暴露的亲本果蝇中表现出显著变化的基因在其未暴露的F1后代中的表达情况。结果显示，几个基因的mRNA水平在SB暴露的亲本后代中仍然显著升高。具体来说，与激素相关的基因Yp2、TOR途径成分TOR和E74B以及抗氧化酶基因CAT均上调（图8）。相比之下，其他与激素相关的基因ERR、yl和DmJHAMT没有持续的失调；它们的转录水平恢复到0 ppm SB暴露的对照组后代中的水平（图8）。

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图8. SB暴露的亲本果蝇后代的基因表达。

4. 讨论
在当今社会，生活方式的变化导致加工食品的市场份额不断增加。这种加工食品的消费增长可能会增加超过食品防腐剂设定ADI水平的风险。因此，定期重新评估像SB这样的物质的安全性至关重要。

高剂量SB暴露与宿主的一些潜在不良健康效应有关，包括肝毒性、抗氧化防御能力下降、炎症反应增强和基因毒性。Radwan等人（2020）报告称，每天口服200 mg/kg体重的SB持续8周会导致雄性大鼠出现肝毒性，表现为肝脏中关键抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）水平下降，丙二醛（MDA）浓度升高，以及肝脏组织中肿瘤抑制基因p53的表达上调。同样，Olofinnade等人（2021）证明，每天摄入125、250和500 mg/kg体重的SB（相当于饮食中0.0125%、0.025%和0.05%）会显著降低血液细胞计数和总抗氧化能力，同时增加血清MDA水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性。值得注意的是，这种处理还会降低血清中的促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-10的水平，并改变脂质谱以及肝脏和肾脏功能的生化标志物。进一步支持这些发现的是，Al-Ameen等人（2022）观察到，每天摄入500 mg/kg体重的SB持续30天会显著降低成年雄性大鼠的SOD活性并增加一氧化氮水平，导致多个器官（包括心脏、大脑皮层和肝脏）的氧化损伤。在D. melanogaster中，Asejeje等人（2024）发现，每天摄入0.1%的SB持续21天会降低存活率并通过氧化应激和关键抗氧化酶的抑制引起全身毒性。

一项为期30天的亚慢性毒性研究表明，每天口服200、400和700 mg/kg体重的SB会显著抑制关键抗氧化酶的活性，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GST）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）和SOD。这些相同剂量还会显著增加促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-1β和IL-6。相比之下，较低剂量（70 mg/kg体重/天）并未显著改变这些参数（Khan等人，2022）。进一步支持SB的代谢和炎症效应的是，Xiao等人（2023）报告称，在小鼠中，每天摄入150和1000 mg/kg体重的SB会增加血清甘油三酯水平，而500 mg/kg体重的剂量会增加血糖。这两种方案还会促进IL-1和IL-6的分泌。在已有肝细胞损伤的大鼠模型中，Asejeje等人（2024）发现，每天摄入600 mg/kg体重的SB会加剧肝脏损伤，表现为血清中的天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶活性显著升高。此外，抗氧化状态显著下降，脂质过氧化和炎症生物标志物升高。

除了代谢和肝毒性外，Lee等人（2024b）在秀丽隐杆线虫中证明，SB可能通过抑制氧化应激反应的SKN-1信号通路促进脂肪积累并缩短寿命，该通路是哺乳动物Nrf2的功能同源物。最后，Zengin等人（2011）提供了SB的基因毒性证据：在培养的人类淋巴细胞中，6.25、12.5、25、50和100 μg/mL的SB浓度显著增加了染色体异常、姐妹染色单体交换和微核形成，同时降低了有丝分裂指数。这些发现共同表明，SB在体外对人体细胞具有致裂变、致突变和细胞毒性作用。

即使在低浓度下，长期暴露于SB也会对宿主健康产生不利影响。El-Shennawy等人（2020）证明，每天口服1 mg/kg体重的SB持续90天会在雄性大鼠中引起显著的生殖毒性，表现为睾丸结构紊乱、精子参数受损和性激素谱改变。具体来说，SB暴露导致生殖器官重量剂量依赖性减少，精子数量和活力下降，异常精子比例增加。他们研究的关键发现包括：SB剂量增加显著改变了生殖器官的重量，精子数量和活力下降，异常精子比例增加；血浆睾酮和促卵泡激素水平下降，血浆黄体生成激素水平上升，睾丸中的17β-羟基类固醇脱氢酶和17-酮类固醇还原酶活性下降；炎症和氧化应激增加，TNF-α和IL-6水平升高。

然而，一些研究报道了SB在特定条件下的有益效果。Choi等人（2023）发现，饲料中添加0.3%、0.4%和0.5%的SB可以改善育肥猪的生长表现。同样，一项为期56天的白腿虾（Litopenaeus vannamei）喂养试验表明，添加1750 mg/kg的SB可以增强多种生理参数，包括生长、抗氧化能力、肠道和肝胰腺形态、肠道微生物群多样性以及疾病抵抗力（Huang等人，2023）。具体来说，喂食SB的虾表现出最终体重和体重增加。抗氧化酶活性，如CAT、SOD、GST和胰蛋白酶，在肠道和肝胰腺中显著升高。在分子水平上，SB上调了肠道中的关键基因表达，包括胰蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶、IL-8和IL-10。此外，组织学分析显示肠道和肝胰腺组织的结构完整性改善，微生物谱分析表明肠道微生物群的α多样性增加。

我们之前的研究也发现了SB的负面影响。具体来说，我们发现2000 ppm或更高浓度的SB暴露会延迟D. melanogaster幼虫的发育时间，延长发育期，缩短成虫寿命，改变肠道微生物群组成，并扰乱参与激素信号传导、胰岛素/胰岛素样生长因子信号传导（IIS）途径、雷帕霉素（TOR）途径靶点和抗氧化防御的基因表达（Dong等人，2022）。然而，很少有研究探讨高剂量SB的跨代毒性。在本研究中，我们观察到2000 ppm SB暴露的亲本不仅损害了暴露代，还显著延迟了未暴露F1后代的化蛹和成虫出现时间。这些发现表明，SB引起的发育毒性可能会持续几代。尽管如此，仍需要进一步的研究来确认这些跨代效应并阐明其背后的分子和表观遗传机制。

据我们所知，这项研究首次提供了果蝇亲本暴露于SB后跨代发育和分子效应的证据。虽然某些环境污染物（如双酚A（Dabeer等人，2020）、重金属（P?lkki和Rantala，2021，Wang等人）和农药（Pompermaier等人，2022）的跨代毒性已有记录，但关于常见食品防腐剂的报道仍然很少。值得注意的是，另一种广泛使用的抗菌防腐剂丙基对羟基苯甲酸酯最近被证明会导致小鼠卵巢储备减少，这种影响可以在F1-F3后代中遗传（Li等人，2025）。相比之下，尽管数据有限，但尚未报道山梨酸钾或苯甲酸衍生物的跨代效应。SB作为一种GRAS级别的化合物，在低剂量下就能在未暴露的后代中引起持续的表型和基因表达变化，这强调了重新评估即使是“低风险”食品添加剂的长期、多代安全性的必要性。

SB还被报道可以改变肠道微生物群组成。Nagpal等人（2021）发现，每天饮食中添加1000 ppm的SB持续12周会显著改变小鼠的肠道微生物群，导致拟杆菌属、Blautia属、Ruminococcus属、Oscillospira属和Dorea属的相对丰度增加。相反，Li等人（2022）观察到SB暴露显著降低了通常被认为是有益的Bifidobacterium属的丰度。Xiao等人（2023）报告称，每天口服SB 5周仅对小鼠肠道微生物群引起轻微变化。然而，在10周的干预后，SB产生了更明显的调节作用：它显著增加了乳酸菌的相对丰度，同时降低了Ileibacterium的丰度。值得注意的是，这些微生物扰动在SB停止后至少持续了10周，表明对肠道微生物稳态有长期且可能是不可逆的影响。进一步支持肠道微生物组对防腐剂的敏感性的是，Hrncirova等人（2019）证明，人类肠道微生物群长期暴露于低水平食品添加剂（包括SB）可以改变微生物组成和代谢功能。特别是，Lactobacillus paracasei和Bifidobacterium longum被确定为对SB高度敏感。有趣的是，Gerasimidis等人（2020）在使用健康志愿者样本的体外粪便发酵模型中报告了相反的结果：SB显著抑制了大肠杆菌的生长，同时促进了Bifidobacterium的生长。

我们之前的研究还发现，2000 ppm SB暴露显著改变了Drosophila melanogaster的肠道微生物群组成和功能，主要是通过降低醋酸菌科和乳酸菌科的相对丰度（Dong等人，2022）。相比之下，肠道微生物群的跨代效应很少被探索。在这里，我们发现虽然β多样性分析显示对照组和暴露于SB的父母的F1后代在组成上没有显著差异，表明整体群落结构得到了恢复，但α多样性指数（Shannon和Simpson）在来自SB暴露果蝇的F1后代中显著升高。这些发现表明，尽管F1后代的肠道微生物群在组成上与对照组相比有所恢复，但它可能没有完全回到暴露前的状态。F1微生物群更可能代表一种失调或过度补偿的状态，这可能会带来自身的生理后果。总体而言，这些发现表明，尽管SB对暴露个体的肠道微生物群有直接且明显的影响，但其对微生物组成的影响并不能稳定地传递给后代，至少在16S rRNA分析的可检测分类学水平上是如此。关于基因表达的变化，尽管一些改变的基因在SB暴露果蝇的后代中恢复到了正常水平，但仍有几个关键基因表现出表达改变。这些基因包括与激素相关的基因Yp2、TOR通路基因TOR和E74B以及抗氧化酶相关基因CAT。TOR通路是一种高度保守的营养感应信号级联反应，在调节果蝇的生长、体型、代谢和衰老中起着核心作用（Kapahi等人，2004年；Bjedov等人，2010年）。它作为营养信号的关键整合者，调节激素生长信号和发育时间。值得注意的是，有益微生物如植物乳杆菌可以通过在TOR通路上游起作用来加速果蝇的发育，从而增强宿主的营养感应并促进全身生长（Storelli等人，2011年）。TOR和E74B都是生长和变态的正向调节因子，但在F1后代中上调，然而这些果蝇仍然表现出发育延迟，这似乎有些矛盾。乍一看，这种表型在后代中的持续存在似乎是矛盾的，特别是考虑到F1果蝇的肠道微生物群组成似乎已经恢复。然而，这一观察在生物学上是合理的。我们推测，发育延迟的减轻反映了宿主代谢和生长调节网络中的部分补偿反应。具体来说，TOR的持续上调可能是F1幼虫为了对抗遗传的生理限制并加速发育到更正常轨迹而做出的适应性尝试。这并没有完全消除跨代效应，但可能减轻了其程度。因此，F1代并没有完全继承父母的表型，而是表现出一种由残留扰动（例如基因失调）和新兴的稳态机制共同塑造的调节反应。

编码卵黄蛋白2的基因Yp2主要与雌性生育能力相关；YP2的异常表达或分泌会导致雌性不育（Williams等人，1987年）。营养状况已被证明可以调节果蝇中的YP2表达水平（S?ndergaard等人，1995年）。尽管YP蛋白通常被认为是雌性特有的，但在雄性中也检测到它们，它们作为外源性蛋白与精子膜结合，并可能影响雄性的生殖功能（Majewska等人，2014年）。F1后代中YP2的持续上调表明，父母暴露于SB可能对下一代的生殖生理产生了不利影响。抗氧化酶不一定对正常的衰老过程至关重要，但它们使生物体能够应对压力条件（Le Bourg，2001年）。因此，F1后代中CAT表达的上调可能代表了对父母SB暴露所遗留压力的补偿反应。尽管我们观察到TOR和E74B等关键调节基因的持续上调，但我们没有评估它们的下游功能输出，例如TOR通路的磷酸化状态或总过氧化氢酶活性。未来的工作需要结合磷酸蛋白质组学、酶活性测定或遗传上位性实验，以确定这些转录变化是否驱动了F1后代的生理改变。

虽然F1后代的肠道微生物群在整体组成上没有显著变化（如β多样性所示），但显著升高的Shannon和Simpson指数表明它并没有完全恢复到基线状态。相反，这种改变的微生物谱可能代表了一种失调或过度补偿的反应。尽管存在这种微生物扰动，但只有四个基因（YP2、TOR、E74B和CAT）的持续上调表明，父母SB暴露的跨代影响并非由持续的微生物失调本身引起，而是由宿主体内的更稳定分子改变所介导。我们提出了三种可能的跨代机制：SB残留物传递到下一代、表观遗传继承以及由于父母生理压力导致的母体供给改变。然而，我们的数据更支持表观遗传继承是最可能的驱动因素。首先，尽管父母果蝇在产卵前24小时被放置在无SB的食物上，F1后代完全在无SB的饮食中饲养，但我们没有清洗卵子，因此不能排除SB或其代谢物的微量残留。然而，SB在动物体内会迅速清除，大部分在6-24小时内以马尿酸的形式排出（Bhanuprasad，2019年）。此外，如果存在残留的SB，我们预期会出现持续的肠道失调或广泛的毒性效应；相反，F1微生物群稳定在一个一致的状态（除了α多样性略有升高），并且表型仅限于少数与发育和代谢相关的基因的特定、持续变化。因此，仅凭微量残留物不太可能解释观察到的跨代效应。其次，父母SB暴露并没有显著降低成虫体重，这表明严重的热量或宏量营养素缺乏不太可能。此外，我们观察到只有少数与发育和代谢相关的基因持续失调，而没有证据表明F1后代有明显的生长障碍或系统发育缺陷，这使得普遍的营养缺乏不太可能。严重的或慢性的母体营养不良通常会导致广泛的表型后果，例如体型减小、蜕皮延迟或高死亡率，这些在我们的F1代中没有观察到。相比之下，表观遗传机制，如可遗传的组蛋白修饰和通过生殖细胞传递的小RNA，在果蝇和其他昆虫中已被很好地记录为在不改变DNA序列的情况下介导环境诱导的表型跨代继承（Fitz-James等人，2025年；Gleason和Chen，2023年；Mukherjee和Vilcinskas，2019年）。值得注意的是，尽管果蝇缺乏典型的DNA甲基化机制，但已有报道某些内分泌干扰化学物质在哺乳动物中通过DNA甲基化介导跨代效应。例如，产前暴露于丙基对羟基苯甲酸被证明会降低小鼠F1-3代的卵巢储备，与Rhobtb1位点的持续低甲基化有关（Li等人，2025年）。尽管不同分类单元中的表观遗传记忆的分子载体可能不同，但这些发现共同强调了环境暴露可以在后代生理中诱导稳定的、可遗传的变化。

为了直接测试SB在果蝇中的跨代效应是否由表观遗传继承引起，未来的工作应该结合假设驱动的方法。例如，交叉寄养，将胚胎在SB暴露和对照组母亲之间交换，有助于区分真正的生殖细胞传递和母体供给改变的间接效应。同时，针对生殖细胞的表观基因组分析，特别是针对TOR和CAT位点的分析（例如，ChIP用于组蛋白修饰），可以揭示它们的持续失调是否根植于染色质水平的变化。这些实验将超越相关性，提供关于父母环境暴露如何塑造后代基因表达的机制性见解。这项研究的一个关键限制是使用了2000 ppm的单一高浓度SB，这超过了典型的人类饮食暴露水平。虽然这个剂量是基于其在我们之前的工作中能够引发强烈表型效应的能力选择的，但由于缺乏剂量-反应分析，我们无法得出关于观察到的跨代效应的阈值或环境相关性的结论。未来的研究需要使用一系列环境上合理的浓度，以确定在较低剂量下是否会发生更微妙但生物学上显著的跨代影响。

总之，我们的研究表明，父母暴露于2000 ppm SB会延迟F1后代的蛹期和成虫出现。尽管F1果蝇的肠道微生物组成与对照组相似，但显著升高的Shannon和Simpson多样性指数表明微生物状态发生了变化，而不是恢复。这种改变的微生物谱可能代表了一种失调或过度补偿的反应。尽管存在这种微生物扰动，但只有四个基因（YP2、TOR、E74B和CAT）的持续上调表明，父母SB暴露的跨代影响并非由持续的微生物失调本身引起，而是由宿主体内的更稳定分子改变所介导。我们提出了三种可能的跨代机制：SB残留物传递到下一代、表观遗传继承以及由于父母生理压力导致的母体供给改变。然而，我们的数据更支持表观遗传继承是最可能的驱动因素。首先，尽管父母果蝇在产卵前24小时被放置在无SB的食物上，F1后代完全在无SB的饮食中饲养，但我们没有清洗卵子，因此不能排除SB或其代谢物的微量残留。然而，SB在动物体内会迅速清除，大部分在6-24小时内以马尿酸的形式排出（Bhanuprasad，2019年）。此外，如果存在残留的SB，我们预期会出现持续的肠道失调或广泛的毒性效应；相反，F1微生物群稳定在一个一致的状态（除了α多样性略有升高），并且表型仅限于少数与发育和代谢相关的基因的特定、持续变化。综上所述，这表明微量残留物本身不太可能解释观察到的跨代效应。其次，父母SB暴露并没有显著降低成虫体重，这表明严重的热量或宏量营养素缺乏不太可能。此外，我们观察到只有少数与发育和代谢相关的基因持续失调，而没有证据表明F1后代有明显的生长障碍或系统发育缺陷，这使得普遍的营养缺乏不太可能。严重的或慢性的母体营养不良通常会导致广泛的表型后果，例如体型减小、蜕皮延迟或高死亡率，这些在我们的F1代中没有观察到。相比之下，表观遗传机制，如可遗传的组蛋白修饰和通过生殖细胞传递的小RNA，在果蝇和其他昆虫中已被很好地记录为在不改变DNA序列的情况下介导环境诱导的表型跨代继承，通常是基因特异性的（Fitz-James等人，2025年；Gleason和Chen，2023年；Mukherjee和Vilcinskas，2019年）。值得注意的是，尽管果蝇缺乏典型的DNA甲基化机制，但已有报道某些内分泌干扰化学物质在哺乳动物中通过DNA甲基化介导跨代效应。例如，产前暴露于丙基对羟基苯甲酸被证明会降低小鼠F1-3代的卵巢储备，与Rhobtb1位点的持续低甲基化有关（Li等人，2025年）。尽管不同分类单元中的表观遗传记忆的分子载体可能不同，但这些发现共同强调了环境暴露可以在后代生理中诱导稳定的、可遗传的变化。

为了直接测试SB在果蝇中的跨代效应是否由表观遗传继承引起，未来的工作应该结合假设驱动的方法。例如，交叉寄养，将胚胎在SB暴露和对照组母亲之间交换，将有助于区分真正的生殖细胞传递和母体供给改变的间接效应。同时，针对生殖细胞的表观基因组分析，特别是针对TOR和CAT位点的分析（例如，ChIP用于组蛋白修饰），可以揭示它们的持续失调是否根植于染色质水平的变化。这些实验将超越相关性，提供关于父母环境暴露如何塑造后代基因表达的机制性见解。这项研究的一个关键限制是使用了2000 ppm的单一高浓度SB，这超过了典型的人类饮食暴露水平。虽然这个剂量是基于其在我们之前的工作中能够引发强烈表型效应的能力选择的，但由于缺乏剂量-反应分析，我们无法得出关于观察到的跨代效应的阈值或环境相关性的结论。未来的研究需要使用一系列环境上合理的浓度，以确定在较低剂量下是否会发生更微妙但生物学上显著的跨代影响。

作者贡献
DSZ和QXP参与了研究的构思和设计。YLD和CJX进行了实验。YLD、BBD和DSZ收集并分析了数据。YLD撰写了手稿。CJX、BBD、HLL、SJZ、DSZ和QXP审阅并完善了手稿。所有作者都参与了手稿的修订、阅读并批准了提交的版本。

补充信息
补充表1：本研究中用于qRT-PCR的引物序列。

资助
这项研究得到了山东省自然科学基金（项目编号：ZR2020QC241、ZR2023QC068）、山东省优秀青年学者自然科学基金（项目编号：ZR2022YQ34）、国家自然科学基金（项目编号：12105163、32302975）、山东省青年创新团队项目（项目编号：2023KJ142）以及恒水大学自然科学研究项目（项目编号：2023hbxczx2–6）的资助。

CRediT作者贡献声明
Yuling Dong：写作——原始草稿、可视化、软件、方法学、资金获取、正式分析、数据管理。
Beibei Du：写作——审阅与编辑、可视化、方法学、正式分析。
Changjian Xie：写作——审阅与编辑、验证、资金获取、正式分析。
Shujing Zhang：写作——审阅与编辑、资金获取。
Hongliang Liu：写作——审阅与编辑、资金获取。
Desheng Zhang：写作——审阅与编辑、监督、概念化。
Qiuxiang Pang：写作——审阅与编辑、监督、概念化。