2,4-DCP对成年斑马鱼的神经毒性作用：行为学、生物化学和遗传学研究方法

《Chemico-Biological Interactions》：Neurotoxic effects of 2,4-DCP in adult zebrafish: A behavioral, biochemical, and genetic approach.

成年斑马鱼在长期接触2,4-DCP后表现出神经行为异常和氧化应激反应，其运动能力降低、焦虑样行为增强，并伴随多巴胺能相关基因表达下调及炎症因子变化，提示该代谢物可能通过神经内分泌和氧化还原通路引发毒性效应。

　　

安娜·路易莎·皮雷斯·莫雷拉（Ana Luisa Pires Moreira）|拉斐尔·泽维尔·马丁斯（Rafael Xavier Martins）|罗梅里奥·德·奥利维拉·利马·菲略（Romério de Oliveira Lima Filho）|西尔维娅·雷吉娜·巴蒂斯图佐·德·梅德罗斯（Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros）|达维·费利佩·法里亚斯（Davi Felipe Farias）|安娜·卡罗莱纳·卢基亚里（Ana Carolina Luchiari）|西塞罗·弗朗西斯科·贝泽拉·费利佩（Cícero Francisco Bezerra Felipe）

巴西帕拉伊巴州联邦教育、科学和技术学院（Federal Institute of Education, Science and Technology of Paraíba），皮库伊校区（Picuí Campus）

摘要

2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）是一种持久性和毒性强的代谢物，来源于除草剂2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）及其他氯化化合物的降解过程，已成为一个新兴的环境问题。尽管已有证据表明其具有毒性，但其对成年生物体的神经毒性作用仍知之甚少。本研究旨在评估斑马鱼（Danio rerio）在暴露于环境相关浓度（30 μg L^-1）和高浓度（300 μg L^-1）的2,4-DCP 14天后的行为、生化和分子反应。行为分析显示，暴露于2,4-DCP的斑马鱼活动能力下降，焦虑反应增强，在高浓度下社交偏好受损。生化检测结果显示乳酸脱氢酶（LDH）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性升高，表明与氧化还原平衡和细胞损伤相关的通路受到干扰。分子分析显示多巴胺能（drd1, th1）和神经可塑性（bdnf）基因表达下调，同时促炎细胞因子（tnfa, il-6）表达减少。综合这些结果表明，2,4-DCP可能通过多巴胺能功能障碍、氧化还原相关通路的改变以及神经免疫相关信号传导的异常引发神经行为变化。这些发现强调了2,4-DCP作为神经毒性污染物的生态和毒理学重要性，以及进一步研究其在水生物种中的长期和多代影响的重要性。

引言

近几十年来，全球人口的快速增长导致了对农业生产力的需求增加，进而导致了农药和化肥等农用化学品使用量的无控制增长（Xiang et al., 2020）。其中，广泛用于控制危害作物的害虫和杂草的农药和除草剂已成为重大的环境和公共卫生问题。这些化合物通常具有高毒性，因其化学稳定性和亲脂性特性，从而增强了其在生态系统中的持久性和生物累积性（Zaluski et al., 2022; Schmidel et al., 2014）。

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是最常用的除草剂之一，用于选择性控制阔叶杂草（Gaaied et al., 2022; Olejnik et al., 2019）。据报道，它作为主要活性成分存在于超过1,500种市售制剂中（Aylward and Hays, 2008）。2,4-D在化学或生物作用下可降解，产生可能比母体化合物更具毒性的代谢物。其中，2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）尤其令人担忧：它是水生环境中最普遍且危害最大的氯酚类物质之一，因其高毒性和环境持久性被列为优先污染物（Martins et al., 2021; Xia et al., 2016）。除了是2,4-D的副产品外，2,4-DCP还来源于水生三氯生（Triclosan）的降解，后者是一种广泛应用于各种卫生和保健产品中的广谱抗菌剂（Kumari and Ghosh Sachan, 2019; Tohidi and Cai, 2017）。

在中国水样中检测到2,4-DCP的浓度高达20 μg/L（Gao et al., 2008）。此外，在法国、南非的河水中以及澳大利亚的废水中也发现了该物质，浓度范围为4.89至10 μg/L（Pan et al., 2021; Farounbi and Ngqwala, 2020）。

关于2,4-DCP的毒性，多项研究表明其对多种细胞类型、器官和动物模型具有不良影响。Fu等人（2016）使用人类肝细胞体外培养和小鼠体内模型研究了其肝毒性作用，结果显示细胞存活率下降、菌落形成受阻，同时该化合物会增加小鼠的肝脏重量、血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平，并引发内质网应激。此外，2,4-DCP还具有内分泌干扰作用：在斑马鱼中表现为雌激素样作用，导致17β-雌二醇和卵黄蛋白水平升高，同时降低雄激素水平，从而导致鱼类雌性化（Hu et al., 2021）。斑马鱼在性别分化关键期暴露于2,4-DCP后，性别比例偏向雌性，这与与雄性相关的基因（包括sox9a、amh和dmrt）表达下调有关（Zhang et al., 2020）。

虽然此前已有研究报道2,4-D对斑马鱼的神经毒性作用，如运动行为和乙酰胆碱酯酶活性的改变（Gaaied et al., 2019），但对于其代谢物2,4-DCP的神经毒性潜力知之甚少，尤其是在神经系统已完全成熟的成年动物中。因此，本研究旨在评估长期暴露于2,4-DCP对斑马鱼行为的影响，以及与神经毒性、氧化应激和神经炎症相关的生化和遗传反应。

实验方法

伦理声明

本研究的所有鱼类饲养和实验程序均遵循巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）的建议，研究及动物护理方案得到了北里奥格兰德联邦大学（Federal University of Rio Grande do Norte）动物使用伦理委员会（CEUA）的批准（证书编号418.053/2024）。在整个实验过程中，每天对动物的健康状况和福利进行评估。

动物饲养

野生型成年斑马鱼（约6个月大，性别比例未知）

新型实验池

在运动参数方面，单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）显示实验组与对照组之间的平均速度（F_(2,44) = 9.63；p = 0.0003）和总行进距离（F_(2,44) = 9.80；p = 0.0003）存在统计学差异。Dunnett事后检验（post hoc）表明，暴露于低浓度和高浓度2,4-DCP的斑马鱼的平均速度显著降低（p = 0.0012和p = 0.0007）。同样，总行进距离也存在显著差异

讨论

由于人口快速增长，农药的使用量大幅增加。集约化农业生产及工业生产过程中的额外排放导致农用化学品残留物和代谢物的释放量增加，这些物质已在食物、地表水和土壤中被检测到（Tudi et al., 2021）。

研究表明，农药代谢物的毒性和持久性可能超过其母体化合物，并可能在某些情况下产生协同效应

未引用参考文献

Sisagua, 2018;

CRediT作者贡献声明

安娜·路易莎·皮雷斯·莫雷拉（Ana Luisa Pires Moreira）：撰写初稿、项目管理、方法设计、数据分析、概念构建。西塞罗·弗朗西斯科·贝泽拉·费利佩（Cícero Francisco Bezerra Felipe）：撰写、审稿与编辑、监督、概念构建。安娜·卡罗莱纳·卢基亚里（Ana Carolina Luchiari）：撰写、审稿与编辑、资源协调、方法设计、数据分析。拉斐尔·泽维尔·马丁斯（Rafael Xavier Martins）：撰写、审稿与编辑、方法设计、数据分析。罗梅里奥·德·奥利维拉·利马·菲略（Romério de Oliveira Lima Filho）：撰写、审稿与编辑、方法设计、数据分析。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了帕拉伊巴州研究基金会（FAPESQ）- 2023/2181项目的资助，ALPM获得了该项目的资助。ACL得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）308245/2023-7项目的支持。资助机构未参与研究策略、数据收集、讨论或手稿撰写过程。作者感谢维托尔·德·马塞多·桑帕约（Vitor de Macêdo Sampaio）在本研究中的技术协助。