《Harmful Algae》：Cytotoxicity unleashed: how
Prymnesium parvum extract drives RTgill-W1 rainbow trout cells into cell death
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细胞凋亡与坏死机制研究：通过荧光显微镜和流式细胞术分析B型prymnesin毒素对虹鳟鱼鳃上皮细胞的影响，发现低浓度诱导凋亡（核形态改变、线粒体减少、磷脂酰丝氨酸外露），高浓度转为坏死（膜破裂、细胞完整性丧失），证实毒素浓度依赖性细胞死亡类型转变。
Zsuzsanna Neer | Endre Kiss | Urban Tillmann | Magdalena P?chhacker | Balázs Vajna | Tamás Felf?ldi | János Matkó | Elisabeth Varga
埃奥特尔沃什·洛兰德大学（E?tv?s Loránd University）理学院微生物学系，Pázmány Péter街1/c号，1117布达佩斯，匈牙利
摘要
大规模的藻类爆发，包括2022年与有毒甲藻
Prymnesium parvum相关的奥德河（Oder）生态灾难，凸显了我们在理解水传播的生态毒素方面存在的关键空白。Prymnesins是由
P. parvum产生的梯状框架聚醚类化合物，具有明确的鱼类毒性；然而，Prymnesins引起鱼类细胞损伤的细胞机制至今尚未在细胞水平上得到阐明。在此研究中，我们利用荧光显微镜和流式细胞术建立了并优化了分子和细胞生物测定方法，以表征虹鳟鱼鳃细胞（RTgill-W1）在暴露于含有B型Prymnesin的藻类提取物3小时后的早期细胞损伤途径。我们特别关注了由
P. parvum提取物引发的细胞死亡相关事件。终点分析显示，细胞死亡的主要类型随浓度变化而变化：较低浓度的毒素主要引发凋亡，表现为核形态改变、线粒体质量减少以及磷脂酰丝氨酸外化（Annexin V染色）。相比之下，较高浓度的Prymnesin则引发坏死性细胞死亡，其特征是膜破裂和细胞完整性丧失（通过碘化丙啶摄取检测）。通过揭示凋亡性和坏死性细胞死亡之间的浓度依赖性转变，本研究将含有Prymnesin的提取物确定为导致渐进性细胞损伤的驱动因素，而不仅仅是具有快速膜溶解毒性的巨环聚醚藻类毒素之一。这些发现突显了Prymnesins介导的细胞毒性的双重性质，并表明暴露浓度是决定细胞结局的关键因素，从而推进了对
P. parvum相关鱼类毒性的机制理解。
引言
全球生态灾难的频率不断增加，这主要是由人为因素和气候变化所驱动的，这凸显了水生栖息地的脆弱性（H?der等人，2020年）。近几十年来，由于水生光合微生物的迅速繁殖，有害藻类爆发（HABs）在世界各地的沿海水域和淡水生态系统中频繁发生，导致大量鱼类死亡或严重的生态破坏（Gobler，2020年；Griffith和Gobler，2020年；Dai和Yang等人，2023年；Feng等人，2024年）。HABs通常由盐碱化、富营养化、城市化、气候变化以及农业径流引起（Hallegraeff，1993年；Paerl和Huisman，2009年；Roelke等人，2011年；Granéli等人，2012年；Hill等人，2020年）。2022年8月，奥德河（波兰/德国）发生了大规模的鱼类死亡事件，这是欧洲近期最严重的与淡水HAB相关的生态灾难之一，突显了Prymnesium parvum爆发的潜在后果（K?hler等人，2024年）。最早记录的与P. parvum爆发相关的鱼类死亡事件可追溯到20世纪20年代的荷兰（Liebert和Deerns，1920年）。自那时以来，世界各地都报告了多起由该物种引起的鱼类死亡案例（Edvardsen和Paasche，1998年），尤其是在美国，那里经常发生此类爆发（Baker等人，2007年）。多项研究表明，这些微藻产生的毒素通过多种方式杀死鳃部生物。它们的作用可以是溶血性的、细胞毒性的或两者兼有的（Roelke等人，2007年）。
P. parvum是一种属于甲藻门（Haptophyta）Prymnesiaceae科的单细胞微藻，由于其叶绿体中的岩藻黄素色素而常被称为“金藻”（Berger等人，1977年；Edvardsen等人，2011年）。其生态成功在很大程度上归因于其对盐度和温度的广泛耐受性，使其能够在各种环境条件下生长。
理解P. parvum引起的鱼类死亡机制对于解释其对养殖和野生鱼类种群的影响至关重要（Edvardsen和Paasche，1998年），这些影响会破坏生态系统并造成巨大的经济损失（Southard等人，2010年）。P. parvum释放的毒素会强烈影响共存的浮游生物，改变群落结构（Fistarol等人，2003年）并影响营养相互作用（Tillmann，2003年）。这些毒素通常被称为化感物质，因为它们通过抑制共存生物并促进捕食来促进竞争性相互作用。鱼类死亡通常被认为是这种化学干扰的非适应性副作用，在生长条件不佳的情况下可能会加剧（Legrand等人，2003年；Granéli和Hansen，2006年；Granéli和Salomon，2010年）。Prymnesium parvum产生的毒素在化学上非常多样，多年来已提出多种化合物类别作为候选物（Dafni等人，1972年；Kozakai等人，1982年；Bertin等人，2012年；Henrikson等人，2010年）。然而，对于大多数这些化合物，其确切结构尚未明确。
相比之下，梯状框架聚醚类Prymnesins被明确鉴定为P. parvum的主要鱼类毒性代谢物（Igarashi等人，1995年、1996年、1999年；Rasmussen等人，2016年）。这种毒素家族最初于1995年被分离为prymnesin-1和prymnesin-2，此后又扩展到包括其他同类化合物，如prymnesin-B1，后者具有细微的结构差异（Rasmussen等人，2016年）。由于Prymnesins的纳摩尔级毒性和低细胞丰度，检测它们在技术上具有挑战性，且认为它们主要在捕食事件或物理压力下释放（Remmel等人，2012年）。
鱼的鳃持续暴露于水中的有毒物质，是水生环境与鱼类内部生理之间的主要接口。除了气体交换外，鳃还在离子转运、酸碱调节、渗透压调节和代谢副产物的排泄中起着重要作用（McKim等人，1985年；Wood等人，2002年）。研究表明，淡水鱼的鳃上皮细胞对环境毒素比肝细胞更敏感（Zhou等人，2006年）。尽管原代鳃细胞培养在功能上与体内相似，但使用永生化鳃细胞系（如RTgill-W1）具有实际优势，包括降低变异性和提高可重复性（Bols等人，1994年）。
在毒性暴露下，鳃上皮细胞中的凋亡可能是一种早期保护性反应，有助于维持上皮完整性并限制与坏死相关的炎症损伤（Sales等人，2017年；Chen等人，2023年）。调节性细胞死亡是评估鳃对水生毒素反应的关键细胞指标。
识别经历凋亡的细胞具有挑战性，因为许多测定方法用于检测也可能出现在其他细胞过程中的结构和功能变化。此外，没有单一参数能够完全定义所有系统中的程序性细胞死亡，而且这些形态变化可能因凋亡途径或细胞类型而异。因此，需要结合多种互补测定方法的多参数方法。因此，在开发用于鳟鱼鳃细胞系的荧光显微镜和流式细胞术协议时，进行了大量的优化和验证。
尽管有关Prymnesium parvum爆发引起的鱼类死亡的文献记录很多，但Prymnesins诱导毒性的细胞机制仍知之甚少。相比之下，其他几种与HAB相关的鱼类毒素已在机制上得到了较为详细的研究。例如，karlotoxins形成依赖固醇的膜孔（Place等人，2024年），brevetoxins主要针对电压门控钠通道（Baden等人，2005年），而来自甲藻的毒素常与氧化应激介导的途径相关（Kim等人，2000年）。这些研究表明，巨环聚醚藻类毒素包含多个结构和功能多样的毒素家族，具有不同的作用机制。目前，对于Prymnesins来说，缺乏类似的细胞水平机制框架。这留下了一个问题：Prymnesins诱导的细胞反应与所描述的鱼类毒素途径之间的关系如何，或者它们是否代表了一种新的细胞损伤模式。
解决这一空白对于将P. parvum相关的鱼类死亡生态观察与潜在的细胞过程联系起来至关重要。因此，我们的研究旨在通过检查血浆膜完整性、细胞和核形态、细胞表面磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露、线粒体质量以及溶酶体活性的变化，来表征P. parvum提取物在RTgill-W1细胞中的细胞死亡诱导效应。
Prymnesium parvum的培养和毒素提取
所使用的P. parvum菌株（KD-A4）是从2022年夏季末奥德河（52.887° N, 14.159° E）采集的水样中分离出来的。培养在10升玻璃瓶中进行，条件为非无菌环境，温度20°C，光照：黑暗周期为16:8小时（30–40 μmol photons m-2 s-1），并持续进行温和的气泡通气。使用基于天然北海水的过滤灭菌K培养基（Keller等人，1987年），调整至盐度15，作为生长介质。
P. parvum提取物显著改变了虹鳟鱼鳃细胞的活力
在毒性实验之前，对B型PRM提取物（KD-A4）进行了分析表征。利用上述HPLC-FLD方法，估计Prymnesin浓度为181 ± 16 μM，LC-HRMS确定了Prymnesin的组成。结果显示存在含有一个氯原子的B型Prymnesin骨架，以及含有戊糖、己糖或两个己糖单位的类似物（详见补充表S2）。将虹鳟鱼鳃细胞系RTgill-W1暴露于这种提取物中
讨论
巨环聚醚藻类毒素包含多个结构和功能多样的毒素家族，每种毒素通过不同的细胞机制发挥作用。Karlotoxins通常通过胆固醇依赖性膜通透性和孔洞形成导致快速的渗透压失衡（Place等人，2024年）。相比之下，brevetoxins主要针对电压门控钠通道，使其保持开放状态并引发持续的去极化和钙流入（Baden等人，2005年）。
结论
总之，P. parvum提取物会损伤培养的虹鳟鱼鳃细胞，表现为核、线粒体和溶酶体的协同功能障碍，最终导致细胞死亡。具体来说，P. parvum提取物的EC50浓度引起了细胞形态的显著变化、核浓缩以及细胞表面磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露，这与凋亡的早期阶段一致。这种细胞死亡发生在观察到的浓度范围内
资助
本研究部分由奥地利科学基金（FWF）[资助编号：10.55776/I5707]资助。本手稿所基于的项目部分由德国联邦教育和研究部（BMBF）在生物多样性保护研究计划（FEdA）下资助，资助代码为16LW0561k。Zsuzsanna Neer获得了埃奥特尔沃什·洛兰德大学的奖学金。Tamás Felf?ldi得到了国家气候变化多学科实验室的支持
CRediT作者贡献声明
Zsuzsanna Neer：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，调查，数据分析，概念化。
Endre Kiss：撰写 – 审稿与编辑，方法学，数据分析。
Urban Tillmann：撰写 – 审稿与编辑，资源，方法学。
Magdalena P?chhacker：撰写 – 审稿与编辑，方法学。
Balázs Vajna：撰写 – 审稿与编辑，资源。
Tamás Felf?ldi：撰写 – 审稿与编辑，资源。
János Matkó：
