基于DNA Walker的双信号放大纳米孔传感器能够实现卡那霉素和托布霉素的同时检测，并具备超高灵敏度

《Chemical Engineering Journal》：Dual-signal-amplified nanopore sensor based on a DNA Walker enables simultaneous and ultrasensitive detection of kanamycin and tobramycin

本研究开发了一种基于DNA walker与α-血红溶素纳米孔的集成检测平台，实现卡那霉素（KAN）和妥布霉素（TOB）的飞摩尔级同步检测。通过aptamer触发DNA walker的催化 cleavage释放大量探针，结合纳米孔单分子电信号读出，构建了双放大策略，检测限分别为3.88 fM和4.62 fM，并成功应用于环境水样检测。

　　

胡庚辰|刘世昭|张一鸣|姜尧|席东梅

中国山东省肿瘤标志物检测技术重点实验室，临沂大学生命科学学院，276005

摘要

氨基糖苷类抗生素的广泛使用引发了人们对食品安全和环境健康的严重担忧，因此需要先进的检测方法来实现对这些小分子的灵敏和多重检测。然而，传统技术难以以足够的灵敏度和特异性直接定量这些小分子。在这里，我们提出了一种超灵敏且同时检测卡那霉素（KAN）和托布霉素（TOB）的传感平台，该平台将目标触发的DNA步行器与生物α-溶血素（α-HL）纳米孔相结合。在该设计中，适配体识别抗生素后，会激活固定在磁珠上的DNA酶驱动的步行器，后者通过逐步切割轨道链来释放数百个DNA报告探针。这种催化化学放大与单分子物理读出的双重放大策略实现了极高的灵敏度，KAN的检测限低至3.88 fM，TOB的检测限低至4.62 fM。该传感平台表现出优异的选择性，并成功实现了混合物中两种抗生素的同时定量。当应用于添加了目标物质的环境水样时，该方法显示出高准确性和可靠性，回收率令人满意。这项工作建立了一种通用的DNA步行器-纳米孔范式，为开发高灵敏度、多重检测和快速检测系统提供了多功能蓝图，适用于多种小分子污染物。

引言

氨基糖苷类抗生素（AGs）是治疗革兰氏阴性和某些革兰氏阳性细菌感染的重要广谱药物[1]。其中，KAN和TOB在人类医学和兽医实践中被广泛使用[2]，[3]。然而，它们的过度使用导致了严重的后果，包括抗微生物耐药性的出现、环境污染以及通过食物链积累带来的健康风险[4]，[5]，[6]。动物源性产品（如肉类、牛奶）中的残留物可能导致耳毒性和肾毒性[7]，[8]，而含有抗生素的废水会促进耐药细菌和基因的传播，威胁公共卫生[9]，[10]。因此，监管机构（如欧盟法规37/2010、中国GB 31650–2019）制定了严格的最大残留限量（MRLs；例如，牛奶中KAN的限量为150 μg/kg）[11]。为了执行这些限制并降低风险，开发快速、灵敏且可在现场使用的KAN和TOB检测方法对于食品安全、环境监测和公共卫生保护至关重要。

传统的KAN和TOB检测方法，如高效液相色谱（HPLC）[12]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[13]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]和毛细管电泳（CE）[15]虽然成熟，但不适合快速、现场检测。HPLC和LC-MS/MS虽然灵敏且准确，但需要复杂的样品制备过程、昂贵的仪器和专业的操作人员[16]。ELISA虽然用户友好且高通量，但存在抗体依赖性、交叉反应性和高成本的问题[17]。CE需要严格的样品处理，并且在现场应用中缺乏稳健性[18]。因此，迫切需要一种成本效益高、快速、灵敏且特异的传感平台。

纳米孔传感通过提供无标记、操作简单和实时检测的方法，彻底改变了单分子分析[19]，[20]，[21]。α-HL蛋白纳米孔具有约1.4纳米的孔径，能够与移动的单链DNA（ssDNA）产生强烈的相互作用，从而实现分子识别的独特电流阻塞[22]，[23]。然而，像KAN和TOB这样的小分子由于其亚纳米尺寸，产生的信号微弱且短暂，严重限制了直接通过纳米孔检测的灵敏度。为了克服这一问题，提出了“信号转换”策略，将小分子识别转化为可检测的核酸移动事件。

与此同时，DNA纳米技术，特别是DNA步行器，已成为构建超灵敏生物传感器的强大范式[24]，[25]。这些合成分子机器可以沿着设计的核酸轨道自主移动[26]，[27]。在目标识别触发下，步行器链会逐步移动，通过酶促切割或链位移释放大量报告分子，从而实现显著的信号放大[28]，[29]，[30]。因此，将DNA步行器的优异放大能力与纳米孔传感的单分子精度相结合，可以弥合小分子检测的灵敏度差距，并实现多重分析。这种多重检测策略相对于其他多抗生素检测平台具有更高的灵敏度[31]。体外选择的核酸适配体（例如通过SELEX）对多种目标具有高亲和力，在稳定性、模块性和成本方面优于抗体，使其成为理想的识别元件[32]。它们已被与纳米孔结合用于检测小分子[33]，[34]，[35]，如农药[36]、赭曲霉毒素A[37]和可卡因[38]。值得注意的是，使用专用纳米孔（PaMscS）[39]已经检测到了氨基糖苷类（如庆大霉素），而四环素则通过固态纳米孔检测[40]。此外，纳米孔测序还可以识别病原体和耐药基因[41]。尽管这些进展突显了纳米孔在抗生素监测中的潜力，但尚未实现将基于适配体的DNA步行器与经典α-HL纳米孔结合的集成平台，以实现多种氨基糖苷类的同时超灵敏检测。

在这里，我们报告了一种超灵敏且快速的传感平台，该平台将适配体触发的DNA步行器与α-HL纳米孔结合，用于同时检测KAN和TOB。核心设计包括一个固定在磁珠上的DNA步行器（MB-WT），目标结合后激活DNA酶驱动的步行器链。这会触发沿轨道的自主移动，切割RNA位点并释放大量针对每种抗生素的DNA报告探针。然后通过α-HL纳米孔的特性移动特征将这些探针分离并检测出来。通过优化关键参数，我们实现了飞摩尔级别的检测限和对干扰抗生素的优异选择性。该传感器在添加了目标物质的环境水样中表现出可靠的性能，显示出高回收率和精度。除了检测AGs外，这项工作还建立了一种通用的DNA步行器-纳米孔集成范式，为食品、环境和临床环境中多种小分子污染物的通用超灵敏检测铺平了道路。

试剂和材料

1,2-二苯甲酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（氯仿，≥99%）购自Avanti Polar Lipids Inc.（美国阿拉巴斯特，AL）。癸烷（无水，≥99%）、EDTA（乙二胺四乙酸，≥99%）和金黄色葡萄球菌 α-溶血素（α-HL，冻干粉）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯，MO）。链霉亲和素包覆的磁珠购自上海贝泰时间生物技术有限公司（中国上海）。KAN、TOB、链霉素（STR）、庆大霉素（GEN）

DNA步行器-纳米孔传感器的工作原理和设计

我们用于检测KAN和TOB的集成DNA步行器-纳米孔传感器的操作原理如图1所示。传感平台以固定在链霉亲和素包覆的磁珠上的DNA步行器系统为中心，并与α-HL纳米孔集成以实现最终读数。在其预组装状态下，两个生物素化的DNA组分共同锚定在磁珠上：一个步行器链（Ws），其中包含DNA酶核心，最初通过与互补序列杂交而处于非活性状态

结论

我们开发了一种超灵敏的传感平台，该平台将适配体触发的DNA步行器与α-HL纳米孔结合，用于同时检测KAN和TOB。核心创新是一种双重放大策略：目标结合启动催化DNA步行器的操作，每次识别事件释放数百个DNA报告探针，这些探针在纳米孔移动过程中被单独计数为特征性的电信号。该传感器表现出优异的性能

CRediT作者贡献声明

胡庚辰：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理，概念化。刘世昭：方法学，正式分析。张一鸣：研究，正式分析。姜尧：撰写——审稿与编辑，验证，监督，方法学。席东梅：撰写——审稿与编辑，可视化，监督，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了山东省泰山学者基金会（编号：tsqn202211241）、国家自然科学基金（编号：22276085、22274068）和临沂市重点研发项目（编号：2023025）的支持。