Applying Environmental DNA Metabarcoding to Calculate an Index of Biotic Integrity for Freshwater Fish

《Environmental DNA》：Applying Environmental DNA Metabarcoding to Calculate an Index of Biotic Integrity for Freshwater Fish

　　

多指标指数如生物完整性指数（Index of Biotic Integrity, IBI）是美国《清洁水法》（Clean Water Act, CWA）合规性的重要生物监测工具。环境DNA（environmental DNA, eDNA）宏条形码技术可通过提高稀有分类群的检出灵敏度并降低监测成本，对IBI形成补充。迄今为止，缺乏在美国利用eDNA宏条形码技术计算IBI的研究。本研究利用eDNA宏条形码技术，针对美国阿拉巴马州北部田纳西河流域（Tennessee River Basin）的河流与溪流计算了基于鱼类的IBI。研究人员从50个跨越土地利用强度梯度的河溪站点采集水样，提取eDNA并利用脊椎动物特异性引物进行测序。将eDNA-IBI与阿拉巴马州采用常规采样实施的鱼类IBI及美国环境保护署（US Environmental Protection Agency, EPA）基于底栖大型无脊椎动物预测的这些溪流生物状况进行了比较。研究发现eDNA-IBI与鱼类IBI呈显著正相关，且与溪流水生栖息地质量指标存在共同响应关系，但与底栖大型无脊椎动物预测的生物状况相关性较弱且不显著。值得注意的是，尽管eDNA-IBI采样比常规鱼类采样晚9年且在略有差异的地点进行（尽管距离未解释变异），鱼类IBI全年采样投入更大（涵盖春季和秋季而非仅夏季），且部分常规采样检测到的物种因缺乏参考DNA序列而未能被eDNA检测到，上述相关性依然成立。本研究为基于常规采样计算的多指标指数与eDNA-IBI的效能对比提供了基线数据，并通过文中确定的未来方向加以改进。

该研究针对淡水生态系统生物监测中常规采样方法成本高、耗时久且依赖分类学专家的现状，探讨了环境DNA（eDNA）宏条形码技术在计算生物完整性指数（IBI）中的应用潜力。研究聚焦于美国阿拉巴马州北部的田纳西河流域，该区域以其极高的淡水生物多样性（特别是石首鱼、贻贝和鱼类）及特有性而闻名，但同时也面临着快速人类人口增长带来的威胁。

研究人员首先回顾了IBI作为《清洁水法》合规性评估工具的起源与发展，指出传统鱼类IBI虽有效但存在局限性，如采样方法影响物种检出、成本高昂以及对分类学专业知识的依赖。相比之下，eDNA技术具有检测稀有物种灵敏度高、成本效益好等优势，且在无脊椎动物和藻类的生物监测中已取得成功，但在美国淡水鱼类IBI的应用尚属空白。为此，研究人员选取了O'Neil和Shepard于2010年开发的田纳西河流域鱼类IBI作为参照，旨在通过eDNA宏条形码数据重新计算该指数，并将其与历史常规采样数据及EPA预测的生物状况进行对比，以验证eDNA-IBI的可行性与准确性。该研究成果最终发表于《Environmental DNA》期刊。

为实现上述目标，研究人员采用了几项关键技术方法。首先，于2018年夏季在田纳西河流域的50个河溪站点采集了水样，覆盖了从农村森林到高度城市化及不同流域面积的梯度。其次，利用脊椎动物特异性引物（12S rRNA）对eDNA样本进行宏条形码测序，并结合自定义数据库进行生物信息学分析，期间实施了严格的空白对照校正以消除污染。随后，研究人员依据O'Neil和Shepard的IBI框架，利用eDNA检出的物种丰富度和相对读长丰度重新定义了11项指标（剔除了无法从eDNA数据获取的健康与杂交指标），并计算了eDNA-IBI评分。最后，通过统计回归分析，将eDNA-IBI与9年前常规采样获得的鱼类IBI、EPA底栖大型无脊椎动物多指标指数（BMMI）以及生境质量评估数据进行了关联比较。

研究结果显示：

在结果部分，MiSeq测序共产生约3000万条读数，经过滤后保留了约1140万条，其中43%被分配至鱼类物种。在50个样点中，eDNA宏条形码技术共检测到56种鱼类。与O'Neil和Shepard研究的29个共享样点相比，常规采样检测到的物种丰富度显著高于eDNA（平均分别为19.3种和9.9种），且eDNA倾向于低估底栖小型鱼类（如镖鲈和鲶科幼体）。然而，eDNA也成功检测到了两种常规采样遗漏的稀有物种：美洲溪七鳃鳗和焰光美洲鱥。

在指数相关性分析中，eDNA-IBI与常规鱼类IBI之间存在显著的正相关关系（p < 0.001），且样点间距离对该关系无显著影响。这表明尽管存在9年的时间差和采样位置的微小偏移，eDNA-IBI仍能反映出与常规IBI一致的水域生态健康状况。相比之下，eDNA-IBI与EPA基于底栖无脊椎动物的BMMI之间仅存在微弱且不显著的正相关（p = 0.079）。

进一步对构成IBI的11项具体指标进行分析发现，共有6项指标在两种方法间表现出显著相关性，包括总物种数、镖鲈与鲶科物种数、不耐物品种数、耐污种百分比、Lepomis属物种百分比以及石生产卵物种数。而其余5项指标（如鲤科物种数、食虫性物种百分比等）则相关性较差，这可能与eDNA读长与个体数量的不完全对应关系有关。

此外，研究人员还探讨了影响eDNA检测效率的因素。逻辑回归分析表明，物种在GenBank上的12S序列可用数量及其最大体长（Total Length, TL）显著影响了该物种是否被eDNA检测到。具体而言，拥有更多参考序列和体型较大的物种更容易被eDNA方法捕获，这解释了为何某些小型底栖鱼类在eDNA数据中表现不佳。

在讨论部分，作者总结了eDNA-IBI的优势在于其能够利用存档样本、降低成本并增加采样点密度，同时仍能与长期建立的IBI框架保持一致。尽管存在参考数据库覆盖不全、引物偏好性以及eDNA丰度难以精确转化为个体数量等局限，本研究仍为在美国监管框架下实施eDNA-IBI奠定了重要基础。研究人员建议未来的工作应致力于扩大参考数据库的覆盖面，并探索结合eDNA与其他环境参数以提高生物评估的准确性。