固定化脂肪酶在利用鱿鱼内脏生产Ω-3油脂中的重复利用率

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Reusability of immobilised lipase in the production of omega-3 oils from squid viscera

　　摘要
鱿鱼内脏是鱿鱼加工过程中的废弃物，是一种富含Omega-3脂肪酸的海洋资源，适合用于营养补充剂。在食用之前，需要提取鱿鱼内脏油并中和其中的游离脂肪酸。固定化脂肪酶（Lipozyme RMIM）适用于这种绿色中和方法，具有高酰基甘油产率、高氧化稳定性和保持抗氧化剂虾青素的能力。该方法的长期有效性取决于脂肪酶在多个反应周期中的稳定性和重复使用性。为了评估其稳定性，本研究在一个定制的单升反应器中监测了Lipozyme RMIM在35次连续循环使用过程中的性能。与单次使用成本相比，这种方法将酶的成本有效降低了2.9%。研究发现，在最佳反应条件下，第一次循环中原油中最多97%的游离脂肪酸被转化为酰基甘油；经过35次循环后，这一比例降至86%。每次循环后酶活性的部分损失可能是由于酶的展开和聚集，以及树脂的物理断裂和分解所致。

关键点
• 固定化Lipozyme RMIM能够有效中和鱿鱼油，可重复使用32次
• 重组酯化鱿鱼油的脂肪酸组成在多次循环中保持一致
• 酶的变性和载体分解导致了脂肪酶性能的变化

引言
富含脂肪的鱼类和藻类是长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）的主要膳食来源，包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）（de-la-Haba等，2023；Osman等，2001；Sahena等，2009）。研究表明，EPA和DHA有助于预防某些疾病，包括慢性疾病如癌症、高血压、抑郁症和心血管疾病（Ciriminna等，2017；Taati等，2018）。EPA和DHA还能降低血浆中的甘油三酯（TAG）和胆固醇水平，并有助于预防糖尿病和缺血性心脏病（Bang等，1971；Perez-Velazquez等，2024）。鱼油被广泛用于补充EPA和DHA的摄入量；然而，由于供应日益稀缺，人们对可持续替代来源（如微藻和渔业副产品）的兴趣日益增加（Aitta等，2021；Fauziah等，2024；Zhang等，2021）。例如，鱿鱼加工产生的内脏副产品中含有约10%的油脂，其中EPA占比13-20%，DHA占比20-30%（Kang等，2005；Quispe-Fuentes等，2025），使其成为Omega-3和DHA的极佳来源。

鱿鱼内脏油中的游离脂肪酸（FFA）含量可高达45%，这会影响其稳定性，因此需要中和处理以生产营养油（Kolanowski和Laufenberg，2006；Meivelu Moovendhan等，2023；Rodríguez等，2021）。传统的碱 refined 方法存在缺点，如因游离脂肪酸的去除而导致的产率低下，以及鱿鱼中天然存在的抗氧化剂虾青素的损失（Mariem和Fatima，2017）。本研究中采用的酶促甘油水解法是一种更环保的替代方法，它将游离脂肪酸整合到甘油三酯中，而非去除它们，并已成功应用于植物油、金枪鱼油、凤尾鱼油和鱿鱼油，且不会损失产率（Akanbi和Barrow，2015；Baeza-Jiménez等，2013；Mustafa等，2023；Rubio-Rodríguez等，2010）。这种方法因具有高催化效率和温和的反应条件而受到青睐。在之前的研究中，我们开发了一种实验室和试点规模的方法，使用固定化的Rhizomucor miehei脂肪酶（Lipozyme RMIM）将鱿鱼油中的游离脂肪酸含量从44%降低到4%（Haque等，2024；Joshi等，2025）。该方法显著提高了油的氧化稳定性（rancimat测试中为0.06至18.9小时），并且在降低游离脂肪酸含量后未损失虾青素含量（194.1 μg/g）（Joshi等，2025）。所使用的Lipozyme RMIM是通过吸附作用固定在聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）树脂载体上的1,3-特异性脂肪酶。与非区域特异性的Candida antactica脂肪酶B（CALB）相比，我们选择了这种催化剂，因为它在较低温度下反应更完全，从而更加节能（Haque等，2024）。尽管sn-2位置没有发生直接转化，但RMIM的区域特异性并未对产率产生不利影响。酰基迁移对最终产品油的影响不大，EPA优先分布在sn-2位置，而DHA则保留在自然存在的sn-2位置，这有利于提高了油的生物利用度和稳定性（Joshi等，2025）。虽然该方法能够有效中和鱿鱼油，并获得高酰基甘油产率和保留大量虾青素，但脂肪酶在多个反应周期中的稳定性和重复使用性尚不清楚。这些信息对于该过程的可行性至关重要，因为其依赖于多次重复使用相对昂贵的固定化酶，从而分摊酶的成本（Mustafa等，2023）。

固定化酶通常比自由酶更耐受环境变化，更适合用于油-醇（尤其是甘油）的酯化反应（Homaei等，2013；Sheldon等，2021）。本研究的目的是探讨固定化Lipozyme RMIM在多次循环中使用游离脂肪酸与甘油反应，将高FFA含量的鱿鱼内脏油转化为酰基甘油含量超过95%的产品时的重复使用性和性能。我们还评估了每次循环中的活性损失及其原因。了解固定化Lipozyme RMIM的重复使用性是确定商业规模Omega-3油生产可行性的关键因素。识别酶活性损失的原因也有助于未来改进酶反应器的设计（Joshi等，2025）。先前使用Lipozyme RMIM的研究显示，其稳定性从仅2次循环到4次、5次、9次甚至超过20次循环不等，具体取决于反应器的设计和反应条件（Arifin等，2012；Castiglioni等，2020；Kuo等，2012；Nadiah等，2024）。因此，本研究的目的是确定这种酶在中和高游离脂肪酸含量油中的重复使用性。

可能影响酶重复使用的因素包括酶载体的稳定性、酶-载体键的强度以及酶结构的保持情况。在常规搅拌条件下，酶载体容易迅速分解，为了最小化机械降解，我们在一个定制的单升反应器中进行反应，酶反应区与上方搅拌器分开（Haque等，2024）。除了反应产率外，我们还通过观察酶结构和树脂性质的变化来监测多次循环中的酶质变化。

材料与方法
原始鱿鱼内脏油由澳大利亚North Geelong的Mantzaris Fisheries Pty Ltd提供。原油的酸值为62 mg KOH/g（Hassan等，2020），过氧化值为2.1 mEq/kg（AOAC，2000）。甘油购自澳大利亚Melbourne的EnviroChem International Pty Ltd；固定化酶（Lipozyme RMIM，诺维信公司，丹麦；活性为275 Interesterification Unit/g）购自澳大利亚Victoria的Oppenheimer Pty Ltd。分子筛（3 ? beads，8–12 mesh）、HPLC级己烷、庚烷、硫酸铜、酒石酸钾、乙酰氯、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）、2,6-二叔丁基-4-甲基酚（BHT）、月桂酸甲酯和乙醚均购自澳大利亚Castle Hill的Sigma Aldrich。丙酮、氢氧化钠、脱氧胆酸钠、氯化钠和甲醇购自澳大利亚Gillman的Chem Supply；甲苯购自Thermofisher Scientific Australia。TLC标准品由Nu-Chek Prep提供，用于鉴定各类脂质。

鱿鱼油的酶促酯化
鱿鱼内脏油的酯化反应在1升反应器中进行，具体操作方法如前所述（Haque等，2024）。首先将2.5%（m/v）的酶与油和甘油以3:1的比例（m/v）混合，并加入1%（m/v）的分子筛。分别在2小时、4小时和6小时时再加入额外的甘油（10%、7.1%和7.1% v/v）。反应在50°C下进行8小时，搅拌速度为400 rpm。每个循环结束后，移除液体内容物，并重新加入新鲜底物进行酯化。总共完成了35次循环，每次循环使用相同的酶。

脂肪酶失活动力学的建模
Lipozyme RMIM的失活动力学通过一级失活模型进行描述（Kabir和Ju，2023；Zhang等，2010）。该模型使用了每个循环的实际转化数据进行了拟合。使用第12、18、24、30和35次循环的转化数据计算失活速率常数。

根据一级失活模型：
$$\begin{array}{l}\frac{dA}{dt}=-K_{in}A\\A=Aoe^{-kint}\;\left(by\;integrating\right)\end{array}$$ (1)
$$In\left(\frac A{Ao}\right)=-K\mathbf{in}t\;\left(In\;\log arithmic\;form\right)$$ (2)
其中A是时间t时的酶活性，Ao是初始酶活性；Kin是失活速率常数（循环^-1）。

酶的采样与分析准备
在12、18、24和35次循环后，分别采样了约12%（m/m）的酶。在第一次循环前加入了过量的酶（如前所述，2.5% m/v的酶与底物混合），以确保反应器中有足够的酶进行催化和采样。根据之前的优化研究结果（Haque等，2024），假设过量的酶对产率没有影响。本研究确定1%（m/v）的酶与底物体积的比例是最佳浓度，更高浓度对游离脂肪酸转化为酰基甘油的转化性能没有显著影响（Haque）。此外，假设从反应器中采样酶不会影响每个循环的反应产率。然而，采样酶会逐渐影响酶在反应器内的分布和整体流体流动，这可能会增加后续循环中剩余酶颗粒的机械应力，从而导致固体载体的更快破坏。因此，本研究中可能低估了酶的重复使用性。在收集酶样本之前，将反应器倒置过夜以完全排空油和甘油。酶被 trap 在倒置反应器顶部的网筛中，确保反应介质完全排出，以避免对酶活性产生不利影响。收集12%（m/m）的酶样本，并用n-庚烷彻底清洗两次以去除残留的油分，然后在室温下干燥。部分样本酶用研钵和杵研磨。整个酶和研磨后的酶都保存在0°C的棕色玻璃瓶中以备后续使用。剩余的酶未经洗涤直接用于后续循环。

通过TLC–FID（Iatroscan）鉴定脂质类别
脂质类别的分析采用Akanbi等（2013）描述的方法进行。

通过ANS荧光光谱测定表面疏水性变化
由于每次循环可能导致酶的展开和变性，通过8-氨基-1-萘磺酸（ANS）荧光光谱测量了表面疏水性的变化（Haque等，2013；Joshi等，2011）。将干燥的酶粉末（原始和使用后的）稀释至1 mg/mL浓度，在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。使用Varian Cary Eclipse荧光分光光度计测量ANS结合物的荧光强度（FI）和发射波长。使用公式（3）计算每个浓度的相对荧光强度（RFI）：
$$RFI=\left(F_S-F_O\right)/\left(F_O\right)$$ (3)

使用显微镜观察酶载体材料的物理变化
使用Zeiss HBO 100显微镜和附带的ZEISS Axio Imager观察反应循环过程中酶载体材料的物理变化。视频和图像使用内置的AxioVision 4.7.1软件进行处理。对清洗过和未清洗的样本均进行了成像。对于未清洗的样本，使用Low lint wipes（Kimtech Delicate Task Wipers）尽可能去除附着的表面油。原始酶和使用后的酶分别以单个颗粒和颗粒群的形式进行成像，放大倍数为5×/0.13。

使用FTIR光谱监测酶结构变化
FTIR光谱数据重复三次测定，以量化多次循环中酶二级结构的变化。使用Bruker Alpha-p ATR-FTIR仪器获取FTIR光谱。样品粉末用含有100 mM氯化钠（NaCl）的去离子水稀释至15 mg/mL（m/v）（Haque等，2014；Weert等，2001）。使用了一种硫酸三甘氨酸（TGS）检测器来扫描从650到4000 cm?1范围的样品。扫描速率为0.2 cm/sec，分辨率为4 cm?1，共收集了8次扫描数据。样品的去基线光谱分析使用了Opus 7.5软件和PeakFitv4.12软件进行。采用局部最小二乘（LLS）算法对酰胺区域I（1600–1700 cm?1）的光谱进行拟合，且未使用高斯形状进行平滑处理。二级结构类型（α-螺旋、β-折叠、β-转角和随机卷曲）的推断使用了公式（4）（Haque等人，2015年；Yazdanpanah和Langrish，2013年）。
$$\text{二级结构比例}(\%) = \frac{A_{\text{ind}}{A_{\text{all}} \times 100}$$ （4）
其中$A_{\text{ind}}$是酰胺I带内所有二级结构元素的总面积，$A_{\text{all}}$是酰胺I带内所有二级结构的总面积。

二级结构元素的位置识别参考了（Kong和Yu，2007年；Natalello等人，2005年）的建议。1620至1640 cm?1波段的谱带被归类为β-折叠。1641至1647 cm?1波段被归类为随机卷曲。1648至1660 cm?1波段被归类为α-螺旋。同样，1663 cm?1、1671 cm?1、1683 cm?1和1688 cm?1波段被归类为β-转角。1691 cm?1附近的谱带被估计为β-折叠（高频）。1600至1619 cm?1之间的峰被忽略，因为它们是由芳香侧链产生的（Byler等人，1986年；Ngarize等人，2004年）。

通过PeakFit V412软件的谱带拟合技术量化了酶的二级结构变化。

**用于检测鱿鱼油产品中酶存在的改良Biuret试验**
Biuret试剂由硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钠组成，在酶存在的情况下，会在水溶液中产生深蓝色。改良的Biuret方法已成功应用于高脂肪样本（如肾脏、心脏和大脑）中的蛋白质定量（Beyer，1983年）。在本研究中，每份油样取2 mL，加入3 mL溶剂混合液（丙酮/己烷1:1）。然后将试管涡旋20秒。接着向试管中加入2 mL水溶液Biuret试剂和0.1 mL 10%脱氧胆酸钠（pH 8.0）。手动充分混合后，将试管置于沸水中30秒或直至颜色完全显现。之后将内容物冷却至室温，并拍照以定性评估酶是否渗入鱿鱼油产品中。

**通过GC-FAMEs监测产品的脂肪酸组成**
酯化后油样的脂肪酸组成是通过气相色谱-脂肪酸甲酯（GC-FAMEs）结合火焰离子化检测器（FID）来确定的（Akanbi和Barrow，2016年）。GC脂肪酸标准品是由Nu-Chek Prep（美国明尼苏达州Elysian）提供的34种饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸混合物，碳链长度从4到24。内标物乙酰氯和BHT来自Sigma Aldrich（澳大利亚Castle Hill）。

**统计分析**
每项分析至少重复进行了三次，平均值在后续部分报告。数据分析使用了仪器的内置软件，数据的平均值和标准差使用Microsoft Excel Professional Plus 2019计算。这些分析采用了95%的置信水平（p < 0.05）。

**酶催化的酯化反应在多个循环中的产率**
提供的原始鱿鱼内脏油中含有41.6%的三酰甘油（TAG）、40.3%的游离脂肪酸（FFA）、10.1%的二酰甘油（DAG）和5.5%的单酰甘油（MAG）。监测了FFA转化为酰基甘油的循环间转化率，共进行了35次反应，结果在图1a中展示，并调整以表示原始鱿鱼油的FFA含量为100%。第一次循环后，产物油的脂质组成为27.10% TAG、3.03% FFA、48.11% DAG和21.47% MAG（图1b），转化率为96.97%。到第13次循环时，转化率下降至92.81%（29.46% TAG、5.95% FFA、42.23% DAG和19.4% MAG）。有趣的是，从第14次循环开始，酶的性能有所提升，到第23次循环时达到95.92%（23.79% TAG、3.08% FFA、47.18% DAG和23.21% MAG）。随后性能逐渐下降，到第33次循环时降至90.09%，第35次循环时降至86.14%（30% TAG、23.86% FFA、30.78% DAG和13.12% MAG）。前27次循环中产物油的FFA含量低于6%，然后在35次循环后稳定上升至23.86%。每次循环后产物油的TAG含量在23%到30%之间；DAG含量从第1次循环的47.2%显著下降至30.78%，MAG含量从21.46%下降至13.12%。由于下一节描述了固定化酶系统的不可逆降解，我们没有继续进行第35次循环后的分析。从第1次循环到第35次循环观察到显著差异（p < 0.05），以及产物油中FFA含量的急剧增加。

**图1**
**全尺寸图片**

**通过(a) 35个循环中游离脂肪酸的转化百分比和(b) 每个循环中脂质类别变化的Lipozyme RMIM性能**。从第1次循环到第35次循环，观察到酶活性显著下降（p < 0.05）。误差条代表每次循环中油谱三重复测量的分析变异性。

**酶失活建模**
每个循环的失活率常数在图2中展示。在循环12、18、24和30时观察到一线性曲线，Kin值的变化率最小，范围为?0.00025至?0.0003。在第35次循环时观察到更显著的下降至?0.00043。每个循环（12、18、24和30）的速率常数根据趋势线进行了线性拟合，R2值为0.954。估计的速率常数反映了我们使用的酶在第30次循环及以后的转化性能。通常酶的失活率常数会因环境因素、酶结构变化或失活机制的复杂性而随时间变化（Sadana，1988年）。

**图2**
**全尺寸图片**

**多个反应循环中酶表面疏水性的变化**
ANS荧光探针能够与实验溶液中的酶疏水部分结合（Deshpande和Sathe，2018年；Guliyeva和Gasymov，2020年）。在酶的天然状态下，亲水部分留在表面，而疏水部分被埋藏，这解释了天然固定化酶相对较低的荧光强度（图3）。第18至24循环中相对荧光强度显著增加，然后在第35循环时减少（图3）。

**图3**
**全尺寸图片**
**通过ANS荧光光谱测量，随着反应循环次数的增加，固定化RMIM表面疏水性的变化。误差条代表每次循环中固定化RMIM三重复测量的分析变异性**

**酶逐渐发生不可逆变性导致性能下降**
从第24循环开始，由于酶的不可逆变性，性能下降，表现为荧光强度的降低（图3）。

**固定化酶颗粒的形态变化**
图4比较了随着反应循环次数增加，固定化酶颗粒的结构变化。在第12、18和35循环后收集的酶颗粒未经清洗或干燥直接成像。去除了附着在酶上的油，从不同反应循环中随机选取了至少10个颗粒进行观察。图4展示了每个采样循环（循环0、12、18和35）的代表性图像。酶的涂层表现为围绕红色树脂核心的黑色环状结构。整个Lipozyme RMIM涂层球的直径在500到1000 μm之间，厚度比约为55:45（酶/核心）。在循环35的图像中，酶的核心已经破碎。

**图4**
**全尺寸图片**
**随着反应循环次数增加，固定化RMIM酶颗粒的显微图像**

**图5**
**展示了用正庚烷洗涤并风干后的固定化酶颗粒。这些颗粒与原始固定化酶进行了比较。原始酶呈光滑的球形，但在12循环后开始出现破裂迹象。经过24循环后，大量颗粒发生断裂；到35循环后，不可逆降解现象明显**。

**图5**
**全尺寸图片**
**在不同循环水平下，光学显微镜下的酶颗粒形态变化**

**Lipozyme RMIM二级结构的变化**
先前的研究确定酰胺-I区域（1600至1700 cm?1）是研究和比较二级结构最可靠的红外吸收区域（Fu等人，1994年；Weert等人，2001年）。这些元素在不同反应循环中的二级结构变化在图6中展示。原始Lipozyme RMIM的二级结构计算包含18.38%的α-螺旋、15.41%的β-折叠、60.67%的β-转角（低频）和5.54%的随机卷曲。经过12循环后，α-螺旋和β-折叠结构增加，而β-转角减少，随机卷曲完全消失（27.02% α-螺旋、20.61% β-折叠（低频）和11.26% β-折叠（高频），以及41.11% β-转角和0%随机卷曲）。这种组成在第18循环后保持相对稳定（25.54% α-螺旋、21.38% β-折叠和10.59% β-转角，以及41.49% β-转角和0%随机卷曲），在第24循环后也是如此（26.05% α-螺旋、20.46% β-折叠、41.12% β-转角和0%随机卷曲）。

**图6**
**全尺寸图片**
**使用FTIR光谱峰值拟合软件，量化(a) 原始（带有原始和拟合光谱示例）和(b) 12循环及(c) 35循环后使用酶的酰胺I区域上的二级结构元素。上述每个FT-IR光谱都是三重复测量得到的，代表了一次实验的均值**

**经过34循环后，α-螺旋和β-折叠的比例更高，而β-转角的比例降低（34.21% α-螺旋、22.13% β-折叠，高频略有下降，38.34% β-转角和0%随机卷曲）**

**监测酶-树脂的粘附情况**
改良的Biuret试验用于定性指示酯化鱿鱼内脏油中的蛋白质存在。图7显示每个试管中有两层明显的层：上层是油-溶剂层，下层是蛋白质/试剂层。蓝色试剂层表明存在蛋白质。各层颜色强度恒定且在整个循环过程中没有蓝色出现，表明酶没有迁移到油中，基本保留在固定相中。

**图7**
**全尺寸图片**
**改良Biuret蛋白质试验用于观察多个循环后酯化油产品中酶的存在**

**再酯化鱿鱼油的脂肪酸组成**
通过气相色谱-脂肪酸甲酯（GC-FAMEs）结合火焰离子化检测器（FID）确定了酯化后鱿鱼油的脂肪酸组成（Akanbi和Barrow，2016年）。GC脂肪酸标准品是Nu-Chek Prep（美国明尼苏达州Elysian）提供的34种饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸混合物，碳链长度从4到24。内标物乙酰氯和BHT来自Sigma Aldrich（澳大利亚Castle Hill）。

**讨论**
已知鱿鱼内脏油天然含有较高水平的FFA，这很可能是由于内脏中内源酶的作用。我们原油中的脂质类别水平与先前报道的结果一致（Kim等人，1997年），其中Illex argentinus的鱿鱼内脏油含有约43.0% TAG、28.0% FFA、7.5% DAG和5.5% MAG。本研究中酶催化酯化的目的是通过FFA与甘油的反应，将高FFA含量的内脏油转化为酰基甘油含量超过95%的产品（包括DAG和MAG）（Haque等人，2024年）。本研究中固定化脂肪酶RMIM在35个循环中的重复使用性显著提高了其可行性，超过了之前研究中对其他鱼类和ω-3油的稳定性（Liu等人，2024年；Marín-Suárez等人，2019年）。例如，重复使用固定化脂肪酶35次后，每次循环更换酶的成本仅为计算成本的2.9%。假设Lipozyme RMIM的成本为每公斤650美元，装载浓度为1%（m/v），那么在35次运行中，每升鱿鱼油产品的酶使用成本仅为0.19美元；而如果每10个循环就更换一次酶，成本则为每升0.65美元。酶的更高稳定性很可能归功于我们定制设计的反应器，该反应器能够将酶与搅拌用叶轮叶片隔开（Haque等人，2024年；A. Joshi等人，2025年）。此外，每次循环之间不进行洗涤步骤，避免了酶颗粒周围形成疏水性或亲水性障碍层（Keng等人，2008年）。每次循环后，反应介质中的酶会完全排出，以确保其活性不会因缺乏洗涤而受到不利影响。

酶通过几个阶段在外部应力的作用下逐渐达到不可逆的变性状态。文献中明确描述了这一两步变性过程（Parris和Baginski，1991年；Sava等人，2005年）。第一步中，蛋白质在相对较低的压力下部分展开并丧失其三级结构。这一过程通过初始酯化反应期间游离脂肪酸产量的下降得以观察（直到第14个循环）。从第15个循环到第23个循环，大量酶部分展开并灵活地附着在断裂或部分损坏的载体上，形成疏水口袋并与ANS结合，从而增强了荧光发射。这证实了酶处于熔融球状状态，此时酶缺乏紧密堆积、灵活性以及反应活性（Haque等人，2013年；Parris和Baginski，1991年）。在这种更活跃、更灵活的状态下，酶的转化性能可能得到提升。在第二步中，如果持续施加压力，蛋白质会完全展开。第35个循环时荧光发射的减少表明酶发生了不可逆的变性。完全展开的多肽最终会形成蛋白质聚集体，减少了游离疏水基团的数量，从而导致荧光发射减弱（Park等人，2011年；Ptitsyna和Uversky，1994年）。这种聚集状态是这些生物分子失去正常功能的标志。

之前已有研究报道了颗粒破碎和酶活性变化的现象（Bolivar等人，2022年；Sabbani等人，2006年）。我们观察到，随着循环次数的增加，原本紧密固定的树脂核心逐渐松动并破裂。这种颗粒破碎使得颗粒尺寸减小，可能促进了质量传递的改善，从而导致本研究第14至23个循环间生物活性的明显提升（Bolivar等人，2022年）。到第35个循环时，具有较薄涂层的酶球体比例增加，出现了许多破裂的树脂颗粒和碎片化的核心。这种不可逆的降解解释了观察到的酰甘油产量的显著下降。图像中的黑色凝块可能是从树脂中脱落的酶聚集形成的。随着循环次数的增加，蛋白质的二级结构发生了变化，表现为α-螺旋和β-折叠结构的转变，这与蛋白质的展开和随后的聚集过程一致。虽然未找到直接比较Lipozyme RMIM与其他文献中报道的直接研究，但这一组成与Antarctica假丝酵母（Candida antarctica）固定化脂肪酶B（CALB，约31% α-螺旋和约19% β-折叠）以及重组Rugosa假丝酵母脂肪酶（23.80% α-螺旋和23.40% β-折叠）的数值相符（Mei等人，2003年；Natalello等人，2005年）。Tatham等人（1985年）的先前的工作报告称，β-转角是柔性结构，在多肽折叠中起关键作用，并对α-螺旋和β-折叠的取向有重要影响。由于β-转角和随机卷曲的灵活性和不稳定性质，这两种结构元素的变化速度比由多个氨基酸连接的α-螺旋和β-折叠更快。因此，在本研究中，随着反应循环的进行，β-转角的比例减少，而α-螺旋和β-折叠的比例增加。鱿鱼油产品的脂肪酸组成与先前报道的数值相当（Asadpour，2016年），其中PUFA/MUFA/SFA的含量分别为40.2±2%、23.7±3%和29.4±2%。随着酶循环次数的增加，鱿鱼油的酯化过程并未显著改变这些比例（p > 0.05），说明ω-3脂肪酸是稳定的。在整个35个循环中，EPA和DHA的含量与内脏油中的水平一致（p > 0.05）（Kang等人，2005年）。

总体而言，我们的研究发现表明，活性的逐渐丧失与酶的变性和载体的降解有关。在循环次数较多时，载体的降解成为主要因素，这说明改进反应器设计以进一步限制载体移动可能有助于提高酶的重复使用效率。在本研究中，取样时移除酶可能增加了酶在反应腔内的移动。这表明本研究中固定化RMIM的寿命可能被低估了。此外，使用更耐机械性的食品级载体可能允许进一步的循环重复使用。

结论：固定化Lipozyme RMIM至少适用于30次重复循环，用于将游离脂肪酸转化为三酰甘油。在整个30个循环中，转化率保持在90%以上，到第35个循环后降至86.14%。将酶重复使用35次后，成本仅降至初始成本的2.9%，相比每次循环都更换催化剂，取得了显著的成本节约，对大规模应用非常有利。脂肪酶性能的变化归因于酶的变性和载体的降解。酶的变性过程表现为从α-螺旋和β-折叠结构向聚集状态的转变。虽然观察到酶进入油中的情况，但在前32个循环中，酶的活性大多得以保留。本研究的结果可以为改进反应器设计提供指导，以减少工艺开发和放大过程中对酶的机械应力。