全氟辛烷磺酸（PFOS）和环境微塑料对Mytilus galloprovincialis幼虫发育的影响：跨学科研究方法

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Impact of perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) and environmental microplastics on Mytilus galloprovincialis larval development: Cross-disciplinary approach

　　西琳·阿拉亚（Sirine Alaya）| 伊莱夫·罗姆达尼（Ilef Romdhani）| 胡卢德·布卡迪达（Khouloud Boukadida）| 阿赫勒姆·萨努恩（Ahlem Sahnoun）| 西瓦尔·阿布达（Siwar Abouda）| 约斯拉·米萨维（Yossra Missaoui）| 拉法埃莱·博尼（Raffaele Boni）| 马西莫·文迪蒂（Massimo Venditti）| 塞尔吉奥·米努奇（Sergio Minucci）| 亚历山德拉·加洛（Alessandra Gallo）| 穆罕默德·班尼（Mohamed Banni）

突尼斯苏塞大学高等农学研究所农业生物多样性与生态毒理学实验室

**摘要**
由于环境微塑料（EMPs）和全氟辛烷磺酸（PFOS）在水生环境中的广泛存在和持久性，了解它们对海洋物种发育的影响至关重要。本研究首次探讨了EMPs和PFOS对Mytilus galloprovincialis幼虫早期发育的综合影响，重点关注幼虫质量、壳生物矿化及细胞凋亡，并探索了这些影响的分子机制。通过剂量-反应分析，确定了诱导幼虫变化的PFOS有效浓度（EC25：3.9 μg/L；EC50：20.45 μg/L）。形态学评估显示出现了显著的发育异常，包括生长停滞和壳畸形，其中在同时暴露于EMPs和20.45 μg/L PFOS的情况下影响最为严重。免疫荧光和分子分析表明，作为关键细胞骨架蛋白的微管表达受到干扰，同时微管和富含组氨酸的糖蛋白（HRG）的转录水平也发生了变化，而这些成分对壳的正常形成至关重要。此外，共同暴露还通过激活细胞凋亡导致了DNA损伤和发育停滞。这些发现强调了EMPs和PFOS对海洋双壳类幼虫的负面影响，对物种生存和生态系统稳定性构成了威胁。解决这些污染问题对于保护海洋生物多样性和维持生态平衡至关重要。

**1. 引言**
多年来，人为来源的新兴污染物排放量不断增加，对周围环境产生了显著影响[1]。这些污染物的广泛存在及其对各种生物的潜在影响引发了全球关注[2]、[3]、[4]。微塑料（MPs）被定义为直径小于5毫米的颗粒，由塑料在环境和生物压力因素作用下破碎形成，已被确认为海洋生态系统的主要污染物[5]。根据其来源，EMPs可分为两类：初级和次级[6]、[7]。EMPs的生物可利用性、组成及其极小的尺寸使其能够被多种海洋生物直接或通过食物链间接吸收[9]、[10]。全球约有700种水生生物受到EMPs的影响[11]，包括双壳类[12]、[13]、海洋蠕虫[14]、[15]以及鱼类[16]、[17]、[18]。关于EMPs（从自然环境基质中收集的塑料颗粒，例如海水、沉积物）与商业生产颗粒相比对水生生物影响的研究正在不断增加[19]、[20]，这反映了迫切需要更好地理解其生物累积机制及其引发的一系列不良影响，从组织病理学和生理紊乱到分子水平的变化[21]、[22]。除了其固有的物理特性外，EMPs还充当有害污染物的复杂载体[23]。由于其疏水表面，EMPs能够有效吸附并转移其他污染物[5]，[24]，如全氟烷基物质（PFAS）[25]。PFAS被称为“永久性化学物质”，在水生和其他环境介质中广泛分布[26]，其特点是高稳定性、两亲性、抗水解、光解和微生物降解[27]。全氟辛烷磺酸（PFOS）是研究最多且在各种环境基质中频繁检测到的PFAS之一，因其环境持久性、在海洋生物中的显著生物累积性及其潜在毒性而受到全球关注[27]、[28]，这归因于其长的全氟烷基链和稳定的碳-氟（CF）键[29]。尽管有法规限制PFOS的使用[28]、[30]，但其在大环境中的持久性仍引发了对其对生物健康危害的担忧[31]、[32]、[33]。研究表明，PFOS会导致多方面的毒性作用，包括生殖毒性[34]、遗传毒性[35]、氧化应激[36]、[37]以及在水生生物（尤其是贻贝[35]）中的神经毒性[38]。Mytilus galloprovincialis贻贝因其对环境压力的耐受性和滤食行为而受到重视，使其成为通过毒性研究评估污染物暴露生态风险的理想模型[39]、[40]、[41]。贻贝采用外部受精的古老繁殖策略，其早期幼虫阶段在开放水域中发育，因此直接易受环境污染物影响[42]。这些阶段是发育、生长和生存的关键时期[43]，对污染物非常敏感，并且在实验室中易于操作，使其成为研究环境影响的宝贵模型[44]。鉴于早期生命阶段是双壳类和其他海洋无脊椎动物生命周期中最脆弱的环节，这种方法提供了快速、高效且具有生态相关性的见解[45]。然而，关于环境微塑料（EMPs）和PFOS组合对早期生命阶段毒性影响的研究仍然相对较少。大多数研究集中在合成微塑料聚合物的影响上[46]。这种方法未能充分反映水生生态系统中的实际污染情况。尽管细胞毒性、遗传毒性和生物矿化被认为是PFOS和EMPs的作用目标，但它们在早期胚胎发育过程中的作用仍知之甚少。据我们所知，本研究是首批评估这两种污染物对M. galloprovincialis贻贝胚胎-幼虫阶段综合影响的之一。本研究旨在评估EMPs和PFOS单独及组合使用对M. galloprovincialis幼虫胚胎毒性和遗传毒性的潜在影响。此外，我们还研究了参与细胞凋亡、细胞骨架组织和壳形成的关键基因的转录表达谱，以阐明这些影响的生理机制。

**2. 材料与方法**
**2.1. 环境微塑料工作溶液的制备**
EMPs是在突尼斯北部的比泽尔特（37°16′25.457′ N, 9°52′38.078′ E）的一片沙滩上收集的，该地区属于高度城市化区域。采样方法遵循美国国家海洋和大气管理局（NOAA）开发的方案，具体细节见Zitouni等人（2021）[48]的描述。收集后，使用电动研磨机将不同形状、大小和颜色的塑料颗粒粗磨至约20,000 rpm。通过30 μm筛网手动过滤，保留直径小于30 μm的颗粒，并使用拉曼光谱（RMS）进行表征，然后用于暴露实验。制备了浓度为50 μg/L的污染溶液，该溶液由浓度为0.5 g/L的储备溶液稀释而成。将所需量的EMPs悬浮在过滤后的海水中（FSW），并通过超声处理30分钟以确保均匀分散。选择此浓度是基于先前评估EMPs对海洋生物毒性的研究结果，认为其在环境上具有相关性[49]。EMPs的聚合物组成和尺寸分布的详细信息见第3.2节和图2.2。

**2.2. 配子收集与受精**
从比泽尔特海岸的自然地点收集成熟的M. galloprovincialis贻贝。实验在3月至4月底进行，此时正值该物种的成熟高峰期和自然繁殖期。在实验室中，将性成熟的M. galloprovincialis贻贝适应一天后，通过交替浸泡在温度为15 ± 2°C和20 ± 1°C的FSW（0.22 μm, 33 p.s.u.）中进行热刺激以诱导产卵。贻贝产卵时，雌性释放橙色卵带，雄性释放白色精子流。将产卵的雌性和雄性贻贝分别置于250 mL的FSW中，温度与贻贝产卵时的温度相同。然后通过100 μm和50 μm的不锈钢过滤器过滤卵子和精子，以去除杂质。在受精前，通过显微镜评估配子的质量，选择最均匀和圆形的卵子以及最具活力和密度的精子。选择三组生物样本进行受精实验，将几毫升精子溶液加入卵子中。成功受精需要每个卵子周围有大约十个精子细胞，这一条件可以通过显微镜观察确定。受精成功的另一个标志是极体球的出现。

**2.3. PFOS对48小时龄幼虫阶段的剂量-反应效应**
在二甲基亚砜（DMSO）中制备了PFOS的储备溶液（Chiron，2037.8-10MG，CAS编号：1763-23-1，浓度：10 mg/mL）。为了测试PFOS对M. galloprovincialis幼虫发育的影响，通过将PFOS储备溶液稀释在预过滤的海水中，获得了五个逐渐增加的名义浓度（1、10、20、50和100 μg/L）。选择这一浓度范围是基于先前涉及环境相关浓度的研究[29]、[30]、[31]。受精后约60分钟，将开始第一次分裂的250–300个受精卵转移到含有2 mL暴露溶液的24孔微孔板（Cellstar, GreinerBio-one）中，每个实验条件重复四次。使用含有0.001% DMSO的孔板作为对照。然后将孔板置于18 ± 1°C的黑暗环境中培养48小时，以达到幼虫发育的D阶段。在这个阶段，幼虫会形成独特的D形壳，因此得名“D-幼虫”。这种形态特征是具有直立的铰链和圆形的腹缘，形似字母“D”。通过倒置显微镜观察并计数每个重复组中的幼虫（放大200倍），使用数字相机和图像采集软件（Axiocam 208 color）来评估D-阶段幼虫的畸形百分比。选择EC25和EC50值来评估分别诱导25%和50%畸形的剂量，用于后续的所有实验。畸形根据三个主要标准进行识别：壳畸形（表现为不规则或不对称的壳发育）、外套膜畸形（外套膜组织异常突出于壳外）以及发育停滞（幼虫未能形成特征性的D形）。

**2.4. 实验设计**
基于PFOS剂量-反应的结果，定义了实验条件，包括PFOS和EMPs的浓度。为了确保污染物之间的适当相互作用，准备了含有指定浓度的EMPs和PFOS的混合污染溶液，并在暴露前放置24小时进行预吸附。在预吸附和暴露期间，悬浮液在温和搅拌下保持，以促进EMPs和PFOS的结合。贻贝胚胎在18°C的黑暗环境中暴露于PFOS和EMPs，单独或组合暴露，条件如下：对照组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；混合组1：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；混合组2：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。本研究中使用的胚胎毒性测试方法详见[52]，将约250个胚胎暴露在24孔板上。为了进行化学分析、转录表达和钙沉积分析，幼虫在相同条件下以每升150,000个的密度培养，并通过空气泵提供通气。每种实验条件重复四次，无论是24孔板还是高密度实验。

**2.5. 贻贝D-幼虫对环境微塑料的吸收**
根据先前描述的方案[53]评估了D-幼虫对EMPs的吸收情况。对于每个样本，使用10%氢氧化钾（KOH）溶液（浓度：1.8 M，密度：2.044 g/cm3）在60°C下消化100,000个幼虫，持续24小时并不断搅拌。消化后，使用50%碘化钾溶液（密度：1.55 g/cm3）进行沉淀步骤，以分离密集颗粒和矿物质成分。所得溶液随后通过三个孔径分别为3 μm、1.22 μm和0.45 μm的Whatman硝酸纤维素滤膜（滤膜直径：47 mm， Healthcare Life Science, UK）过滤。然后使用RMS直接在封闭的玻璃培养皿中收集EMPs，并通过光谱匹配（相似性阈值≥70%）进行鉴定。数据分析进一步通过Labspec6?软件比较获得的光谱进行验证。每个滤膜被分成八个视野，以便全面计数和识别所有存在的EMPs。所得光谱与KnowItAll? Software & Spectral Libraries网站上的聚合物数据库进行比对。重要的是，在最佳条件下，空白和对照过滤器中未检测到任何光谱。2.6. 评估幼虫对PFOS的吸收 使用负电喷雾离子化（ESI）质谱法，按照Gaballah等人（2020年）描述的协议，评估了D-幼虫在48小时暴露后PFOS的积累情况。天然PFAS标准品来自SynQuest和Sigma-Aldrich，碳标记的PFAS13标准品来自Wellington Laboratories。PFOS的储备溶液在95%甲醇和5% 2.5 M氢氧化钠（NaOH）的混合物中制备，并在室温下储存。为了确保分析测量的准确性，每天用甲醇或乙腈制备中间标准品。对于化学分析，将贻贝幼虫进行蛋白质沉淀处理。具体来说，将100,000只幼虫在含有已知PFOS浓度的100 μL 0.1 M甲酸中匀浆。使用含有内标物的400 μL乙腈从匀浆液中沉淀蛋白质，然后在4°C下以14,000 rpm离心15分钟。提取物的一部分（50 μL）用200 μL 0.4 mM甲酸铵溶液稀释。样品和标准品使用Vanquish UPLC和Orbitrap Fusion质谱仪（Thermo Electron）在负ESI模式下进行分析。PFOS [M-H]离子的离子化源设置如下：喷雾电压为-3.5 kV，鞘气为25 AU，辅助气为6 AU，扫描气为0 AU，离子传输管温度设定为300°C，蒸发器温度保持在30°C。2.7. 钙沉积测定 该测定按照Park和Kim（1984年）描述的协议进行，但根据我们的生物模型进行了适当修改。先前用4%甲醛（PFA）固定的幼虫在50%乙醇中重新水化10分钟，然后加入茜素红（0.5% + 1% KOH）。孵育6小时后，用蒸馏水洗涤2-3次以去除多余的色素，然后用含有3%过氧化氢（H2O2）和2% KOH的溶液处理10分钟，接着用20%甘油+0.25% KOH的溶液处理10分钟。加入H2O2溶液5分钟以去除多余的非特异性染色。最后，使用光学显微镜拍摄照片，并根据红色染色的强度使用ImageJ和CASEVIEWER软件分析不同条件下的壳中钙浓度。2.8. 免疫荧光（IF）分析 按照先前建立的协议[56]、[57]进行IF分析，以评估微管蛋白的表达。用0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙固定的D-幼虫，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH：7.1）洗涤，并在0.1% Triton渗透溶液中孵育。然后，用0.25% PBS-Tween洗涤载玻片两次，再用PBS洗涤一次。使用PBS稀释的封闭溶液（5%牛血清白蛋白和20%正常山羊血清）进行封闭步骤，持续2小时，随后用稀释在封闭溶液中的初级抗体（#E-AB-20036；Elabscience Biotechnology，武汉，中国E-AB-20036）孵育过夜（1:50）。然后用PBS-Tween洗涤幼虫两次，再用PBS洗涤一次，接着用二级抗体（1:500）孵育。使用DAPI染色显示细胞核。使用荧光显微镜检查幼虫，并使用ImageJ软件量化荧光强度。2.9. 转录本表达分析 根据Chomczynski和Sacchi（1987年）描述的协议，使用酸-酚-氯仿沉淀法与TRI试剂（Sigma-Aldrich）提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计测量RNA量，并通过1.5%琼脂糖凝胶上的电泳评估RNA质量。使用RNA依赖性DNA聚合酶从先前提取的RNA模板合成cDNA。2 μg的总RNA被逆转录到20 μL的反应混合物中，其中包含随机六聚体引物（Random 6）、dNTPs（0.5 mM）、200 μM V H-RT（逆转录酶）和1× MMuLV H-RT缓冲液[59]。评估了Mytilus galloprovincialis D-幼虫中参与DNA代谢（P53、caspase3、DNA连接酶、Bax和Bcl-2）、细胞骨架组织（微管蛋白）和壳形成（HRG）的关键基因的表达。5 μl的cDNA在定量实时PCR（q-RT-PCR）系统（iCycler，Bio-Rad Laboratories）中扩增，存在1× QuantiTect Sybr Green PCR Master Mix（Qiagen）、10 nM荧光素和每种基因引物0.5 μM（表1）[60]。每个基因的表达水平相对于3个参考基因（18S rRNA、β-actin和riboL27）确定，并归一化到对照组，以评估转录本表达的变化。使用Beacon v3.0软件（Premier Biosoft International, Inc.）为每个基因设计了特定的正向（5′_3′）和反向（3′_5′）引物（表1）。对组平均值进行了随机重新分配测试，以进行统计分析[61]。表1. 用于实时PCR的引物和探针。基因 ID 正向引物 反向引物 HRG (HQ424451.1) GAGCACATTCACTGGTTTCATGCGCTCAAAGCACTGATTTGTTGCACasp3 (HQ424451.1) TGTCTTAGCGTTCTGTATCAGTACAGCTTTCTGCTGGGAAAATGACP53 (KC545827.1) AATGTCACAAGCTTCAGTTTCAACTAGATGTGATGTTTGTGTATCCCCDNA-L (AJ624686.1) CGACAGCCTGAATTGCAGCAGCTGGGGCTTTCTCTCATGGTTCTubulin (AJ516796) GCCAAATCTTCAGACCAGACAACACCTTCTGTGTAATGTCCCTTGGRiboL27 (AJ625928) AAGCCATGGGCAAATTTATGAAAATTTACAATGACTGCTTTACGACCTActin (AJ625116) GTGTGATGTCATATCCGTAAGGAGCTTGGAGCAAGTGCTGTGA18S (L33452) CGGAGAGGAGCATGAGAAACCGTGCCAGGAGTGGGTAATTTBax (KC545830) CCAACAGGTCCACCATTAGAACCTCTTGGCCACAGTTAGGAATGBcl-2 (KC545829.1) GTTAGACTTGCCACCATCACAGTAGCCTCAGTTATGTGTA2.10. 质量保证（QA）和质量控制（QC）措施 实施QA和QC协议以保持样品完整性并防止EMP污染。Milli-Q水溶液在使用前通过硝酸纤维素膜（0.22 μm）过滤，以消除可能由过滤过程产生的任何颗粒污染物。为了最小化污染，实验室工作人员严格遵守协议，穿着实验服以减少合成纤维的引入。避免使用塑料材料，并使用预过滤的Milli-Q水仔细清洁所有实验室工具，以确保无菌并防止交叉污染。2.11. PFOS和微塑料混合物效应的评估 使用独立作用（Bliss，1939）模型量化PFOS和微塑料混合物的预期效应，该模型基于每个组分的单独效应预测混合物的加性效应。然后将预期的加性效应与观察到的效应进行比较，以检测潜在的协同或拮抗作用。该模型假设每种化合物独立作用于感兴趣的终点，为加性相互作用提供参考[62]、[63]。预期混合物效应根据以下公式计算：Emix=1?∏i=1n1?Eci其中Eci表示化合物i相对于对照的比例效应，计算如下：Eci=个体效应?对照最大观察值?对照然后使用Bliss公式（Bliss，1939）计算预期混合物效应：Emix=1?1?E1·1?E22.12. 数据分析 使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad，美国加利福尼亚州圣地亚哥）创建图表，结果以平均值及其标准差（SD）表示。使用SPSS版本20.0进行统计分析，包括Shapiro-Wilk测试以评估数据正态性，Levene's测试以评估方差齐性，然后进行单因素ANOVA和Tukey's事后检验进行多重比较。统计显著性设定为p < 0.05。使用GraphPad（版本9.3.0）确定EC25和EC50，分别定义为导致25%和50%畸形的毒物浓度。使用R软件进行相关性矩阵和主成分分析（PCA）。3. 结果3.1. PFOS的有效浓度：EC25和EC50 对M. galloprovincialis正常幼虫发育的影响研究显示，不同浓度的PFOS（1, 10, 20, 50, 100 μg/L）在48小时胚胎毒性试验中对胚胎-幼虫发育有显著的剂量依赖性影响，表现为随着PFOS浓度的增加，异常D-幼虫的比例上升。我们的结果显示，有效浓度分别为48小时EC25（95% CI：1.65–7.44 μg/L）和48小时EC50（95% CI：8.39–35.74 μg/L），对应的剂量分别为3.9 μg/L和20.45 μg/L，这些剂量分别诱导25%和50%的畸形（图1）。下载：下载高分辨率图像（53KB）下载：下载全尺寸图像图1. 不同PFOS浓度（μg/L）在48小时暴露于PFOS后的M. galloprovincialis幼虫正常发育的影响，数据表示为4次重复实验的平均值，以异常D-幼虫相对于对照的百分比表示。3.2. 环境微塑料的特性 对EMP储备溶液的分析显示每100 μg含有5043.43个EMP。超过3 μm的颗粒占检测到的颗粒的3.27%，而28.28%的颗粒大小在3–1.22 μm范围内，67.73%的颗粒大小在1.22–0.45 μm之间。图（图2a）总结了按大小范围分类的EMP类型。在大于3 μm的EMP中，组成包括34.29%的聚乙烯（PE）、26.52%的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、24.02%的聚丙烯（PP）、7.64%的聚醋酸乙烯酯（PEVA）和7.5%的高密度聚乙烯（HDPE）。此外，大小在3到1.22 μm之间的检测到的EMP包括27.94%的PE、26.18%的PET、23.40%的PP、10.86%的PEVA和11.59%的HDPE。最后，大小在1.22到0.45 μm之间的EMP被鉴定为含有34.85%的PE、31.34%的PET、13.28%的PP、11.97%的PEVA和8.54%的HDPE。下载：下载高分辨率图像（332KB）下载：下载全尺寸图像图2. 沉积图显示了通过RMS a) 在暴露储备溶液中鉴定出的EMP聚合物的组成，以及b) 在贻贝D-幼虫中积累的EMP聚合物。对照：暴露于0.001 μg/L DMSO的D-幼虫；EC25：暴露于3.9 μg/L PFOS的D-幼虫；EC50：暴露于20.45 μg/L PFOS的D-幼虫；EMPs：暴露于50 μg/L EMPs的D-幼虫；Mix 1：暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS的D-幼虫；Mix 2：暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS的D-幼虫。聚合物包括聚乙烯（PE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚丙烯（PP）、聚醋酸乙烯酯（PEVA）和高密度聚乙烯（HDPE）。3.3. 贻贝D-幼虫中的环境微塑料浓度和鉴定3.3.1. 贻贝D-幼虫中的环境微塑料浓度 通过RMS评估每105个暴露D-幼虫的颗粒数量（图2b）。EMPs组中的EMP颗粒浓度为168.06颗粒/105个幼虫，显著高于Mix2组记录的107.75颗粒/105个幼虫。相反，Mix1组中的EMP浓度变化没有显著差异，为173.94颗粒/105个幼虫，与EMPs组相比。来自对照组和仅暴露于PFOS的幼虫显示出可忽略不计的微塑料颗粒吸收，这些颗粒处于检测限，因此被认为不会干扰实验解释。实际上，M. galloprovincialis幼虫中的塑料颗粒生物积累量在对照组中为4.46颗粒，在EC50组中为6.81颗粒，在EC25组中为6.68颗粒。3.3.2. 贻贝D-幼虫中的环境微塑料鉴定 使用RMS分析对每105个暴露D-幼虫的颗粒进行了表征。在幼虫中积累的聚合物在大小和组成上都有变化（图2b）。在对照组、EC25组和EC50组（未暴露于EMPs）中，只鉴定出一种聚合物，大小范围从1.22到0.45 μm，对照组和EC25组中以PE和PEVA为主，EC50组中以PE和PET为主。相反，在含有50 μg/L EMPs的组中，也发现了储备溶液中鉴定出的所有聚合物，包括大于3 μm的聚合物、大小在3到1.22 μm之间的聚合物，以及大小在1.22到0.45 μm之间的聚合物。此外，在EMPs组中，PE和PET是主要积累的颗粒。在Mix1组中，PEVA其次是PET是大于3 μm类别中的主要EMP，而在3–1.22 μm范围内，PE其次是PEVA。在22–0.45 μm类别中，PE其次是PET是主要积累的聚合物。对于Mix2组，PE其次是PEVA是大于3 μm类别中的主要积累颗粒，而在3–1.22 μm和1.22–0.45 μm类别中，PE其次是PET。3.4. 贻贝D-幼虫中的PFOS浓度 ESI分析证明了暴露D-幼虫中PFOS的积累（图3）。在暴露于20.45 μg/L（EC50）恒定PFOS浓度48小时后，Mix2组的积累量最高，达到1443.784 ng/105个幼虫，显著高于EC50组的1264.12 ng/105个幼虫，增加了14.21%。同样，在较低的PFOS浓度3.9 μg/L下，Mix1组的PFOS积累量（856.172 ng/105个幼虫）也高于EC25组的715.35 ng/105个幼虫，增加了19.68%。这些发现表明，与仅暴露于PFOS的对照组和各组相比，暴露于EMPs和PFOS组合的幼虫中PFOS的积累量增加，表明PFOS通过EMPs颗粒转移。此外，未暴露于PFOS和MP组的幼虫中的PFOS浓度无法检测到。下载：下载高分辨率图像（82KB）下载：下载全尺寸图像图3. 暴露于不同处理的贻贝D-幼虫中的PFOS浓度（ng/105个幼虫）。数据以平均值±标准差提供。控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25组：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50组：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。不同的字母表示通过Tukey的Post Hoc测试确定的处理组之间存在显著差异（n = 4）。

3.5. EMPs和PFOS对贻贝胚胎-幼虫发育的影响
受精卵被单独或联合暴露于EMPs或PFOS中，在24孔微孔板中，48小时后评估贻贝D-幼虫的发育异常情况。结果如图4a所示，所有条件下的幼虫异常率显著增加。这两种污染物的暴露加剧了幼虫的异常。我们的发现显示了多种畸形（图4b），其中发育停滞是最常见的幼虫异常类型，其次是壳畸形。在暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS的Mix2组中，发育停滞的发生率为25.61%，其次是EC50组，为20.72%。与对照组相比，EC25、MP、Mix1、EC50和Mix2组的壳畸形百分比显著增加。关于外套膜畸形，在处理组中也观察到了显著增加。

下载：下载高分辨率图像（132KB）
下载：下载全尺寸图像
图4. 贻贝D-幼虫暴露于EMPs和PFOS后的幼虫畸形百分比。数据以平均值±标准差提供。
控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25组：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50组：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。不同的字母表示通过Tukey的Post Hoc测试确定的处理组之间存在显著差异（n = 4）。
b-b1）正常D-幼虫，b2）外套膜畸形，b3）壳畸形，b4）发育停滞。刻度尺代表20 μm。

3.6. EMPs和PFOS对钙沉积的影响
通过量化每种条件下D-幼虫中的钙强度来评估污染物EMPs、PFOS及其组合的影响（图5a）。仅在暴露于50 μg/L EMPs的MP组和暴露于20.4 μg/L PFOS的EC50组中观察到钙强度显著下降（图5b）。在其他实验条件下未检测到显著变化。

下载：下载高分辨率图像（143KB）
下载：下载全尺寸图像
图5. EMPs和PFOS对贻贝D-幼虫中钙沉积的影响。
a) 贻贝M. galloprovincialis幼虫暴露于EMPs和PFOS后的茜素红染色。刻度尺代表100 μm。
b) 直方图显示Mytilus galloprovincialis D-幼虫中的相对钙强度。数据以平均值±标准差提供。
控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25组：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50组：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。不同的字母表示通过Tukey的Post Hoc测试确定的处理组之间存在显著差异。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

3.7. EMPs和PFOS对Tubulin蛋白表达的影响
通过免疫荧光方法研究了EMPs、PFOS及其组合的影响（图6a）。
图6b显示，在暴露于EMPs和PFOS 48小时后，M. galloprovincialis D-幼虫中的相对Tubulin蛋白强度显著增加，尤其是在MP、Mix1和Mix2组中，与对照组相比。相比之下，对照组、EC50和EC25组之间没有显著差异。

下载：下载高分辨率图像（108KB）
下载：下载全尺寸图像
图6. EMPs和PFOS对贻贝D-幼虫中Tubulin表达的影响。
a) 免疫荧光分析显示贻贝幼虫中的Tubulin（红色），使用DAPI进行核染色（蓝色）。刻度尺代表20 μm。
b) 直方图显示Tubulin的荧光信号强度。数据已标准化为DAPI信号。
控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25组：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50组：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。不同的字母表示通过Tukey的Post Hoc测试确定的处理组之间存在显著差异。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

3.8. 基因毒性：TUNEL检测
通过使用TUNEL检测分析EMPs和PFOS对M. galloprovincialis幼虫阶段的基因毒性效应，包括DNA片段化和凋亡。结果表明，凋亡细胞显著增加，如TUNEL阳性所示（图7）。单独暴露于50 μg/L EMPs或与20.45 μg/L PFOS联合暴露显著增加了凋亡细胞的百分比。然而，与对照组相比，EC25、EC50和Mix2组之间没有显著差异。

下载：下载高分辨率图像（97KB）
下载：下载全尺寸图像
图7. 贻贝D-幼虫暴露于EMPs和PFOS后的DNA片段率。
a) 检测贻贝幼虫中的TUNEL阳性细胞（绿色），使用DAPI进行核染色（蓝色）。
b) 直方图显示TUNEL阳性细胞的百分比。数据以平均值±标准差提供。
控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25组：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50组：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。不同的字母表示通过Tukey的Post Hoc测试确定的处理组之间存在显著差异。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

3.9. 在EMPs和PFOS暴露下的转录表达调控
为了评估EMPs和PFOS单独或联合暴露对贻贝D-幼虫的影响，将涉及各种生理功能（包括壳形成（HRG）、细胞骨架组织（tubulin）和凋亡（P53、DNA ligase、caspase3、Bax、Bcl-2）的选定基因的mRNA表达水平标准化为三个参考基因（18S rRNA、β-actin和核糖体蛋白riboL27）的平均表达水平（图8）。转录表达数据显示MP组中的HRG基因上调，而在EC50、EC25、Mix1和Mix2组中下调。关于tubulin，所有六个处理组（EC25、EC50、MP、Mix1和Mix2）的转录表达均显著增加，其中EC50和Mix2组的表达水平最高。在参与凋亡的基因中，caspase-3（程序性细胞死亡的关键启动因子）在EC50、Mix1和Mix2组中显著过表达，其中Mix2组的表达水平最高。至于Bax（一种促凋亡因子），仅在EC25组中表现出负调控，而在其他条件（EC50、MP、Mix1和Mix2）中表现出正调控。Bcl-2（一种抗凋亡蛋白）在Mix1和Mix2组中表达下降。此外，关于DNA ligase（修复DNA断裂的酶），仅在EC25组中观察到过表达，而在EC50、MP、Mix1和Mix2组中观察到负调控。

下载：下载高分辨率图像（100KB）
下载：下载全尺寸图像
图8. 贻贝D-幼虫暴露于EMPs和PFOS后壳形成、细胞骨架和凋亡基因的相对mRNA表达：HRG、Tub、Casp-3、P53、Bax、Bcl-2和DNA-ligase。数据以平均值±标准差提供。
控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25组：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50组：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2组：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS。mRNA表达水平的结果根据18S rRNA、β-actin和核糖体蛋白riboL27的转录表达进行了标准化。红色星号表示相对于对照组显著上调的基因，绿色星号表示显著下调的基因。

3.10. 混合物效应评估
表2表示了PFOS和微塑料混合物在三个终点上的效应。应用Bliss独立模型预测加性效应，并将观察到的值与这些预测进行比较以评估潜在的相互作用。发育异常根据PFOS浓度表现出协同和拮抗反应。钙矿化始终受到混合物的协同影响。相比之下，凋亡表现出浓度依赖性反应，低剂量PFOS减轻了MP诱导的凋亡（拮抗作用），而高剂量PFOS略微增强了凋亡。

表2. PFOS和微塑料混合物在各个终点上的效应总结。
终点 混合物 观测平均值（95% CI） Bliss预期值 相互作用
幼虫畸形 EC25 + MP 52.67（47.42–57.91） 41.65 协同作用
EC50 + MP 38.37（34.51–42.23） 50.60 拮抗作用
钙沉积 EC25 + MP 222.45（215.42–229.48） 157.4 协同作用
EC50 + MP 210.72（177.88–243.56） 109.5 协同作用
TUNEL检测 EC25 + MP 3.741（3.34–4.14） 6.97 拮抗作用
EC50 + MP 7.725（6.94–8.48） 6.72 轻微协同作用

3.11. 主成分分析和相关矩阵
主成分分析（PCA）的结果提供了形态学、免疫荧光、基因毒性和转录表达参数之间关系的见解（图9a）。总数据变异性的第一个主成分（42.1%）在对照组与其他组（EC25、EC50、MP、Mix1和Mix2）之间的显著区分中起着关键作用。这个成分受到DNA ligase、HRG和钙沉积的影响。同时，tubulin、P53、Bax、caspase 3、TUNEL、幼虫畸形、EMPs和PFOS的基因和蛋白表达影响了第二个成分。根据这些结果，MP组与其他组（EC25、EC50、Mix1和Mix2）不同。值得注意的是，EC50、Mix1和Mix2组受到相同参数的影响。最终，相关矩阵（图9b）显示幼虫畸形与累积的EMPs和PFOS、TUNEL检测、Tubulin蛋白表达以及几个参与凋亡的基因呈正相关。相反，钙沉积与幼虫畸形以及HRG基因的表达呈负相关。

下载：下载高分辨率图像（319KB）
下载：下载全尺寸图像
图9. a) PCA分析和b) 贻贝D-幼虫暴露于EMPs和PFOS的多个参数的Pearson相关矩阵。（Tub：Tubulin蛋白表达，DNA-ligase：DNA-ligase转录表达，Tubulin：Tubulin转录表达，HRG：HRG转录表达，Casp-3：caspase-3转录表达，P53：P53转录表达，Bax：BCL-2转录表达，PFOS浓度，EMPs：EMPs量）在不同条件下（控制组：D-幼虫暴露于0.001 μg/L DMSO；EC25：D-幼虫暴露于3.9 μg/L PFOS；EC50：D-幼虫暴露于20.45 μg/L PFOS；EMPs：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs；Mix 1：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和3.9 μg/L PFOS；Mix 2：D-幼虫暴露于50 μg/L EMPs和20.45 μg/L PFOS）。

4. 讨论
PFOS（一种主要的PFAS类物质）的普遍性已成为全球关注的问题，这从不断增加的科学研究和关注中可以看出[33]。研究EMPs和PFOS联合暴露对海洋生物的毒性效应的研究明显有限[66]。本研究的新颖之处在于确定了钙稳态改变和凋亡激活作为早期生命阶段的主要机制反应，而不仅仅是孤立的基因反应。据我们所知，这项多方法研究是首次探索这两种污染物对M. galloprovincialis胚胎-幼虫阶段的联合影响。

4.1. PFOS在M. galloprovincialis早期生命阶段的毒性阈值
一般来说，与淡水和海洋生态系统中毒性相关的PFOS浓度有几个数量级[28]。在环境背景下，经常在氟化产品制造设施附近以及消防泡沫意外释放后检测到高浓度的PFOS，浓度范围从ng/L到μg/L[67]。在我们的研究中，选择了一系列浓度（包括环境浓度）来评估PFOS的实际影响，并有效辨别其对幼虫畸形的毒性效应。结果提供了导致25%畸形的有效浓度为3.9 μg/L，以及中位有效浓度（EC50）为20.45 μg/L。关于M. galloprovincialis胚胎-幼虫阶段的PFOS的EC50，在文献中要么不完整，要么缺失。唯一一项评估D-幼虫中EC50的研究[26]报告的EC50约为1.1 μg/L，明显高于我们研究中确定的EC50。另一项研究[68]报告称，对于M. galloprovincialis幼虫的正常胚胎发育，PFOS的无观察效应浓度（NOEC）约为0.1 μg/L，这一浓度是在48小时暴露后得出的。然而，这些发现受到了批评[26]，因为人们认为这一数值过低，通常报告的PFOS毒性阈值在1至10 μg/L之间，而M. galloprovincialis幼虫发育参数的NOEC约为0.88 μg/L，特别是对于正常发育和整体存活率而言。

4.2 微塑料聚合物组成、吸收及其与PFOS的相互作用
检测到的聚合物类型与之前的研究[69]一致，该研究记录了突尼斯海岸沉积物中PE（聚乙烯）的普遍存在。PE和PET常用于生命周期较短的产品中，这最终导致它们在环境中的持久性[70]。此外，研究发现微塑料颗粒（MPs）在D期幼虫体内的积累顺序为：>3 μm、3–1.22 μm和1.22–0.45 μm，表明幼虫特别倾向于摄入较小的MPs，尤其是1.22–0.45 μm大小的颗粒。这一观察结果与Romdhani等人（2022年）的研究结果相符，他们发现将M. galloprovincialis暴露于EMPs（50 μg/L）后，贻贝血淋巴液中的大部分积累颗粒大小在1.22至0.45 μm之间[13]。事实上，Ding等人揭示了MPs的积累通常取决于塑料碎片的大小，较小的颗粒更容易被吸收[71]。这种偏好可能归因于生物体过滤大量水的能力以及其捕捉较小颗粒的效率[72]，包括浮游微生物。这增加了捕获这些颗粒的可能性，使它们更容易被摄入，因为它们的大小与贻贝幼虫早期生命阶段的重要食物来源——浮游生物的大小相似[19]。尽管本研究主要关注聚合物类型和大小分布（这些是决定微塑料生物利用度和毒性的关键因素），但未评估其他物理化学性质，如表面电荷、老化状态和聚集行为。这些参数可能会影响MPs在水生系统中的行为及其与其他污染物（如PFOS）的相互作用。最后，值得注意的是，在对照组和仅暴露于PFOS的幼虫中观察到的微塑料数量可以忽略不计，这与海洋系统中不可避免的微量背景水平一致，即使经过严格过滤也是如此。这些背景水平比我们的实验暴露水平低几个数量级，不会干扰此处报告的生物反应的解释。

本研究中使用的化学分析方法非常有用，提供了关于EMPs及其独特元素组成特征的见解。因此，幼虫体内检测到的聚合物水平反映了周围环境中这些聚合物的丰度。这种吸收主要通过纤毛运动实现，使幼虫能够在过滤系统完全发育之前摄入悬浮颗粒。结果，水中的MPs可以随食物颗粒一起被摄入，从而导致早期暴露。这一机制突显了D期幼虫对MPs的脆弱性，即使在没有主动过滤结构的情况下也是如此。这一发现与之前的研究结果一致，这些研究记录了从Bizerte泻湖收集的贻贝中MPs（主要是PE）的积累[74]。同样，Pavi?i?-Hamer等人[73]报告称，地中海贻贝在摄入不同类型和大小的微塑料聚合物后，对PE和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的吸收增加，尤其是较小的颗粒。此外，在本研究中，仅暴露于EMPs的D期幼虫积累的MPs数量显著多于同时暴露于EMPs和20.45 μg/L PFOS的幼虫。相比之下，先前的研究表明，PFOS对Scrobicularia plana在暴露于MPs和PFOS混合物后对塑料积累没有明显影响，这表明MPs的化学涂层可能会改变其摄入方式[74]。S?kdokur等人发现，海洋蛤蜊Ruditapes philippinarum对原始MPs的过滤能力比对同时暴露于汞或被汞覆盖的MPs的过滤能力更强[75]。似乎汞吸附在MPs表面会阻碍过滤速率和MPs的吸收，可能是一种避免化学暴露的适应策略[76]。

这些塑料颗粒可能成为环境中共存污染物的化学储存库和潜在传递载体[77]。这里有令人信服的证据支持这一假设，通过对地中海贻贝幼虫（EC50和EC25组）中PFOS的生物可利用部分进行量化。检测到的PFOS水平的结果加强了MPs能够有效捕获和运输海洋污染物的假设，尤其是在海水中PFOS的吸附作用尤为明显[65]。类似的结论已在多项涉及不同海洋物种的生态毒理学研究[37]、[78]中得到证实，以及对PE的更强吸附亲和力[79]也有报道。MPs表面的这种聚集受疏水相互作用、聚合物的结晶度、有机污染物的极性、海水中的盐度效应以及污染物的生物降解潜力等因素的影响。此外，塑料颗粒的组成、粒径和表面特性也会影响其吸附PFOS的能力，粗糙或多孔的表面可能增强这种吸附能力[80]。进一步的研究表明，本研究中使用的PFOS浓度与特定环境条件相关。这种暴露模式产生的内部PFOS浓度范围为710至1440 ng/10^5，这与在各种海洋生物样本中经常检测到的水平相当[81]。

4.3 微塑料和PFOS毒性的分子机制
本研究聚焦于48小时的暴露期，这是评估D期幼虫胚胎毒性的标准时间窗口，可以检测到早期和敏感的发育障碍。尽管长期暴露可能会揭示这些效应是否会随时间持续或加剧。我们的胚胎毒性结果与之前使用MPs或PFOS作为不同物种污染物的研究结果一致[45]、[82]、[83]、[84]。具体来说，我们的发现显示了壳异常的出现，包括凹陷或畸形的壳，以及外套膜的突出或收缩。关于M. galloprovincialis的研究表明，MPs对早期发育有严重影响，包括壳生物发生的紊乱和生长相关转录表达的改变[83]、[85]。Boukadida等人也指出，EMPs暴露会导致幼虫壳形成中断和发育停滞[44]。

此外，有报道称PFOS暴露会产生剂量依赖性效应[86]，在低至0.1 μg/L的浓度下就会显著抑制幼虫的正常发育，而在100 μg/L时效应最为明显。这些紊乱主要是由于发育停滞，而没有观察到壳畸形百分比的显著增加。在双壳类动物的面盘幼虫阶段，外套膜在壳形成中起着关键作用[87]。壳矿化过程似乎受到外套膜上皮细胞的严格调控[88]、[89]。幼虫畸形可能涉及外套膜发育的紊乱、矿化过程的干扰，导致壳变形，或直接影响参与细胞骨架动态的蛋白质。50纳米聚苯乙烯（PS 50-S）在受精后24小时减少了壳有机基质的沉积，在受精后48小时减少了钙化，导致M. galloprovincialis幼虫的表型与对照组壳不同，后者的特征是规则的钙化层[90]。Pinctada fucata牡蛎暴露于MPs 96小时后，关键生物矿化相关基因的表达水平升高，包括对壳形成至关重要的无定形碳酸钙结合蛋白基因[91]。另一项针对野生捕获的淡水龟蛋的研究[92]表明，PFAS富集的蛋壳样本中与钙离子结合、发育过程和骨骼矿化相关的蛋白质显著下调，随后PFAS富集的输卵管蛋壳中的钙含量也较低。可能的机制包括离子和蛋白质从外套膜外层运输到生物矿化区的过程受阻，以及壳珍珠层内有机基质蛋白的分泌[93]。这两种途径都可能导致有机基质沉积的早期改变，而有机基质是壳矿化的关键组成部分。相比之下，同时暴露于EMPs和PFOS并未导致钙沉积的变化。有几个假设可以解释这一结果。一种可能是MPs可能产生所谓的“内在效应”[94]，即MPs单独作用时引发的生物反应在与PFOS结合时不一定叠加。另一种假设是观察到的畸形源于细胞骨架组织的紊乱，可能是由氧化应激或影响微管聚合和稳定性的信号通路改变引起的。这突显了监测微管的重要性，微管是一种组装成动态微管并在细胞分裂过程中发挥关键作用的蛋白质[91]。微管是微管聚合、细胞内运输和细胞运动的关键组成部分，在双壳类动物的细胞骨架组织中起着关键作用，支持细胞结构、促进生物矿化，并整合对发育中的双壳类动物壳结构至关重要的信号通路[91]。然而，关于早期幼虫阶段微管表达的数据有限。为了评估EMPs和PFOS对微管表达的影响，我们使用免疫荧光分析方法评估了M. galloprovincialis幼虫（D期）中微管蛋白的相对强度。结果表明，无论是单独还是与PFOS联合处理，EMPs都会影响微管蛋白的表达，MP、Mix1和Mix2组的微管蛋白强度显著增加。与我们的发现一致，其他研究表明贻贝可以通过诱导α-微管来调节细胞骨架的重组和修复以应对压力[95]。

观察到的贻贝幼虫畸形和发育停滞的增加可以归因于转录表达的改变。为了探讨这种关联，我们进行了q-RT-PCR转录表达研究。具体来说，我们关注了贻贝幼虫发育前48小时内参与关键生理过程的多个基因的调控。我们发现所有五个暴露组中的微管蛋白都过度表达。对于MP、Mix1和Mix2组，这一发现与之前报道的微管蛋白强度结果一致，突显了MPs以及MPs和PFOS联合暴露对细胞骨架组织的显著影响。这些变化表明细胞在应对细胞骨架结构改变时存在补偿机制。在压力条件下，微管网络的解体和含微管的颗粒的形成促进了这种蛋白质的转录产生[96]。在我们的研究中，仅在PFOS处理组中，微管蛋白转录表达的增加与蛋白质水平的增加之间存在差异，这可能是由于细胞调控机制的复杂性。研究表明，PFOS可以诱导表观遗传修饰，并与转录因子[97]以及基因启动子区域相互作用，可能改变它们的调控活性。这可能导致微管基因转录增加，而不一定影响其他蛋白质合成阶段。值得注意的是，PFOS暴露已被证明会改变microRNA谱型[98]，其与目标转录本的结合会阻止其翻译并促进其降解[99]。

在本研究中，编码HRG的基因（一种壳畸形的显著标记物[56]在EMPs暴露后表现出显著过表达。一般来说，HRG与双壳类动物的壳沉积有关[100]。在贻贝幼虫中，它通过在钙化部位创造酸性环境来调节壳形成[44]、[101]，表明任何对该过程的调节都可能直接影响壳矿化。观察到的HRG过表达与EMPs暴露后钙强度的降低一致。为了应对EMPs引起的压力，幼虫细胞可能试图通过上调HRG表达来补偿这些变化。Balbi等人的研究结果与我们的结果相反，他们报告称在暴露于阳离子聚苯乙烯纳米颗粒（PS-NH?）的M. galloprovincialis幼虫中HRG表达下调[102]。在暴露于20.45 μg/L PFOS的幼虫中，HRG表达的显著降低与PFOS的积累呈负相关，这可能解释了观察到的壳异常和钙沉积过程的变化。此外，EC25、Mix1和Mix2组中HRG的表达下调表明，低浓度的PFOS以及EMPs和PFOS的联合使用可以直接对转录本表达产生毒性作用。DNA损伤与无脊椎动物幼虫畸形之间的联系已有充分文献记载[103][104]。在发育的关键早期阶段，DNA损伤尤其具有后果性，因为它会破坏对生长和分化至关重要的基因的精确调控，最终导致发育缺陷和胚胎毒性的增加。在本研究中，使用TUNEL检测方法评估了DNA损伤情况，该方法能够检测到在凋亡最后阶段经历广泛DNA降解的细胞[105]。当由压力引起的细胞损伤超过某个临界阈值时，特别是在无法有效修复的严重DNA损伤情况下，通常会触发凋亡。在暴露于50 μg EMPs的幼虫中观察到凋亡细胞显著增加。这一发现与许多使用TUNEL检测的研究结果一致，这些研究表明EMPs会导致DNA片段化，从而在M. galloprovincialis中引发凋亡[13][106]。然而，在我们的研究中，EC50和EC25组没有检测到显著差异。已有研究表明，斑马鱼[34]和非洲爪蟾[107]胚胎在暴露于PFOS后出现的明显发育缺陷与凋亡有关，这一点通过TUNEL阳性细胞的增加得到了证实。在我们的案例中，Mix2组中的TUNEL阳性细胞数量最多。EMPs和PFOS的共存可能会增强基因毒性作用，最终导致凋亡。转录本表达分析显示，在所有测试条件下（EC25、EC50、MP、Mix1和Mix2），暴露于上述污染物的D-幼虫都过度表达了P53基因。P53是一种核转录因子，参与维持基因组的完整性，因此P53的精确调控对正常细胞生长和发育至关重要。在正常情况下，由于蛋白酶体的降解，P53的表达水平极低[108]。一旦被激活，它会诱导细胞周期停滞，以促进DNA修复和/或凋亡，通过转激活目标基因来防止具有严重DNA损伤的细胞扩散[109]，具体取决于DNA损伤的程度和类型[110]。在EC25组中，Bax、Bcl-2和caspase-3的表达水平保持基线水平，而DNA连接酶的表达显著增加。DNA连接酶在DNA复制和重组过程中通过连接磷酸二酯骨架的断裂来发挥关键作用，因此参与DNA损伤的响应和修复[111]。根据TUNEL检测的结果以及P53和DNA连接酶的调控情况，可以得出结论，在3.9 μg/L的低浓度PFOS下，细胞主要触发DNA修复机制。此外，暴露于50 μg/L EMPs的幼虫表现出Bax（一种促凋亡蛋白）的过度表达，DNA连接酶的表达下调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达没有显著变化，Bcl-2可以防止细胞色素c的释放[113]。值得注意的是，暴露于MPs已被证明会破坏代谢途径并通过激活内在凋亡途径促进细胞死亡[116]。在我们的研究中，MPs暴露组中未观察到caspase-3表达的显著变化。与我们的发现一致，Islam等人报告称，在S. plana的消化腺中，MPs暴露后caspase 3/7活性显著抑制[74]。这表明MPs可能会干扰经典的凋亡级联反应，可能使细胞死亡过程转向非caspase依赖的机制。我们的发现进一步证实了MPs可能通过多种凋亡机制发挥细胞毒性作用，而不依赖于caspase-3的激活。暴露于20.45 μg/L PFOS的浓度下，Bax和caspase-3的表达上调，而Bcl-2和DNA连接酶的表达下调。与我们的结果一致，[34]报告称，在暴露于PFOS的斑马鱼胚胎中观察到发育毒性和与凋亡相关的基因表达改变，包括P53和Bax。此外，暴露于EMPs和PFOS组合的组也表现出类似的改变，表明EMPs/PFOS组合会导致不可修复的细胞损伤，从而导致凋亡性细胞死亡。对于Mix2组，这些观察结果也通过TUNEL检测得到了证实。EMPs和PFOS的联合暴露加剧了毒性作用，特别是通过放大氧化应激，这可能触发凋亡途径的增强激活[66]。总体而言，尽管EMP暴露增加了幼虫中的PFOS积累，但这并没有导致比单独使用EMPs时更强的毒性作用。早期生命阶段非常敏感，关键的发育终点如壳形成和凋亡可能在低浓度的EMPs下就已经受到最大程度的影响，从而限制了叠加或协同效应的检测。此外，吸附在EMPs上的PFOS可能比自由溶解的PFOS具有较低的生理生物利用度，可能减少其与关键分子靶标的相互作用。总体而言，EMPs和PFOS单独或联合使用会在M. galloprovincialis幼虫中引起深刻的形态和基因毒性改变。这些改变表现为由于矿化过程受到干扰导致的幼虫形态异常、对发育至关重要的蛋白质途径受损以及DNA片段化，最终导致凋亡性细胞死亡。这项全面分析揭示了环境污染物如何破坏M. galloprovincialis幼虫发育过程的复杂机制。最后，对生物终点的混合物毒性评估显示没有单一的相互作用类型（例如，一致的协同作用或拮抗作用）。相反，相互作用的方向和程度都取决于终点和浓度。这些发现表明，在混合物风险评估中，默认的叠加假设可能会根据所检查的生物指标高估或低估毒性。这强调了在评估同时存在的化学物质和颗粒污染物时进行实证的、多终点的混合物评估的必要性。

5. 结论
本研究首次评估了EMPs和PFOS对M. galloprovincialis贻贝早期发育阶段的联合影响，提供了关于PFOS有效浓度（EC25和EC50）的宝贵见解。共暴露被发现会损害贻贝幼虫对EMPs的吸收，同时增强它们捕获和运输PFOS的能力。胚胎毒性评估显示EMPs和PFOS对D-幼虫的正常发育有显著的不良影响。钙沉积分析突出了壳生物矿化过程的紊乱，而免疫荧光分析和转录本表达研究揭示了微管蛋白和HRG的变化，阐明了壳形成障碍的机制。这些污染物的基因毒性潜力通过它们通过激活凋亡诱导发育停滞的能力得到了证明，表现为P53的过度表达、DNA修复基因的调节以及促凋亡蛋白（如caspase-3和Bax）水平的增加。最后，与单独使用EMPs相比，在EMPs和PFOS联合暴露下没有观察到明显的毒性增强，这可能反映了早期幼虫阶段的高敏感性和PFOS与微塑料结合时降低的生理生物利用度。

作者贡献声明：
Sirine Alaya：调查、正式分析、数据管理、概念化。
Ilef Romdhani：调查、正式分析、数据管理、概念化。
Khouloud Boukadida：验证、监督。
Ahlem Sahnoun：验证、监督。
Siwar Abouda：验证、监督。
Yossra Missaoui：验证、监督。
Raffaele Boni：写作-审阅与编辑、写作-初稿、验证、监督。
Massimo Venditti：写作-审阅与编辑、写作-初稿、验证、监督。
Sergio Minucci：写作-审阅与编辑、写作-初稿、验证、监督。
Alessandra Gallo：写作-审阅与编辑、写作-初稿、验证、监督。
Mohamed Banni：写作-审阅与编辑、写作-初稿、验证、监督、项目管理、方法学、数据管理、概念化。

资助
本工作得到了突尼斯高等教育部（LR21AGR02）和2022年卓越计划的支持。它还得到了意大利大学和研究部（PRIN 2020，授权号20204YRYS5给A.G.）的支持。

未引用的参考文献：
[47], [54], [55], [58], [64], [114], [115], [117], [118]