人为产生的颗粒物和遗留污染物，结合转录组学及多生物标志物分析方法，用于综合评估比斯开湾两个地点的Mylitus galloprovincialis贻贝的健康状况

《Marine Pollution Bulletin》：Anthropogenic particles and legacy pollutants combined with transcriptomic and multi-biomarker responses for an integrated assessment of the health status of mussels Mytilus galloprovincialis in two locations of the Bay of Biscay

　　索尼娅·M·兰德罗（Sonia M. Landro）、兰斯福德·帕里（Ransford Parry）、伊莎贝拉·古铁雷斯-萨巴拉（Isabella Gutiérrez-Zabala）、纳戈雷·冈萨雷斯-索托（Nagore González-Soto）、索菲·莱科姆特（Sophie Lecomte）、艾德·比尔巴鄂（Eider Bilbao）、弗洛伦西亚·阿里盖蒂（Florencia Arrighetti）、米伦·P·卡哈拉维莱（Miren P. Cajaraville）

阿根廷布宜诺斯艾利斯“贝尔纳迪诺·里瓦达维亚”自然历史博物馆（MACNBR-CONICET）无脊椎动物部门海洋生态系统实验室（LEMar）

摘要

在比斯开湾（Bay of Biscay，BoB）中，广泛采用综合监测方法，结合污染物测量和生物标志物响应来研究海洋生态系统的健康状况。本研究旨在评估来自普伦齐亚河口（Plentzia）和阿里卢塞码头（Arriluze）的贻贝（Mytilus galloprovincialis）的健康状况，重点关注人为颗粒物（APs）、痕量金属、多环芳烃（PAHs）和多氯联苯（PCBs），并应用多生物标志物方法。在普伦齐亚检测到较高水平的人为颗粒物，包括微塑料（MPs），为未来的微塑料监测建立了基线数据。贻贝中PAHs和PCBs含量的下降趋势与过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶活性的无差异一致。阿里卢塞的沉积物中所有金属含量以及贻贝中的镉（Cd）和铅（Pb）含量较高。此外，阿里卢塞的DNA链断裂水平也较高。阿里卢塞的性别比例异常以及普伦齐亚的vcl转录水平表明可能存在内分泌干扰效应。阿里卢塞的嗜碱性细胞体积密度和组织病理学发生率较高，而普伦齐亚的Nematopsis sp.发生率显著，这突显了污染物与病原体之间的潜在相互作用。总体而言，综合生物标志物响应（IBR）指数显示阿里卢塞的压力水平高于普伦齐亚。这些结果有助于了解新兴污染物和遗留污染物的长期趋势，以及比斯开湾中作为监测物种的贻贝的健康状况，因为不同的压力和污染源可能同时作用。

1. 引言

持久性有机污染物（POPs），如多环芳烃（PAHs）和多氯联苯（PCBs），在水生环境中普遍存在，其有害生物效应已有充分记录（Vagi等人，2021年）。其他值得关注的人为化学物质包括金属，它们可以吸附在沉积物上并在各种水生生物体内积累（Yap等人，2002年；Gokul等人，2023年）。尽管国际公约已禁止使用多种POPs，包括PCBs，但PAHs仍通过化石燃料燃烧和石油泄漏释放（UNEP，2019年）。由于这些污染物的持久性，它们仍以能够引起毒性效应的浓度存在（Zorita等人，2008年；Vagi等人，2021年）。另一个近期环境问题是人为颗粒物（APs）的全球积累，主要由塑料组成。塑料通过多种途径进入水生环境，包括陆地人类活动、污水排放以及渔业和航运等海上活动（Xu等人，2020年；Vivekanand等人，2021年；Dusacre等人，2025年）。大型塑料会分解成微塑料（MPs，塑料颗粒<5毫米）和纳米塑料（NPs，<1微米）（GESAMP，2015年）。除了宏观塑料造成的明显物理和机械损伤外，微塑料和纳米塑料会在水生生物组织中生物累积，导致酶活性改变、基因毒性效应、免疫效应以及细胞和组织水平的变化（Xu等人，2020年；Sendra等人，2021年；González-Soto等人，2025年；Ramírez等人，2026年）。此外，由于微塑料的高表面积与体积比和疏水性，它们可以吸附其他污染物，其摄入会促进污染物进入生物体，这种现象称为“特洛伊木马”效应（González-Soto等人，2019年；Guo和Wang，2019年；Katsumiti等人，2021年）。结合化学分析与在监测生物体中测量的生物标志物或生理响应的综合评估被认为是评估环境健康状况的最佳方法，因为它们既提供了污染物检测信息，也提供了关于其潜在生物效应的信息（JPI-Oceans，2021年）。生物标志物可以根据其功能复杂性进行分类。虽然分子、细胞学和组织病理学响应具有更高的敏感性，并可作为早期预警信号，但生理响应整合了这些较低层次的过程，通过反映种群或群落层面的潜在影响而具有更大的生态相关性（Nicholson和Lam，2005年）。这些多层次响应已在海洋滤食性双壳类动物中得到广泛研究，例如蓝贻贝（Mytilus edulis）和地中海贻贝（M. galloprovincialis），它们被广泛认为是评估环境污染的有效生物指示物和监测物种（Goldberg，1975年；Cajaraville等人，2000年；Farrington等人，2016年），包括微塑料污染（Li等人，2019年）。

多年来，主要通过评估遗留污染物对M. galloprovincialis的影响来评估比斯开湾（BoB）不同地点的健康状况（Marigómez等人，2004年；Cajaraville等人，2006年，Cajaraville等人，2016年；Garmendia等人，2011a，Garmendia等人，2011b；Ortiz-Zarragoitia等人，2011年；de los Ríos等人，2016年）。这些评估涉及使用早期预警生物标志物方法研究不同生物组织层面的响应（Cajaraville等人，2000年；Lekube等人，2014年；Blanco-Rayón等人，2020年）。除了遗留污染物外，还报告了BoB中M. galloprovincialis中的微塑料（Reguera等人，2019年；Masiá等人，2022年）。在BoB中，比尔巴鄂河口因规模较大、历史上的工业活动导致的高污染水平以及长期的监测历史而受到特别关注（Prieto等人，2008年；Rodríguez等人，2009年；Bartolomé等人，2010年；Puy-Azurmendi等人，2013年；Cajaraville等人，2016年；Briaudeau等人，2019年）。尽管遗留污染物及其对贻贝的影响显著减少（Borja等人，2010年；Cajaraville等人，2016年；Iriarte等人，2016年；Briaudeau等人，2019年），但对新兴污染物（如微塑料）及其对生态系统潜在影响的研究仍然有限（Mendoza等人，2020年）。此外，之前的研究评估了BoB中贻贝对环境压力的转录响应，但仅评估了两个基因（de los Ríos等人，2013年，de los Ríos等人，2016年）。

为了解决这些限制并提供关于BoB选定地点健康状况的新见解，我们进行了沉积物和贻贝组织的化学分析，以及多生物标志物分析，作为综合评估的一部分。研究的生物标志物包括：a) 辛酰辅酶A氧化酶1（aox1）的基因转录，这是过氧化物酶体增殖的标志物；过氧化氢酶（cat），参与抗氧化反应；谷胱甘肽-S-转移酶pi 1（gstpi），这是II期生物转化代谢的标志物；金属硫蛋白-20（mt20），指示金属暴露；卵黄膜赖氨酸（vcl），这是雄性特异性标志物；b) AOX1酶活性作为过氧化物酶体增殖的生物标志物（Cajaraville等人，2003年）；c) 微核（MN）频率和DNA链断裂，指示DNA损伤（Siu等人，2004年）；d) 自动金属图谱黑银沉积物（BSDs）的体积密度，用于测量金属生物可利用性（Soto和Marigómez，1997年）；e) 组织水平的生物标志物和组织病理学分析，指示总体压力（Garmendia等人，2011b；Bignell等人，2012年；González-Soto等人，2019年；Ramírez等人，2026年）。还测量了生理响应，如配子发育改变、生殖腺指数（GI）和状况指数（CI），以评估贻贝的整体健康状况（Davies和Vethaak，2012年）。最后，将多生物标志物数据整合到综合生物标志物响应（IBR）指数中，以简化生物响应的排名和解释（Beliaeff和Burgeot，2002年）。

2. 材料与方法

2.1. 研究地点和采样

在比斯开湾（BoB）选择了两个地点：阿里卢塞（Arriluze），位于比尔巴鄂河口的外部，以及普伦齐亚（Plentzia），位于布特罗河口（图1）。阿里卢塞（43°20′48″N，3°01′42″W）是一个历史上受污染的地区，如引言中提到的，显示出恢复的迹象。相比之下，普伦齐亚（43°24′38″N，2°57′2″W）条件相对清洁，主要受季节性旅游影响，农业和工业活动较少（Saiz-Salinas，1997年；Cortada和Collins，2013年；Lekube等人，2014年）。这种对比使得普伦齐亚成为环境监测研究的常用参考地点，特别是与阿里卢塞相比（Soto等人，1995年；Saiz-Salinas，1997年；Orbea等人，1999年；Orbea和Cajaraville，2006年；Lekube等人，2014年；Blanco-Rayón等人，2020年）。采样于2021年6月进行，使用数字多参数传感器（EXO? Multiparameter Sonde，YSI）记录了环境数据，包括水温、盐度和pH值。

从每个地点收集了表层沉积物样本（n = 4个，每个55克），并储存在-40°C。在低潮时从两个地点的岩石潮间带收集了成年M. galloprovincialis样本（壳长3.5–4.5厘米）（n = 每个地点120个）。贻贝被带到实验室，并根据具体的分析计划分为五组进行解剖、处理、固定和储存（图S1）。五只贻贝（第1组）储存在-20°C以评估人为颗粒物（APs），包括微塑料（MPs）。二十只贻贝（第2组）净化48小时，解剖并单独称重，带壳和不带壳，使用电子秤（Sartorius CP225D）确定状况指数（CI）。然后，将它们合并成四个重复样本（每个5只贻贝），储存在-40°C以进行金属生物累积分析。六十只贻贝（第3组）净化24小时，解剖并称重，合并成三个重复样本（每个20只贻贝），储存在-40°C以进行PAHs和PCBs生物累积分析。二十只贻贝（第4组）被解剖以获取消化腺（DG）和生殖腺组织（GT），用于后续的转录组和酶活性分析。每个DG被分成两半并单独称重。一半立即浸入RNAlater溶液（Sigma-Adrich）中，在-80°C下提取RNA，而另一半在液氮中冷冻保存，然后储存在-80°C以分析过氧化物酶体AOX1活性。一小部分生殖腺用10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定以确定性别。剩余的组织被称重并储存在RNAlater中，在-80°C下用于后续RNA提取。使用1毫升注射器从10只贻贝的后收肌中小心提取血淋巴液以进行基因毒性评估。然后，贻贝被解剖，DG和GT用10% NBF固定以进行组织学分析。

2.2. 贻贝组织中人为颗粒物和微塑料的鉴定

2.2.1. 质量保证和质量控制

所有程序均按照标准化协议实施，并包括程序空白对照（Bessa等人，2019年）。穿着棉质实验服和丁腈手套，避免使用易碎织物。所有溶液均使用0.8微米GF/F过滤器（Whatman，Kent，英国）过滤。仅使用预先清洁（用过滤乙醇）的玻璃和金属材料。样本解剖、试剂处理和过滤在2级生物安全柜内进行。样本在任何外部处理过程中都保持覆盖。所有实验室表面和设备（工作台、柜子、立体显微镜、FTIR光谱仪）定期用过滤乙醇清洁。

2.2.2. 提取和鉴定

第1组贻贝在2级生物安全柜中解冻和解剖。单个样本在玻璃小瓶中冻干并密封保存，直到消化。消化前，样本用20毫升过滤蒸馏水过夜重新水化。去除水分后，组织在60°C下用10% KOH（10:1 v/w比例）消化24–72小时（Lefebvre等人，2023年）。消化物通过0.65微米聚偏二氟乙烯（PVDF）过滤器（Durapore?，Merck，Darmstadt，德国）在真空（80毫巴泵）下过滤。过滤器储存在预先清洁（乙醇）的玻璃培养皿中，并用聚膜密封，直到目视检查。在立体显微镜（Olympus SZX2-ILLTQ，东京，日本；放大倍数×2–×6.2）下对过滤器进行目视检查。观察到的颗粒根据颜色、形态类型和大小进行分类（Bessa等人，2019年），用金属镊子拍照并提取以进行聚合物鉴定。所有提取的颗粒通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）（Thermo Nicolet Nexus 870，新加坡）进行分析。光谱（4000–600厘米^-1，4厘米^-1分辨率，200次扫描）使用MCT探测器获取。应用高级ATR和手动基线校正（OMNIC软件V9.2.98，Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）。通过将光谱与商业（Thermo Fisher）和内部库匹配，并根据既定标准进行手动验证来鉴定聚合物（Lefebvre等人，2023年）。分析过程中没有颗粒丢失，程序空白对照中也未检测到颗粒。结果以每个个体和每克组织（湿重）的颗粒数以及聚合物组成表示。

2.3. 沉积物和贻贝中遗留污染物的化学分析

第2组的沉积物和贻贝样本在EUROFINS IPROMA（Castellón，西班牙）使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析Al、As、Cd、Cr、Cu、Fe、Ni、Pb、Se和Zn，该机构由ENAC（西班牙国家认证机构）认证。在EUROFINS IPROMA实验室中，使用气相色谱-质谱（GC–MS）技术分析了沉积物（n = 4）和第三组贻贝（n = 3）中的有机化合物，包括多环芳烃（PAHs，共16种，属于美国环保署的优先监测清单）和多氯联苯（PCBs，共11种）。PAHs、PCBs和金属的分析使用了美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，位于马里兰州盖瑟堡）提供的认证参考物质2977。参考效应范围中值（ERM）用于指示经常出现不良效应的浓度阈值（Long等人，1995年），以此来评估金属、PAHs和PCBs的含量。沉积物质量指南商数（SQG-Qs）是通过将个别化学物质的含量与其相应的ERM值进行比较计算得出的，用于判断污染物引起生物不良效应的潜在可能性（Long等人，2006年）。最后，根据MacDonald等人（2004年）的分类标准，将沉积物分为以下三类：SQG-Q < 0.1 = 未受影响的沉积物；0.1 > SQG-Q < 1 = 中度受影响的沉积物；SQG-Q > 1 = 严重受影响的沉积物。

2.4 多生物标志物响应
2.4.1 基因转录分析
由于先前的研究已经记录了M. galloprovincialis的性别依赖性基因转录模式（Banni等人，2011年），在完成组织学性别鉴定后，从第四组中选取了10只雄性贻贝，对其5个目标基因进行了实时定量PCR（RT-qPCR）分析。总RNA使用miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）从雌性生殖腺（DGs，每份10毫克）和雄性生殖腺（GTs，每份30毫克）中提取。提取的数量和质量通过Agilent RNA 6000 Nano Kit芯片和2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）按照制造商的说明进行了检测。RNA样本被稀释至2 μg/μL的浓度，并使用cDNA合成试剂盒在SimpliAmp?热循环仪（Agilent Technologies）中转化为cDNA。选定的DG基因包括aox1、cat、gstpi和mt20，而GT基因则选择了vcl。特异性引物是通过开源软件Primer-3（Rozen和Skaletsky，2000年）设计的，并使用Primer Express? 3.0（Applied Biosystems）软件验证了引物序列。这些引物用于针对从GenBank数据库（NCBI）中获取的mRNA序列。所有引物信息，包括核苷酸序列、熔解温度、RT-qPCR反应中使用的最终浓度以及样本稀释倍数，均记录在表S1中。基因转录水平使用SYBR? Green染料在ViiA7 Applied Biosystems实时热循环仪（Thermo Fisher Scientific）上进行定量。每个基因在384孔板中重复三次扩增，总反应体积为20 μL：10 μL的SYBR? Green染料，每种引物0.5–1 μL，以及2 μL的稀释cDNA（aox1、cat和vcl为1:10；gstpi1为1:5；mt20为1:1）。每个基因的最佳引物和样本浓度已在表S1中详细说明，并且在相同的反应条件下每个孔中都进行了三次无模板对照（NTC）实验。

2.4.2 过氧化物酶体AOX1活性
在对个体进行组织学性别鉴定后，从第四组中选取了10只雄性贻贝，按照de los Ríos等人（2013年）的方法测量棕榈酰辅酶A氧化酶1（AOX1）的活性。样品在TVBE缓冲液（pH 7.6）中解冻并匀浆，然后在Allegra X-30R离心机中以500 ×g的离心力在4°C下离心15分钟。接着收集上清液100 μL并稀释至TVBE冷缓冲液（1:5 v/v），而剩余的上清液则储存在-40°C下，用于后续使用Bradford方法（Bradford，1976年）进行蛋白质含量分析。稀释后的样品在502 nm波长下通过分光光度法测定AOX1活性。结果以mU AOX1/mg蛋白质（平均值±标准差）表示，以标准化每个样本中的蛋白质含量。

2.4.3 基因毒性评估
通过微核（MN）频率测试和彗星试验来评估DNA损伤的发生情况，所用样本来自第5组贻贝。从后闭肌中抽取血淋巴液，取50 μL样品并稀释至10 mM EDTA海水（SW）抗聚集溶液中（1:9 v/v），按照de los Ríos等人（2013年）的方法进行MN频率测试。血淋巴细胞使用市售的Hemacolor?试剂盒（Merck）按照制造商的说明进行染色，并在Olympus BX50显微镜下以100倍放大倍数进行盲法观察。随机选取1000个透明细胞进行计数，根据Bolognesi和Fenech（2012年）的标准评估含有MN和核异常的细胞比例。另外取250 μL血淋巴液稀释至10 mM EDTA SW中（1:1 v/v），按照Duroudier等人（2021年）的方法进行彗星试验。在彗星试验之前，使用Trypan Blue排除试验确定所有样本的细胞活力，活力始终超过80%，确认样本适合进行基因毒性评估。然后，将200 μL稀释后的血淋巴液以300 ×g的离心力离心10分钟，沉淀物重新悬浮在200 μL 0.5%低熔点琼脂糖溶液中。每个贻贝样本制备两张载玻片，每张载玻片使用2-well Trevigen CometSlide?和30 μL的制备溶液（每个孔15 μL）。载玻片在4°C的黑暗冷却室中孵育10分钟，然后浸入Trevigen CometAssay?试剂盒提供的裂解溶液中1小时。裂解后，用蒸馏水清洗载玻片，并将其转移到装有碱性电泳缓冲液（1 N NaOH，200 mM EDTA，pH 13）的电泳槽中20分钟。电泳后，以1 V/cm的电流进行30分钟的电泳，随后将载玻片浸入冷中和缓冲液（0.4 mM Tris-HCl，pH 7.5）中10分钟。最后，在-20°C的甲醇中固定载玻片3分钟，然后用荧光染料SafeGreen?进行染色，使用Olympus DP74荧光显微镜在20倍放大倍数下观察。使用OpenComet v1.3.1软件扩展版（ImageJ）分析每个贻贝中随机选取的100个细胞的DNA损伤程度，通过测量彗尾中DNA的百分比（%tail DNA）来量化。

2.4.4 组织水平的生物标志物和组织病理学
对第五组雌性生殖腺（n = 10）和第四组雄性生殖腺（n = 20；第五组雄性生殖腺，n = 10）的样本应用了标准的组织学处理程序。石蜡切片用苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察，并用数码相机（Zeiss AXIOCAM HRc）以40倍放大倍数拍摄照片。为了测量雌性生殖腺管状结构的形态变化，根据Bignell等人（2012年）的方法计算了MLR/MET比率（μm/μm）和MET/MDR比率（μm/μm），其中MET表示平均上皮厚度，MDR表示平均憩室半径，MLR表示平均管腔半径。分析在每个贻贝的5个随机选取的管状结构中进行（每个部位50个管状轮廓），使用Axio Vision Rel. 4.8图像分析软件（Arrighetti等人，2019年）。通过basophilic细胞的体积密度（VvBAS）（Bignell等人，2012年）评估消化管状结构的细胞组成，并使用免费软件STEPanizer1（Arrighetti等人，2019年）根据connective-to-diverticula（CTD）比率研究雌性生殖腺组织的完整性。对于雌性生殖腺和雄性生殖腺的组织病理学分析，每个贻贝的载玻片在光显微镜（AXIOPLAN 2 Zeiss?）下进行观察。每种改变的普遍程度（P）通过受影响个体数量与分析个体总数的比值乘以100来计算（Kim等人，2006年）。每种改变的评分根据Kim等人（2006年）的半定量标准进行，具体修改如下：0 = 无改变；1 = 轻微（存在于<25%的组织中）；2 = 中度（存在于25–75%的组织中）；3 = 严重（存在于>75%的组织中）。然后，每种改变的强度通过将评分与受影响个体数量的比例来计算（Garmendia等人，2011b）。

2.4.5 自动金属沉积物定量
为了评估雌性生殖腺细胞溶酶体中金属沉积物的存在，按照制造商的说明使用AURION?（R-Gent SE-LM，荷兰瓦赫宁根）银增强试剂盒处理第五组贻贝的组织学切片（n = 10）。随后用HE进行复染，并使用AXIOPLAN 2 Zeiss?显微镜观察。还包括了Jimeno-Romero等人（2017年）进行的银（Ag）暴露实验的切片作为阴性对照（未暴露于Ag的贻贝）和阳性对照（暴露于750 μg/L Ag的贻贝）。黑色银沉积物（BSD）的定量按照Soto和Marigómez（1997年）的方法进行。

2.4.6 生殖细胞发育和性腺指数
使用HE染色的雄性生殖腺切片根据Seed（1969年）的方法确定性别比例和生殖细胞发育阶段。每个贻贝的性腺指数（GI）使用半定量标准进行评估，该标准改编自Ortiz-Zarragoitia和Cajaraville（2010年）的描述：1 = 休眠阶段（不活跃或未分化，无法观察到性别特征）；2 = 发育阶段（生殖细胞生成进行中）；3 = 成熟阶段（性腺完全成熟，充满卵子或精子）；4 = 产卵阶段（生殖细胞活跃释放）；5 = 产卵后阶段（卵泡为空，部分残留的生殖细胞正在发生细胞溶解）。然后计算每组雄性和雌性贻贝的平均GI。

2.4.7 一般状况指数
在确定金属含量之前，使用电子秤（Sartorius CP225D）分别称量有壳和无壳的第二组贻贝的重量，以计算一般健康状况的指数（CI）。个体CI计算为贻贝的软组织重量与贻贝总重量（即壳、软组织和淡色液）的比值乘以100（Arrighetti等人，2019年）。

2.5 生物反应的整合：IBR指数
整合生物反应指数（IBR）作为环境压力的指标（Beliaeff和Burgeot，2002年）。然后，IBR指数除以生物反应的数量来计算IBR/n。只有在不同地点之间存在统计学显著差异的生物反应被用于计算（Broeg和Lehtonen，2006年）。每个生物标志物对最终IBR值的贡献以累积条形图的形式表示（de los Ríos等人，2016年）。

2.6 统计分析
统计分析使用STATISTICA 13（StatSoft, Inc.）和SPSS 28（IBM Analytics，阿蒙克，纽约）软件包进行。显著性水平设定为p < 0.05。生物参数的数据集经过正态性检验（Shapiro-Wilk检验）和方差齐性检验（Levene检验）。随后使用Student's t检验进行地点间的成对比较（cat、aox1、mt20和vcl的转录水平；MN和核芽频率；%tail DNA；MLR/MET、MET/MDR；以及CI的数据）。当正态性和方差齐性假设不成立时，使用非参数Mann-Whitney's U检验进行地点间的成对比较（包括APs、贻贝和沉积物样本中的金属、PAHs和PCBs水平；gstpi1转录水平；AOX1酶活性；VvBAS；CTD；组织病理学改变的强度；GI的数据）。地点间组织病理学改变的普遍程度使用Fisher's精确检验进行分析。性别比例使用卡方检验（?2）进行分析，以确定观察到的比例是否符合该物种的预期比例（1:1）。

3. 结果
Plentzia（T° = 18.6°C，pH = 7.8）和Arriluze（T° = 18.8°C，pH = 7.6）之间的表层水温和pH值变化很小。正如预期的那样，由于Arriluze位于河口，其盐度（26.78 psu）低于Plentzia（34.23 psu）。

3.1 贻贝软组织中的人为颗粒
在任何空白样本中均未观察到APs。所有Plentzia的贻贝组织中都存在APs，而Arriluze中只有一只贻贝存在一个AP。Plentzia中每个个体和每单位湿重的APs丰度显著高于Arriluze（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）（图2A，B）。关于形态类型，在Plentzia的贻贝中发现的颗粒中，80%是纤维（5个中有4个），20%是颗粒（5个中有1个），而在Arriluze的贻贝中发现的唯一颗粒是一根黑色纤维（图S2，表S2）。在Plentzia，观察到的纤维中有75%是蓝色的，25%是黑色的，而观察到的唯一颗粒也是黑色的（图S2，表S2）。下载：下载高分辨率图像（135KB）下载：下载全尺寸图像图2. Plentzia和Arriluze的Mytilus galloprovincialis贻贝软组织中人为颗粒的丰度及其聚合物鉴定。A. 每个个体中的颗粒数量（平均值±标准差）。B. 每个个体湿重（克）中的颗粒数量（平均值±标准差）。C. 根据所有个体中颗粒的累积数量进行聚合物鉴定。D. 每总湿重（克）中的颗粒累积数量。星号表示地点之间的统计学显著差异（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）。PA：聚酰胺，PE：聚乙烯。所有AP都通过ATR-FTIR进行了分析，并确定了它们的聚合物组成。发现了三种不同的聚合物：纤维素、聚酰胺（PA）和聚乙烯（PE）。在Plentzia的贻贝中，纤维素是最丰富的聚合物（60%），其次是PA，而在Arriluze的贻贝中发现的颗粒是PE（图2C，D）。3.2. 沉积物中遗留污染物的化学分析及其毒理学意义Plentzia和Arriluze的沉积物样本中痕量金属、总多环芳烃（∑PAHs）和总多氯联苯（∑PCBs）的浓度见表1。表1. Plentzia和Arriluze沉积物样本中痕量金属（μg/g，干重，dw）、总PAHs（ng/g dw）和总PCBs（ng/g dw）的浓度（平均值±标准差）。地点之间的统计学显著差异用粗体表示（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）。还包括沉积物质量指南商数（SQG-Qs）以指示潜在的毒理学意义。污染物DLPlentziaArriluzeSQG-QPlentziaSQG-QArriluzeAl10004477.5 ± 1065.725,927.8 ± 10,655.3––As1.011.0 ± 1.430.0 ± 7.40.160.43Cd0.050.06 ± 0.010.9 ± 0.30.010.10Cu10>500–> 1.85Cr1.06.0 ± 1.465.0 ± 21.30.020.18Fe1006967.8 ± 26930,143.3 ± 5679.6––Ni3.031 ± 10.2–0.60Pb3.07.5 ± 1.3166.3 ± 24.30.030.76Se0.20.9 ± 0.11.8 ± 0.4––Zn1033.8 ± 6.13276.3 ± 1724.40.087.99∑PAHs (16)20.02419.75 ± 406.742667 ± 940.220.050.06∑PCBs (11)2.0–4.02.50 ± 5040.82 ± 6.120.020.23DL：检测限：痕量金属（μg/g，dw）；总PAHs和总PCBs（ng/g dw）。总体而言，两种地点都检测到了金属（Al、As、Cd、Cr、Cu、Fe、Ni、Pb、Se、Zn）（Plentzia的Cu和Ni除外），且Arriluze中的所有金属浓度显著高于Plentzia（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）。这些结果表明Arriluze的沉积物受到中度到重度的金属污染，其中Cu和Zn的毒理学意义最高（表1）。尽管某些特定PAHs在Arriluze中的水平显著高于Plentzia（表S3），但两地之间的∑PAHs浓度没有显著差异（Mann-Whitney's U检验，p > 0.05）。然而，两地的一些SQG-Q值高于0.1（表S3）。Arriluze沉积物中的总PCBs（∑PCBs）浓度显著高于Plentzia（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05，表1）。在Plentzia，所有分析的PCB同系物都低于检测限（除了PCB 149），而在Arriluze，虽然检测到了一些PCB，但其浓度仍然较低（表S4）。然而，根据SQG-Q值，Arriluze的沉积物受到中度污染（表1）。3.3. 贻留污染物在贻贝中的生物累积在Mytilus galloprovincialis的软组织中，Plentzia和Arriluze样本中的Cr、Cu和Ni浓度均低于检测限（表2）。Arriluze的贻贝中Cd和Pb的浓度显著较高（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05），而As在Plentzia中较高（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）。其余金属在两地之间没有显著差异（Mann-Whitney's U检验，p > 0.05，表2）。表2. Plentzia和Arriluze的Mytilus galloprovincialis贻贝中痕量金属（μg/g，干重，dw）、总PAHs（ng/g dw）和总PCBs（ng/g dw）的浓度（平均值±标准差）。地点之间的统计学显著差异用粗体表示（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）。另一方面，∑PAHs和∑PCBs的浓度在两地贻贝中均低于检测限（5.0 ng/g和1.0 ng/g）。3.4. 多生物标志物响应3.4.1. 基因转录分析Arriluze的贻贝中aox1的转录水平显著高于Plentzia的贻贝，而vcl的转录水平在Plentzia的贻贝中显著高于Arriluze的贻贝（Student's t检验，p < 0.05）。相反，cat、mt20或gstpi1基因的转录水平没有显著差异（Student's t检验，p > 0.05 for cat和mt20；Mann-Whitney's U检验，p > 0.05 for gstpi1）（图3）。下载：下载高分辨率图像（147KB）下载：下载全尺寸图像图3. Plentzia和Arriluze的Mytilus galloprovincialis贻贝中目标基因的转录水平（以相对于Plentzia和Arriluze组的log2相对量RQ表示）。在消化腺中评估的基因：A. aox1，B. cat，C. gstpi1，D. mt20。在生殖腺组织中评估的基因：E. vcl。箱线图显示了中位数（水平线）、25%–75%四分位数（箱）和标准差（须）。星号表示地点之间的统计学显著差异（aox1、cat、mt2和vcl：Student's t检验；gstpi1：Mann-Whitney's U检验；p < 0.05）。3.4.2. 过氧化物酶体AOX1活性Plentzia和Arriluze的贻贝中AOX1活性（mU/mg蛋白）没有显著差异（Mann-Whitney's U检验，p > 0.05）（图4A）。下载：下载高分辨率图像（174KB）下载：下载全尺寸图像图4. Plentzia和Arriluz的Mytilus galloprovincialis贻贝中的多生物标志物评估。A. 贻贝消化腺中的AOX1活性（mU/mg蛋白）。B. 贻贝透明细胞中微核（MN）和核芽的频率（‰）。C. 贻贝血细胞中的DNA链断裂（%tail DNA）。D. 消化管的形态测量，表示为平均管腔半径与平均上皮厚度（MLR/MET；μm/μm）和平均上皮厚度与平均憩室半径（MET/MDR；μm/μm）。E. 消化腺上皮中的嗜碱性细胞体积密度（VvBAS；μm3/μm3）。F. 消化腺组织中结缔组织与消化憩室（CTD；μm3/μm3）的比例。数值表示为平均值±标准差。星号表示地点之间的统计学显著差异（p < 0.05）（A、E、F：Mann-Whitney's U检验；B–D：Student's t检验）。3.4.3. 基因毒性评估Plentzia和Arriluz的贻贝透明细胞中的MN频率相似（Student's t检验，p > 0.05）。然而，Arruz的贻贝透明细胞中的核芽频率显著更高（Student's t检验，p < 0.05）（图4B）。彗星试验显示两地血细胞中的DNA链断裂有显著差异：Arruz的贻贝中尾DNA的百分比高于Plentzia的贻贝（Mann-Whitney's U，p < 0.05）（图4C）。3.4.4. 组织水平的生物标志物和组织病理学Plentzia和Arruz的贻贝消化管的形态测量分析显示，Plentzia的贻贝的MLR/MET比率显著高于Arruz的贻贝（Student's t检验，p < 0.05），而MET/MDR比率较低（图4D）。Arruz的贻贝中嗜碱性细胞的体积密度（VvBAS）显著更高（Mann-Whitney's U，p < 0.05）（图4E）。然而，两地贻贝的CTD比率没有显著差异（Mann-Whitney's U，p > 0.05）（图4F）。Plentzia和Arruz的贻贝中观察到几种组织病理学改变。然而，这些改变在两地的流行率（Fisher's exact检验，p > 0.05）或强度（Mann-Whitney's U检验，p > 0.05）上没有显著差异（表3）。表3. Plentzia（P）和Arruz（A）的Mytilus galloprovincialis贻贝消化腺和生殖腺组织中组织病理学改变的流行率（%）和强度（基于半定量尺度）。地点之间的统计学显著差异用粗体表示（流行率：Fisher's exact检验，强度：Mann-Whitney's U检验；p < 0.05）。空细胞组织病理学改变流行率（%）强度PAPAD消化腺消化组织消化细胞空泡化80501.61.2消化细胞中的脂褐素样聚集物505011.2嗜碱性细胞增生60801.52.1消化管上皮萎缩100801.71消化管上皮坏死801001.31.3结缔组织血细胞浸润90901.61.4粒细胞瘤305011.2纤维化80701.31.1结缔组织中的色素细胞100501.41.2寄生虫病纤毛虫1001002.11.6Mytilicola sp.102011Nematopsis sp.100102.21其他寄生虫01001生殖腺组织生殖组织卵细胞闭锁60401.81.5卵细胞坏死60401.51卵泡中的色素细胞02001结缔组织血细胞浸润80401.41.8粒细胞瘤40501.81.2寄生虫病Nematopsis sp.70010Plentzia和Arruz的贻贝消化腺和生殖腺组织中的组织病理学改变的流行率（%）和强度（基于半定量尺度）。表3。Plentzia和Arruz的Mytilus galloprovincialis贻贝消化腺和生殖腺组织中组织病理学改变的流行率（%）和强度（基于半定量尺度）。空细胞组织病理学改变流行率（%）强度PAPAD消化腺消化组织消化细胞空泡化80501.61.2消化细胞中的脂褐素样聚集物505011.2嗜碱性细胞增生60801.52.1消化管上皮萎缩100801.71消化管上皮坏死801001.31结缔组织血细胞浸润90901.61.4粒细胞瘤305011.2纤维化80701.31结缔组织中的色素细胞100501.41.2寄生虫病纤毛虫1001002.11.6Mytilicola sp.102011Nematopsis sp.100102.21其他寄生虫01001生殖腺组织生殖组织卵细胞闭锁60401.81.5卵细胞坏死60401.51卵泡中的色素细胞02001结缔组织血细胞浸润80401.41.8粒细胞瘤40501.81.2寄生虫病Nematopsis sp.70010Plentzia和Arruz的贻贝消化腺和生殖腺组织中观察到的组织病理学改变的流行率和强度相似（表3，图S3）。虽然消化管上皮萎缩（图5A）在两地都存在且流行率较高，但在Plentzia更为明显（Mann-Whitney U检验，p < 0.05）。在结缔组织中，血细胞浸润、粒细胞瘤和纤维化在两地都存在，但流行率和强度没有显著差异（表3，图S3）。Plentzia的所有个体中都存在棕色细胞（图5B），且其流行率高于Arruz（Fisher's exact检验，p < 0.05），尽管两地的强度相似（表3）。Plentzia的贻贝消化管上皮萎缩（图5A）的流行率较高（Mann-Whitney U检验，p < 0.05）。在结缔组织中，血细胞浸润、粒细胞瘤和纤维化在两地都存在，但流行率和强度没有显著差异（表3，图S3）。Plentzia和Arruz的贻贝消化管和生殖腺的组织病理学改变有多种。然而，这些改变在两地的流行率（Fisher's exact检验，p > 0.05）或强度（Mann-Whitney's U检验，p > 0.05）上没有显著差异（表3）。图5. Plentzia和Arruz的Mytilus galloprovincialis贻贝的组织学横截面显微照片，显示不同的组织病理学改变。A. Plentzia贻贝消化腺中的萎缩管（at）。B. Plentzia贻贝消化腺结缔组织中的棕色细胞（虚线椭圆）。C. Arruz贻贝消化管管间隙中的Nematopsis sp.孢子囊（箭头）。D. Plentzia雄性贻贝的生殖腺，其中结缔组织中有Nematopsis sp.（箭头）。比例尺：A-B：100 μm；C-D：50 μm。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）在生殖腺中，两地都观察到卵细胞闭锁和坏死，流行率和强度相似。Plentzia和Arruz的卵泡中的棕色细胞很少见，仅在Arruz中观察到。血细胞浸润和粒细胞瘤在两地都存在，但没有显著差异（表3，图S4）。关于寄生虫病，所有个体的消化管中都观察到细胞内纤毛原生动物，强度相似。其他寄生虫，如Mytilicola sp.桡足类和未鉴定的生物，流行率和强度较低（表3，图S5）。Nematopsis sp.（顶复门）的孢子囊在Plentzia的流行率显著高于Arruz（Fisher's exact检验，p < 0.05；表3）。这些生物在Plentzia所有个体的消化管周围结缔组织中观察到，但在Arruz仅在一个个体中观察到（图5C，表3）。此外，它们也存在于Plentzia贻贝的生殖腺结缔组织中（图5D）。3.4.5. 自动金属成像金属沉积AURION?银增强试剂盒被证明具有敏感性，并区分了阳性对照和阴性对照。然而，在Plentzia和Arruz的Mytilus galloprovincialis的组织切片中未检测到金属沉积。3.4.6. 配子发育和生殖腺指数在Plentzia，观察到的性别比例与预期的1:1比例没有显著差异（?2检验；p > 0.05）。相比之下，Arruz的雄性比例高于雌性（3M:1F；?2检验，p < 0.05）（图6A）。在Plentzia发现了一个雌雄同体的贻贝（主要是雌性，带有两个小雄性卵泡）。下载：下载高分辨率图像（155KB）下载：下载全尺寸图像图6. Plentzia和Arruz的Mytilus galloprovincialis雄性和雌性贻贝的性别比例和配子发育。A. 观察到的性别频率百分比。B. 配子发育阶段百分比（用条形表示）和生殖腺指数（用圆圈表示，平均值±标准差）。两地雄性和雌性之间没有显著差异（Mann-Whitney's U检验，p < 0.05）。Plentzia的几乎所有雄性都处于产卵阶段（92%），只有少数处于发育阶段（8%），而在Arruz，雄性处于产卵阶段的比例较小（76%），还有一些个体处于产后阶段（14%）。此外，Arruz的贻贝中有处于发育和成熟阶段的个体（各5%）。两地的雌性主要处于产卵阶段（Plentzia 71%，Arruz 67%），产后阶段的个体比例较小（Plentzia 29%，Arruz 33%）。两地都没有观察到休眠阶段的贻贝（图6B）。两地的雄性和雌性的生殖腺指数（GI）值相似（图6B），没有显著差异（Mann-Whitney's U，p > 0.05）。3.4.7. 总体状况指数Plentzia的贻贝的平均状况指数（CI）（16.05 ± 3.06）显著低于Arruz的贻贝（20.16 ± 4.35）（平均值±标准差；Student's t检验，p < 0.05）。3.5. 综合生物反应从表现出地点间统计学显著差异的生物反应中计算了IBR/n：aox1和vcl的转录水平、核芽频率、%tail DNA、MLR/MET和MET/MDR比率、VvBAS值、组织病理学改变的流行率（即消化腺结缔组织中的棕色细胞和消化管及生殖腺中的Nematopsis sp.），以及CI。在Plentzia，所有分析的生物反应对IBR的贡献相对均衡。最高的贡献值与消化腺（DG）中棕色细胞的普遍性、aox1转录水平以及GT和DG中Nematopsis sp.的普遍性相关，而最低的值则与核芽的频率和尾部DNA的百分比相关（图7）。相比之下，在Arriluze，对IBR贡献最大的生物标志物是MET/MDR和MLR/MET比率、aox1转录水平、核芽以及尾部DNA的百分比（图7）。此外，最低的贡献值与DG和GT中Nematopsis sp.的普遍性以及DG中棕色细胞的普遍性相关。总体而言，Plentzia的IBR/n值为1.31（IBRPlentzia = 14.4），Arriluze的IBR/n值为1.57（IBRArriluze = 17.3）（图7）。下载：下载高分辨率图像（79KB）下载：下载全尺寸图像图7. 来自Plentzia和Arriluze的贻贝Mytilus galloprovincialis的整合生物响应。IBR的直方图是根据10个标准化生物标志物响应生成的面积计算得出的。aox1：aox1转录水平，CI：条件指数，MLR/MET：平均管腔半径与平均上皮厚度之比，MET/MDR：平均上皮厚度与平均憩室半径之比，vcl：vcl转录水平，VvBAS：嗜碱性细胞的体积密度，%P Nematopsis dg：消化腺中Nematopsis sp.的普遍性（%），%P Nematopsis gon：生殖腺组织中Nematopsis sp.的普遍性（%），%P Brown cells dg：消化腺中棕色细胞的普遍性。（关于此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网络版本。）4. 讨论比斯开湾（BoB）有着完善的监测历史，尤其是在2002年“Prestige”石油泄漏事件之后，该事件确立了贻贝M. galloprovincialis作为关键指示物种的地位（Cajaraville等人，2006；Marigómez等人，2006）。虽然像毕尔巴鄂（Arriluze）这样的河口的遗留污染显示出恢复趋势（Cajaraville等人，2016；Briaudeau等人，2019），但新兴污染物如微塑料（MPs）带来了新的挑战，因为关于它们在该地区的丰度和生物效应的数据有限（Mendoza等人，2020）。本研究提供了对来自两个比斯开湾河口的贻贝中人为颗粒（APs/MPs）和遗留污染物的综合评估，这两个河口面临着不同的压力：一个是历史上工业化的毕尔巴鄂河口（Arriluze），另一个主要受到休闲船只和城市废水影响的Butroe河口（Plentzia，Mijangos等人，2018）。我们的分析确认纤维是贻贝中最主要的AP形态类型，这与全球和地区的报告一致（Li等人，2019；Br?te等人，2020；Mendoza等人，2020；Lefebvre等人，2023）。这种纯蓝色和黑色的着色与比斯开湾生物群通常报告的更广泛的颜色谱（白色、黑色、蓝色、灰色）形成对比（Mendoza等人，2020）。由于灰色调通常表示环境风化（Phuong等人，2018），这里观察到的未风化的颜色可能表明这些颗粒是相对较新输入的。双壳类动物中AP的丰度根据地理位置和当地人类活动而显著变化（Digka等人，2018；Li等人，2019），这一趋势在比斯开湾也有观察到（Mendoza等人，2020；Lefebvre等人，2023）。在Plentzia，每个个体和每单位湿重的AP浓度与比斯开湾北部报告的较低值相当（Phuong等人，2018），但远低于南部地区（Reguera等人，2019；Masiá等人，2022）。Arriluze的贻贝显示了迄今为止记录的最低值。这些减少的计数，特别是在Arriluze几乎不存在AP，可能反映了COVID-19封锁期间人类活动的显著减少。航海作业和港口交通的减少可能显著降低了码头环境中的颗粒输入。然而，需要进一步在封锁后进行更大样本量的采样，以确认这些低丰度是持续的趋势还是暂时的减少。准确的聚合物鉴定对于有效的MP评估至关重要。虽然聚丙烯（PP）和聚乙烯（PE）通常在比斯开湾的报告中占主导地位（Mendoza等人，2020），但我们的结果显示了不同的组成：Plentzia的贻贝含有60%的纤维素和40%的聚酰胺（PA），而在Arriluze的贻贝中发现的纤维是PE。这种差异可能反映了不同的来源：Plentzia中的纤维素和PA纤维是废水排放物的特征，而Arriluze中的PE纤维更可能是来自海洋或港口的废弃物。尽管AP分析的样本量有限，但对每个回收颗粒的彻底化学表征（100% FTIR验证）为聚合物类型的鉴定提供了信心，有效地代表了采样地点的环境特征。Plentzia和Arriluze沉积物中的总多环芳烃（∑PAHs）浓度相当（约2500 ng/g dw），与之前对Plentzia的报告一致（Briaudeau等人，2020），而在Arriluze则呈下降趋势（Briaudeau等人，2019）。虽然总体∑PAH水平根据沉积物质量指南（SQGs）将两个地点分类为未受影响，但个别PAH浓度仍可能对底栖生物构成生物风险。特别是，SQG-Q值表明有中等影响，突显了这些化合物的毒性和持久性。COVID-19封锁期间海上交通的减少可能进一步促进了这种下降，加强了航运作为该地区PAH污染主要来源的作用。相比之下，Arriluze沉积物中的总多氯联苯（∑PCBs）浓度显著高于Plentzia沉积物。SQG-Q值表明Arriluze沉积物受到中等程度的影响。这与历史上毕尔巴鄂河口工业活动的遗留影响相符（Cuevas等人，2015；Briaudeau等人，2020）。高浓度的As、Cd、Cr、Ni和Pb与采矿和重工业的历史输入一致（Cajaraville等人，2016），尽管最近的趋势表明有所恢复（Cajaraville等人，2016；Briaudeau等人，2019）。尽管Arriluze沉积物中的金属浓度受到中等至强烈影响，如Cu和Zn，但Plentzia的沉积物中的金属浓度仍低于毒性阈值（Cortada和Collins，2013；Briaudeau等人，2020）。尽管Arriluze的SQG-Q值表明某些金属受到中等至强烈影响，但它们在贻贝中的生物积累有限。然而，如果这些金属变得可生物利用并进入食物链，持续的沉积物库可能会带来潜在的未来风险。有趣的是，尽管之前有关于贻贝污染的报告（Orbea和Cajaraville，2006；Bartolomé等人，2010；Bustamante等人，2010；Blanco-Rayón等人，2020），但在两个地点的贻贝中PAHs和PCBs都低于检测限。这支持了比斯开湾遗留污染物下降的趋势（Bartolomé等人，2010；Briaudeau等人，2019；Blanco-Rayón等人，2020）。这种低生物积累可能反映了与活跃产卵相关的脂质储备的耗尽，因为亲脂性污染物如PAHs和PCBs会随着配子一起排出（Ruiz等人，2011；Xiu等人，2015）。此外，春季温度升高导致的代谢率和体生长增加可能有助于稀释效应，使浓度保持在检测限以下（Franco等人，2002；Devier等人，2005；Blanco-Rayón等人，2020）。贻贝中的金属水平也低于之前的报告，本研究首次记录了这些地点的Al和Se含量。在之前对Arriluze的研究中，Bartolomé等人（2010）观察到大多数金属具有季节性模式，夏季浓度最高，冬季最低。相比之下，Blanco-Rayón等人（2020）在同一地点报告了夏季所有金属的组织浓度最低，而在Plentzia的贻贝中没有观察到明显的季节性变化。重要的是，Arriluze贻贝中的总体金属浓度在所有季节都始终高于Plentzia（Blanco-Rayón等人，2020）。与此一致，我们的结果显示Arriluze中的Al、Se和Zn含量较高，尽管只有Cd和Pb的积累在该地点显著较高。然而，这些值仍低于历史数据（Bartolomé等人，2010；de los Ríos等人，2016；Blanco-Rayón等人，2020），进一步支持了整体环境的改善。此外，在两个地点的贻贝组织中均未发现金属沉积物，表明金属沉积仅在高浓度时发生，正如之前在比斯开湾的现场研究中观察到的（de los Ríos等人，2013，de los Ríos等人，2016，de los Ríos等人，2018）。双壳类动物中的过氧化物酶体增殖主要与持久性有机污染物如PAHs和PCBs相关（Cajaraville等人，2006；Orbea和Cajaraville，2006）。在这项研究中，Arriluze贻贝的DG中的aox1转录显著高于Plentzia贻贝。然而，AOX1酶活性在两个地点之间没有显著差异，两个群体的平均活性相似，这与贻贝中∑PAHs和∑PCBs的缺乏显著差异一致，两者都低于检测限。转录水平与酶活性之间的差异可能反映了补偿性细胞机制，如mRNA降解或翻译后修饰（例如酶调节），这些机制可以限制功能性蛋白质的合成或稳定性。此外，AOX1表现出明显的季节性活性模式（Cancio等人，1999）。由于转录和酶活性在空间和时间上是分离的，6月底记录的活性水平可能反映了季节性下降，可能掩盖了早期的转录诱导。对aox1转录和AOX1活性的时间分析对于阐明这些复杂的翻译后调控过程至关重要。尽管在实验室条件下暴露于PAHs、MPs和金属的双壳类动物中观察到了cat、gst和mt20等基因的转录激活和抑制（Navarro等人，2011；Balbi等人，2016；Paul-Pont等人，2016），但这些结果可能无法准确反映环境条件的复杂性。现场研究通常显示出更高的转录变异性；例如，之前在比斯开湾的研究报告称mt20表达在不同地点之间没有显著差异（de los Ríos等人，2013）。同样，我们的结果也显示两个地点之间没有显著的转录差异。尽管注意到MPs和金属浓度的变化，但暴露水平可能低于触发显著转录变化的阈值。尽管如此，这些测量结果建立了重要的基线，因为mRNA定量仍然是评估污染物暴露和效应的重要早期预警生物标志物（Lacroix等人，2014）。关于遗传毒性，两个地点的贻贝透明细胞中的微核（MN）频率与参考水平相当（Bar?ien?等人，2012；Bolognesi和Fenech，2012）。然而，核芽的频率与受污染地点的M. galloprovincialis中的典型水平相当（Bolognesi和Fenech，2012），表明存在遗传毒性效应。此外，DNA链断裂的百分比相对于实验室基线有所升高（Lyons等人，2012）。虽然两个地点都显示出遗传毒性压力的证据，但Arriluze贻贝中更高的核芽和DNA链断裂水平表明了更大的环境风险。这些遗传毒性效应可能归因于持久性污染物，如金属（如Cd）和三丁基锡（TBT）（Hagger等人，2005；Lyons等人，2012），后者尽管在2008年全球禁令后仍存在于比斯开湾沉积物中（Zabaljauregui等人，2007；Bartolomé等人，2010；Rodríguez等人，2010）。此外，MP暴露已知会导致M. galloprovincialis的血细胞DNA损伤，并可能通过特洛伊木马效应促进其他污染物的进入（González-Soto等人，2019，González-Soto等人，2022）。在Plentzia，APs的较高丰度可能有助于观察到的遗传损伤。特定地点的复合污染物效应也可能发生了作用。在污染监测中，贻贝的DG通常是研究的目标器官，因为它在解毒和消除外源物质方面起着关键作用（Faggio等人，2018）。MRL/MET比率，表明消化管萎缩，在Plentzia的贻贝中显著更高。这一发现与组织病理学分析一致，后者显示该地点的萎缩强度显著更高。MLR/MET结果在Plentzia和Arriluze的不同季节都在观察范围内（Blanco-Rayón等人，2020）。嗜碱性细胞的体积密度（VvBAS）在Arriluze贻贝中显著更高，表明与Plentzia相比细胞压力更大。这些水平超过了M. galloprovincialis的既定参考和污染暴露基线（Bignell等人，2012），并且高于比斯开湾研究季节的典型范围（Cajaraville等人，2016；Blanco-Rayón等人，2020），尽管由于图像分析方法的差异，比较需要谨慎。值得注意的是，生理因素，如寄生虫的存在，可以影响组织水平的生物标志物（Bignell等人，2012；Ramírez等人，2026）。Plentzia地区寄生虫感染率及感染程度的显著升高（尤其是原生动物Nematopsis sp.）可能导致了肌肉萎缩的加剧以及MRL/MET和MET/MDR比率的改变，同时VvBAS值也有所上升。此外，两个地点都观察到了高发的消化管坏死现象，这可能与纤毛寄生虫有关（González-Soto等人，2023年）。总体而言，这些结果表明新兴污染物与遗留污染物以及自然压力因素（如寄生虫）之间存在复杂的相互作用。在两个地点，上皮细胞坏死和血细胞浸润的发病率均超过50%。然而，Plentzia贻贝结缔组织中棕色细胞的增多是唯一具有统计学意义的组织病理学变化。由于这些细胞参与代谢产物的积累和解毒过程（Kim等人，2006年；Bignell等人，2012年），其在Plentzia中的高发率可能表明该地区的解毒或清除机制更为活跃，这与污染物或寄生虫负荷有关。两个地点都发现了100%的纤毛寄生虫感染率，这种情况较为罕见（Villalba等人，1997年）。Nematopsis sp.在Plentzia中的高发率可能是一个生物学混杂因素，掩盖了不同地点之间的组织病理学差异。尽管这两种寄生虫通常被认为是贻贝的共生体（Kim等人，2006年；Izagirre等人，2014年），但有些研究者将纤毛寄生虫和Nematopsis sp.的存在分别归类为中等和严重的病理现象（Villalba等人，1997年；Cuevas等人，2015年）。在繁殖方面，两个种群主要处于产卵阶段，其生殖腺指数（GI）没有显著差异。这些发现与之前在这些地点进行的春季研究结果一致（Ortiz-Zarragoitia等人，2011年；Blanco-Rayón等人，2020年）。然而，在Arriluze地区发现了显著的性别比例失衡（3M:1F），而在Plentzia地区性别比例则符合预期（Seed，1969年；Ortiz-Zarragoitia等人，2011年；Blanco-Rayón等人，2020年）。Arriluze地区的这种潜在雄性化现象可能是由内分泌干扰物（EDCs）引起的，例如TBT、洗涤剂表面活性剂、药物和激素，这些物质已知会干扰海洋双壳类的性别决定和配子发育（Nice，2005年；Smolarz等人，2017年；Go?dzik等人，2024年）。先前的研究表明，类固醇的摄入可能导致双壳类动物雄性化（Wang和Croll，2004年），并且废水处理厂影响区域内的Mytilus trossulus中17α-乙炔雌二醇（EE2，主要避孕药成分）等外源性雌激素水平的升高会改变其性别决定（Hallmann等人，2016年）。此外，暴露于常见抗抑郁药norfluoxetine的贻贝表现出多个与配子生成相关的基因上调或下调（Go?dzik等人，2024年）。新兴污染物在巴斯克河口地区普遍存在，其空间和季节性分布受污水处理厂排放物及港口活动的影响。水中药物浓度在冬季和秋季较高，而夏季由于水流减少和稀释作用减弱，药物浓度会升高（Mijangos等人，2018年）。Arriluze地区雄性占优势以及Plentzia地区雌性特异性基因vcl的转录水平升高可能表明这两个地点都受到了EDCs的影响。贻贝的内分泌紊乱此前已被证实与特定污染事件有关（Ortiz-Zarragoitia和Cajaraville，2010年）。在Plentzia，这种影响可能因MP的“特洛伊木马效应”和塑料添加剂而加剧（Dusacre等人，2025年）。有研究报告指出，尽管Arriluze地区的多环芳烃（PAHs）和金属污染水平更高，但其贻贝的整体健康状况指数（CI）始终高于Plentzia地区（Blanco-Rayón等人，2020年）。这表明其他因素（如营养物质的可利用性）可能在掩盖污染对生理状态的影响方面起着重要作用。这与我们的研究结果一致，即Plentzia地区的CI显著较低。这也可能与Plentzia地区较高的多环芳烃（APs）含量有关，因为这些物质会降低双壳类的过滤和清除能力，从而影响其整体健康（Xu等人，2017年；Xu等人，2020年；Oliveira等人，2018年；Jong等人，2022年）。另一种解释是Arriluze地区贻贝的CI较高可能源于毕尔巴鄂河口历史上较高的有机物含量（Cajaraville等人，2016年），这增加了食物供应，尽管存在化学污染。综合生物响应指数（IBR）显示Arriluze地区的整体压力水平更高。在Plentzia，Nematopsis sp.的感染率是影响该指数的主要因素，表明寄生虫感染对贻贝健康具有显著影响。而在Arriluze，对IBR贡献最大的生物标志物是aox1转录水平、基因毒性和消化管结构，这与较高的污染物负荷相符。这些生物标志物为了解环境压力对贻贝的亚致死效应及其对海洋生态系统的潜在影响提供了重要线索。尽管这项多生物标志物研究较为全面，但仍存在一些局限性。本研究仅是一次性评估，虽然能提供有价值的即时数据，但无法反映化学污染物和生物标志物反应的季节性变化。

**结论**
本研究为比斯开湾两个地区某些遗留污染物近期减少的证据提供了补充。未来通过多种环境介质评估污染物浓度将有助于判断COVID-19封锁措施是否影响了污染物水平。该研究还揭示了Plentzia贻贝的环境健康状况，发现其寄生虫感染率较高且CI较低。结果表明该地区受到新兴污染物（包括多环芳烃）和生物压力因素的影响，在将其作为参考地点时需谨慎考虑。多生物标志物评估进一步表明，研究中的Mytilus galloprovincialis可能暴露于EDCs，这从Arriluze地区的性别比例失衡和Plentzia地区vcl基因转录水平升高可以得到证实。未来的研究应涵盖更多新兴污染物，以更全面地了解比斯开湾的环境健康状况。此外，本研究关于多环芳烃生物积累和基因转录水平的基线数据为后续研究提供了重要基础。总之，对人为颗粒物、遗留污染物及多层次生物反应的综合评估为环境健康诊断提供了有力框架。这种方法能够提供高灵敏度的“早期预警”信号，特别适用于评估化学污染和海洋垃圾对沿海生态系统的综合影响。

**作者贡献声明**
Sonia M. Landro：撰写初稿、数据可视化、方法验证、调查设计、数据分析、概念构建。
Ransford Parry：方法验证、调查设计、数据分析。
Isabella Gutiérrez-Zabala：方法验证、调查设计、数据分析。
Nagore González-Soto：撰写修订稿、方法验证、调查设计、数据分析。
Sophie Lecomte：方法验证、调查设计、数据分析。
Eider Bilbao：撰写修订稿、方法验证、调查设计、数据分析。
Florencia Arrighetti：撰写修订稿、方法验证、项目监督、资金申请、数据分析、概念构建。
Miren P. Cajaraville：撰写修订稿、方法验证、项目监督、资金申请、数据分析、数据管理、概念构建。

**资助**
本研究是S.M. Landro博士论文的一部分，得到了阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）的博士奖学金支持。研究资金来自巴斯克政府（项目MIKRONANOPLAS PA22/01，资助给IT1743-22研究小组及N González-Soto的博士后项目）、西班牙政府（项目FIERA PID2021-128600OB-I00，MCIN/AEI/10.13039/501100011033及“ERDF A way of making Europe”计划）、跨境合作实验室LTC AquEus（Euskampus Fundazioa和巴斯克政府）以及阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET，项目PIP 2020-227）。