FOXP1基因缺陷会加剧由PM2.5引起的肾损伤中的细胞衰老现象

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：FOXP1 deficiency exacerbates cellular senescence in PM 2.5-induced renal injury

　　陈恒兵|詹子顺|卢梦秋|李丹|彭娟|陈莉|易斌|黄志军
中南大学第三湘雅医院肾脏科，中国湖南长沙410013

**摘要**
暴露于细颗粒物（PM2.5）是对环境健康的一个重大威胁，越来越多的证据表明它与慢性肾病（CKD）的加速进展有关。然而，这种毒性的潜在机制仍不甚明了。本研究调查了PM2.5暴露是否会导致肾小管细胞衰老，并探讨了这一过程的分子基础。我们发现，PM2.5暴露会导致小鼠肾脏损伤，并上调小鼠和人类肾近端小管上皮细胞（HK-2）中的衰老标志物。从机制上讲，PM2.5降低了FOXP1的表达，从而解除了其对CDKN1A（编码P21）的转录抑制，导致P21上调和随后的细胞周期停滞。过表达FOXP1或用槲皮素处理可以减轻PM2.5诱导的HK-2细胞衰老。我们的研究结果表明，FOXP1表达减少会驱动PM2.5诱导的肾脏损伤中的细胞衰老，并确定槲皮素是一种潜在的治疗剂，能够激活FOXP1并减轻PM2.5的肾毒性。

**1. 引言**
根据全球疾病负担研究（Clark等人，2024年），细颗粒物（PM2.5）污染已成为一个主要的全球健康问题，估计导致470万人死亡，并占全球伤残调整生命年的4.2%。除了其已知的心血管和呼吸系统影响外，越来越多的证据表明PM2.5是慢性肾病（CKD）的重要风险因素（Li等人，2021a；Copur等人，2022年）。实验研究进一步证明，长期暴露于PM2.5会导致小鼠肾脏的结构和功能损伤（Chen等人，2023a；Zhang，2024年；Cui等人，2024年）。我们的先前工作使用透射电子显微镜直接观察到了受损的近端小管上皮细胞内的PM2.5颗粒沉积（Lu等人，2025年）。尽管这些关联已经确立，但PM2.5导致肾脏损伤的具体分子机制仍不清楚，这是CKD研究中的一个关键空白。

新兴证据表明，细胞衰老在PM2.5诱导的组织损伤中起着关键作用。细胞衰老定义为细胞周期的不可逆停滞，由DNA损伤、氧化应激、端粒缩短或损伤以及致癌信号传导引起，同时伴随着结构和功能的改变，以及与炎症、纤维化或组织重塑相关的因子分泌和表达的增加，这通常被称为衰老相关分泌表型（SASP）（Gorgoulis等人，2019年；Kumari和Jat，2021年；Pieters等人，2016年）。同样，Wang等人的研究表明，PM2.5暴露通过激活cGAS/STING/NF-kB通路诱导肺上皮细胞衰老（Wang等人，2022a）。在肾脏中，小管上皮细胞——肾皮质的主要细胞成分——极易受到损伤，并且容易因氧化应激、有毒物质刺激、周期依赖性激酶抑制剂（如CDKN1A，编码p21）的上调以及端粒磨损而发生衰老（Zhang等人，2023a；Li和Lerman，2020年）。P21是一种参与细胞周期进展的关键基因，由CDKN1A编码，与肾小管细胞的衰老密切相关（Al-Dabet等人，2022年）。此外，由SASP驱动的慢性低度炎症会促进CKD的进展，并最终损害小管功能（O’Sullivan等人，2017年；Schmitt和Melk，2017年）。然而，PM2.5暴露是否会导致肾脏中的细胞衰老尚不清楚。

Forkhead box P1（FOXP1）属于Forkhead Box（FOX）P亚家族，该家族包含四个成员（FOXP1–4），通过其C末端Forkhead结构域调节与增殖、分化和衰老相关的基因，以及细胞周期进展、存活和代谢（Forkhead box proteins，2024年）。FOXP1在大多数人体组织中广泛分布，包括肾脏（Lozano等人，2021年）。它调节线粒体功能，减轻氧化应激，并抑制炎症；FOXP1缺乏会降低线粒体膜电位并抑制抗氧化酶的产生（Wang等人，2022b）。有趣的是，单细胞转录组学研究表明，FOXP1在衰老的心肌细胞中表达下调，FOXP1缺乏会导致这些细胞出现肥大和衰老表型（Zhang等人，2023b）。相比之下，FOXP1对肾脏的影响研究相对较少。FOXP1在远端肾小管中的缺失会导致集合管中的间充质细胞分化受损，从而导致远端小管的酸碱平衡失调（Wu等人，2024a）。在糖尿病肾病中，高葡萄糖暴露下的肾小球系膜细胞中FOXP1过表达可以减少活性氧（ROS）的产生（Xiang等人，2019年）。然而，FOXP1在肾脏中的多方面作用和调控机制尚未得到充分研究。

值得注意的是，先前的研究报告称，槲皮素处理可以抑制人类颗粒层细胞中由FOXP1基因沉默引发的细胞衰老（Wu等人，2024b）。槲皮素是一种存在于许多植物中的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌作用，在对抗与年龄相关的健康问题中起着重要作用（null和Maurya，2022年）。此外，研究还表明，槲皮素对PM2.5暴露引起的人类支气管上皮细胞的氧化损伤具有保护作用（Jin等人，2016年）。然而，槲皮素是否对PM2.5引起的肾脏损伤具有保护作用及其潜在机制尚不清楚。

在这项研究中，我们发现PM2.5暴露在体外和体内通过下调FOXP1表达诱导肾小管衰老，从而导致CDKN1A上调，因为FOXP1对其转录抑制作用减弱。此外，我们发现槲皮素（Chen等人，2022年）这种具有肾保护作用的化学物质可以通过部分激活FOXP1表达来对抗肾小管细胞周期停滞。值得注意的是，其他报道的肾保护剂，如二甲双胍（Han等人，2021年）、白藜芦醇（Liu等人，2019年）、人参皂苷Rb1（Liu等人，2020年）和姜黄素（An等人，2025年）在我们的实验系统中并未类似地激活FOXP1。这些发现可能为预防与空气污染相关的健康风险提供新的见解。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物
12只8周大的C57BL/6雄性小鼠（Slyke Jingda，长沙，中国）被随机分为两组：一组暴露于过滤空气（FA），另一组暴露于PM2.5，每组6只小鼠。PM2.5组的小鼠每天暴露于浓缩的PM2.5环境中6小时，每周5天，持续12周，平均每日浓度为214.30 μg/m3，主要来源于交通排放（Chen等人，2020年）。相比之下，FA组的小鼠吸入的过滤空气中PM2.5含量极低，平均每日为8.15 μg/m3。在整个实验过程中，小鼠被置于温度为24±2°C、相对湿度为60±5%、12小时光照/12小时黑暗的环境中。暴露方案包括每天将小鼠放入PM2.5或FA环境中6小时，每周5天。每次暴露后，小鼠在剩余的18小时内返回到普通空气中。通过TEOM 1405监测器（Thermo，美国）连续监测暴露室和动物设施中的PM2.5浓度。使用特氟龙过滤器收集PM2.5样本以供进一步分析。所有程序均遵循复旦大学动物护理和使用委员会的伦理指南，在研究期间为所有动物提供人道护理（Du等人，2018年；Zheng等人，2015年）。在实验过程中，同时收集暴露室和过滤空气对照室的PM2.5样本。分析了关键成分的浓度，包括多环芳烃（PAHs）、金属和内毒素。结果证实，本研究中的PM2.5组成与同一暴露地点的先前报告一致（Guo等人，2024年）。

2.2. 细胞培养和处理
HK-2细胞来源于人类肾近端小管上皮组织，由中南大学肾脏病研究所提供。这些细胞在含有10%胎牛血清和0.5%青霉素-链霉素的Minimum Essential Medium（MEM）中培养，并用不同浓度的PM25（NIST2786，https://shop.nist.gov/ccrz__ProductDetails?sku=2786&cclcl=en_US，Merck，德国达姆施塔特）或化学物质（如二甲双胍（KM13667，KKL Med Inc.，美国）、白藜芦醇（KM13291，KKL Med Inc.，美国）、人参皂苷Rb1（KM13678，KKL Med Inc.，美国）和姜黄素（HY-18085，MedChemExpress，新泽西，美国）处理48小时。

2.3. 肾脏组织学检查
肾脏用4%甲醛固定，石蜡包埋，然后半切。切成4 μm厚的切片后，脱蜡、复水，并用标准程序用苏木精和伊红（H&E）及Masson三色染色。根据之前的方法评估小管损伤评分（Yang等人，2018年），并用光学显微镜（BA410T，MOTIC，中国九龙）拍摄图像。

2.4. 血清生化分析
使用自动生化分析仪（Beckman Coulter，美国加州）分析血清尿素氮（BUN）和血清肌酐（sCr）浓度。

2.5. 免疫组化
脱蜡和复水的肾脏组织切片进行抗原修复，并在4°C下与Klotho抗体（1:200，28100–1-AP，Proteintech，芝加哥，美国）孵育过夜。PBS洗涤后，切片在室温下与二级抗体（AWI0629，Abiowell，长沙，中国）孵育1小时，然后加入DAB溶液（AWB0175，Abiowell，长沙，中国）和苏木精以显色，棕色染色被视为阳性表达。使用光学显微镜拍摄图像，并使用ImageJ软件量化阳性区域的光密度。

2.6. 西部印迹分析
使用RIPA缓冲液裂解肾脏组织或细胞，然后通过匀浆、超声破碎和离心收集上清液。蛋白质样品进行热诱导变性，然后在SDS-PAGE凝胶上运行，转移到PVDF膜（Millipore，IPVH00010）上，然后用5% BSA封闭，并在4°C下与FOXP1（1:1000，ab314488，Abcam，英国）、P21（1:1000，AWA63269，Abiowell，中国）、Klotho（1:1000，28100–1-AP，Proteintech，美国）、P16（1:500，R23895，ZenBio，中国）、4-HNE（1:1000，ab48506，Abcam，英国）和γH2AX（1:2000，BM4841，Boster，中国）的一级抗体孵育过夜。随后加入二级抗体，在室温下反应一小时，然后用Amersham ImageQuant 800（Cytiva，马尔堡，美国）进行增强化学发光检测，最后使用ImageJ软件量化。

2.7. 定量实时聚合酶链反应（qPCR）
使用RNA提取试剂盒（AG21024和AG21023，Accurate Biology，长沙，中国）从细胞和组织中分离总RNA。使用逆转录试剂盒从RNA合成cDNA。随后在Roche LightCycler 480平台上使用PCR试剂盒（AG11701，Accurate Biology，长沙，中国）进行qPCR。使用2-ΔΔCT方法量化表达水平，以ACTB作为内参。测量FOXP1、CDKN1A和SASP（IL6、IL1B、IL1A、CTGF）mRNA的水平，引物序列见表1。

**表1. 本研究中使用的特异性引物序列**
| 基因 | 正向引物（5’?3’） | 反向引物（5’?3’） | 产物大小（bp） |
|-------------|-----------------|-----------------|---------------|
| m-Foxp1 | TCTCGTCCTCGGCACCTTGTCACAAACCGCCTCACA | 179 |
| m-Cdkn1a | GTGAGGAGGAGCATGAATGGAGAACAGGTCGGACATCACCA | 118 |
| m-Il1a | CGCTTGAGTCGGCAAAGAAATCTTCCCGTTGCTTGACGTTG | 271 |
| m-Il6 | TACCACTTCACAAGTCGGAGGCCTGCAAGTGCATCATCGTTGT | 116 |
| m-Il1b | TGGGCCTCAAAGGAAAGAATCAGGCTTGTGCTCTGCTT | 216 |
| m-Ctgf | TTGACAGGCTTGGCGATTGTTACCAATGACAATACCTTCTGC | 140 |
| m-Havcr1(KIM1) | ACATATCGTGGAATCACAACGACACTGCTCTTCTGATAGGTGACA | 114 |
| m-Lcn2(NGAL) | GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | 95 |
| m-Actb | CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGTGCTGGAAGGTGGACAGTGAG | 138 |
| h-FOXP1 | GGGGCAGTATGGACAGTGGATGATTGAGAGGTGTGCAGTAGGCG | 119 |
| h-IL1 | ACATCCTCCACAATAGCAGACAGGAGTTTCCTGGCTATGGGATA | 105 |
| h-IL6 | GCCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGACTCACCTCTTCAGAACGAATT | 150 |
| h-IL1B | TACAGCTGGAGAGTGTAGATCCGGAACTGGGCAGACTCAA | 114 |
| h-CTGFC | GCACAAGGGCCTATTCTGTGAGCACCATCTTTGGCGGT | 78 |
| h-ACTB | CATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACG | 250 |
| CHIP1 | h-CDKN1A | ACTATATGCTCAGCCATTGTCCCCCTCAGCATCAGTGTTACCAA | 169 |
| CHIP2 | h-CDKN1A | ATCATACTGGCTGATGCGCTCTATCCTCCAGACACGGTCCC | 190 |

2.8. 免疫荧光（IF）
将4 μm厚的石蜡包埋肾脏切片在4°C下与γH2AX（1:100，BM4841，Boster，武汉，中国）和Ki67（1:200，PT0330R，ImmunoWay Biotechnology Company，美国）的一级抗体孵育过夜。HK-2细胞用4%甲醛固定，并在4°C下与γH2AX或Ki67一级抗体孵育过夜。PBS洗涤后，用荧光二级抗体（1:500，ab150077，Abcam，英国）孵育1小时，然后用Stellaris 5荧光显微镜（Leica，韦茨拉尔，德国）拍摄图像。

2.9. SA-β-Gal染色
按照制造商的指南使用商业试剂盒（G1580，Solarbio，北京，中国）进行SA-β-Gal染色。冷冻的肾脏切片或细胞载玻片在室温下用β-Gal固定剂固定15分钟，然后用PBS冲洗，并在37°C下在新鲜制备的SA-β-Gal染色溶液中孵育过夜。使用Zeiss光学显微镜获取显微图像。

2.10. 细胞周期分析
使用细胞周期测定试剂盒（KGA9101–20，KeyGEN BioTECH，南京，中国）。细胞用PBS冲洗，浓缩至1×10?/mL，然后在4°C下用75%冷乙醇固定过夜，接着在室温下用propidium iodide（PI）/RNase A溶液孵育30分钟，然后在流式细胞仪（BD Biosciences，新泽西，美国）上进行分析。使用Modfit v3.1软件分析细胞周期相位分布。

2.11. 细胞活力
根据制造商的说明，使用Cell Couting Kit（CCK-8）（AWC0114，Abiowell，长沙，中国）测定细胞活力。

2.12. 染色质免疫沉淀-qPCR
在HK-2细胞上进行染色质免疫沉淀（ChIP）。在用1%甲醛交联染色质后，使用微球菌核酸酶进行消化，并用FOXP1抗体（1:30，ab314488，Abcam，英国剑桥）、正常兔IgG和蛋白质G磁珠沉淀。交联作用逆转后，使用DNA纯化柱纯化DNA。通过表1.2.13中详细列出的引物，通过qPCR确定特定DNA序列的富集情况。生物信息学分析来自GEO数据库（GSE208331）的RNA-seq数据（Liu等人，2023年）。差异表达基因（DEGs）的识别标准为p<0.05且倍数变化>1.5。使用GO术语和KEGG通路数据库进行功能基因注释（Ashburner等人，2000年；Aleksander等人，2023年；Kanehisa等人，2022年）。随后使用CellAge（de Magalh?es等人，2023年）进行交集分析，并使用R studio生成感兴趣基因的热图。使用交集的感兴趣基因构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（Szklarczyk等人，2022年），并使用Cytoscape v3.6.0分析功能模块。HTFtarget（https://guolab.wchscu.cn/hTFtarget/#!/）、KnockTFv2（https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php）和ChIP_Atlas（https://chip-atlas.org/）预测CDKN1A的转录因子（Zhang等人，2020年；Zou等人，2024年）。2.14. 分子对接从AlphaFold3获取CDKN1A基因的分子结构。FOXP1蛋白结构来源于AlphaFold3（AF-Q9H334-F1-v4）（Roy和Al-Hashimi，2024年），并使用HDOCK（Yan等人，2020年）进行分子对接，最终结果由PLIP（Adasme等人，2021年）和PyMOL分子图形系统呈现。2.15. 统计分析使用GraphPad Prism 9.5进行统计分析。正态分布的数据在未配对t检验或Tukey检验的双因素方差分析之前进行统计处理。结果以平均值±标准误差（SEM）表示，p<0.05视为显著。3. 结果3.1. PM2.5暴露诱导肾小管上皮细胞衰老为了研究PM2.5暴露是否会导致肾脏损伤，将小鼠分为FA组或PM2.5暴露组（图1A）。PM2.5处理的小鼠表现出显著升高的BUN和sCr水平（图1B）。qPCR分析显示，PM2.5暴露后肾脏组织中KIM1（由Havcr1编码）和NGAL（由Lcn2编码）的mRNA水平显著增加，表明肾小管可能是PM2.5诱导的肾脏损伤的主要靶标（图1C）。H&E染色的组织学检查证实PM2.5组的小管损伤明显且损伤评分更高（图1D）。此外，Masson三色染色显示PM2.5暴露的肾脏中间质纤维化增加（图1D）。下载：下载高分辨率图像（899KB）下载：下载全尺寸图像图1. PM2.5暴露导致肾脏损伤。（A）小鼠实验设计。（B）小鼠的BUN和sCr（n=6）。（C）Havcr1（编码KIM1）和Lcn2（编码NGAL）的相对mRNA表达（n=6）。（D）带有20 μm刻度的肾脏组织的H&E和Masson三色染色代表性图像，以及Masson三色染色阳性区域的定量数据（n=6）。（E）GSE208331中DEGs的GO术语分析。（F）GSE208331中DEGs的KEGG通路分析。GO，基因本体；KEGG，京都基因与基因组百科全书；DEGs，差异表达基因；sCr，血清肌酐；BUN，血尿素氮；H&E，苏木精和伊红。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与FA组相比。为了探索PM2.5暴露在肾小管上皮细胞中引起的生物学和通路变化，我们对PM2.5暴露的HK?2细胞的转录组测序数据进行了生物信息学分析。从GEO数据集GSE208331中，对照组和PM2.5暴露组之间的DEGs接受了GO和KEGG通路分析。GO分析显示，DEGs的生物学过程主要涉及细胞周期过程，如细胞分裂、DNA损伤反应、细胞迁移和细胞周期调控（图1E）。进一步的KEGG通路分析显示，DEGs在细胞衰老和细胞周期通路中也富集（图1F）。这些发现表明，PM2.5暴露可能严重影响肾小管细胞的细胞周期功能。为了确定PM2.5暴露是否加速肾脏衰老，我们评估了经典衰老标志物和Klotho（一种肾脏富集的抗衰老蛋白）的表达。Western blot分析显示，PM2.5暴露增加了肾脏组织中衰老标志物P16和P21的表达，同时降低了Klotho的表达（图2A）。一致地，免疫组化结果证实PM2.5暴露组中Klotho的表达显著降低。此外，SA-β-Gal活性（衰老的标志物）在PM2.5暴露的肾脏中显著增强（图2D&E）。γH2AX是DNA损伤的标志物，在衰老细胞中通常因DNA易受损伤而增加。免疫荧光和Western blot发现PM2.5暴露组的细胞核中γH2AX表达增加（图2A-C）。此外，与炎症和纤维化相关的SASP因子（包括IL6、IL1A、IL1B和CTGF）的mRNA水平在PM2.5暴露的肾脏组织中显著升高（图2F）。流式细胞术分析显示，与对照组相比，PM2.5暴露的HK?2细胞中G1期停滞增加（图2G）。SA-β-Gal染色显示，随着PM2.5浓度的增加，活性增强，尤其是在低至中等剂量时尤为明显（图2H）。先前的研究也报告称，PM2.5暴露抑制HK?2细胞模型中的细胞增殖（Liu等人，2023年）。总体而言，这些结果表明PM2.5暴露促进肾小管上皮细胞的细胞周期停滞和衰老。基于这些发现，所有后续的体外实验均使用100 μg/mL的PM2.5浓度进行。下载：下载高分辨率图像（1019KB）下载：下载全尺寸图像图2. PM2.5暴露导致肾脏衰老。（A）通过Western blot检测肾脏组织中P16、P21、Klotho和γH2AX的蛋白水平及其定量（n=6）。（B-E）肾脏切片的SA-β-Gal染色、Klotho免疫组化染色、γH2AX的免疫荧光检测及其定量分析（n=6）。刻度尺，20 μm。（F）Il6、Il1a、Il1b和Ctgf的相对mRNA表达（n=6）。（G）通过流式细胞术评估HK?2细胞的细胞周期及其定量（n=3）。（H）PM2.5处理48小时后非衰老和衰老HK?2细胞的SA-β-Gal染色及其定量。蓝色颗粒染色表示衰老的HK?2细胞。黑色颗粒表示PM2.5（n=3）。刻度尺，50 μm。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与FA组或对照组相比。3.2. PM2.5暴露诱导的衰老HK?2细胞中CDKN1A上调我们进一步将5387个DEGs与人类细胞衰老基因数据库CellAge进行交集，识别出213个枢纽基因（图3A）。然后为这些枢纽基因生成标准化热图，区分CellAge定义为促进衰老和抑制衰老的基因。在PM2.5暴露的HK?2细胞中，48个促进衰老的基因上调，而66个抑制衰老的基因下调（图3B和C）。为了探索这些异常表达基因之间的潜在相互作用并识别与细胞衰老密切相关的分子，我们构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行了功能模块分析（图3D，3E）。PPI分析确定了五个模块：细胞衰老、细胞周期、癌症通路、癌症中的microRNAs和癌症中的转录失调（图3E）。在细胞衰老模块中，识别出12个基因，并进一步与KEGK细胞衰老通路相关联以确定关键基因。在KEGK通路中，P21的表达显著上调，以及IL1A和IL6（图3F）。此外，DEGs火山图中的12个基因显示IL6、IL1A和CDKN1A在PM2.5暴露的HK?2细胞中也显著上调（图3G）。考虑到P21由CDKN1A编码，这是一种周期依赖性激酶抑制剂，在某些检查点上抑制细胞周期，因此在细胞衰老中起关键作用。因此，这些发现表明CDKN1A可能在PM2.5暴露诱导的细胞衰老中起核心作用。下载：下载高分辨率图像（946KB）下载：下载全尺寸图像图3. PM2.5暴露诱导的衰老HK?2细胞中CDKN1A上调。（A）DEGs与Cell Age数据集的交集。（B，C）基于促进衰老的上调基因（Up_Induces）和抑制衰老的下调基因（Down_Inhibits）的热图。热图按行进行了归一化，因此产生了相对比例值。（D）Up_Induces和Down_Inhibits的PPI网络分析。（E）PPI的功能模块分析中的TOP5模块。（F）从R的pathview包中获取的KEGK细胞衰老通路图。（G）带有显著相关基因的DEGs火山图。PPI，蛋白质-蛋白质相互作用。3.3. FOXP1下调与PM2.5诱导的HK?2细胞衰老相关接下来，我们通过交叉预测转录因子的数据集hTFtarget、KnockTFv2和ChIP_Atlas来探索CDKN1A上调的原因，这些数据集识别出25个可能与CDKN1A启动子结合的潜在转录因子（图4A）。将这组数据与先前整理的衰老调节基因进行交集，突出显示FOXP1作为PM2.5诱导的CDKN1A表达的候选介质（图4B）。鉴于衰老细胞分泌促炎因子（如IL6和IL1A），这些因子会导致慢性炎症和组织功能障碍，我们检查了FOXP1与这些衰老相关基因之间的关系。基因表达的相关性分析显示，FOXP1的水平与CDKN1A、IL6和IL1A呈负相关，其中FOXP1与CDKN1A之间的负相关性最强（图4C）。我们之前的数据发现暴露组中CDKN1A基因P21的蛋白表达增加。我们进一步在mRNA水平和FOXP1蛋白表达上验证了FOXP1和CDKN1A基因的变化。FOXP1在肾脏中显著下调，但CDKN1A在暴露组中上调（图4D和E）。这些结果支持FOXP1下调与PM2.5诱导的肾小管上皮细胞衰老相关的假设。下载：下载高分辨率图像（384KB）下载：下载全尺寸图像图4. FOXP1下调与PM2.5诱导的HK?2细胞衰老相关。（A）hTFtarget、KnockTFv2和ChIP_Atlas对CDKN1A的交集。（B）25个潜在转录因子Up_Induces和Down_Inhibits的交集。（C）FOXP1与衰老相关因子IL6、IL1A和CDKN1A之间的皮尔逊相关性分析。（D）肾脏组织中FOXP1和CDKN1A的mRNA表达（n=6）。（E）FOXP1的蛋白水平及其定量（n=6）。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05和**p<0.01与FA组或对照组相比。我们进一步从JASPAR数据库分析了FOXP1的信息，并可视化了FOXP1的基序（图5A）（Rauluseviciute等人，2024年）。在CDKN1A启动子内识别出两个潜在的FOXP1结合序列（图5B），并通过ChIP-qPCR检测进行了验证（图5D）。使用HDOCK进行的分子对接分析预测FOXP1与这两个启动子序列之间存在高亲和力相互作用（置信度得分>0.9；图5C）。值得注意的是，PM2.5处理显著降低了FOXP1在CDKN1A启动子处的结合，如ChIP-qPCR检测所示（图5E）。PM2.5暴露后，只有ChIP1序列区域的FOXP1结合发生变化，而另一个序列未受影响，表明PM2.5选择性地影响FOXP1在特定启动子位点的结合，如图5F所示。FOXP1-CDKN1A启动子序列（5’-GAAAACA?3’）的对接得分为-282.38，置信度得分为0.9339，高于FOXP1-CDKN1A启动子序列（5’-GTAAAGA?3’）的对接得分-260.68和置信度得分0.9015。这些结果表明，在5’-GAAAACA?3’位点上FOXP1与CDKN1A的稳定相互作用可能性更高，共识别出16个氢键（在4.1 ?范围内），2个盐桥和1个π堆叠。还存在疏水相互作用（灰色虚线）。总体而言，这些发现提供了有力证据，表明FOXP1在PM2.5处理下直接在转录水平上调节CDKN1A的表达。下载：下载高分辨率图像（487KB）下载：下载全尺寸图像图5. FOXP1是CDKN1A的转录抑制因子。（A）JASPAR数据库中的FOXP1结合基序。（B）FOXP1与CDKNA1A之间结合启动子的预测。（C）CDKN1A启动子区域内FOXP1结合位点的示意图。（D）HK?2细胞中FOXP1与CDKN1A结合的ChIP-qPCR检测。（E）PM2.5暴露下HK?2细胞中FOXP1与CDKN1A结合的ChIP-qPCR检测。（F）FOXP1与CDKN1A的分子对接（ChIP1序列）。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05和**p<0.01与NC组相比。3.4. FOXP1过表达缓解了PM2.5诱导的HK?2细胞衰老我们进一步通过转染pcDNA3.1-FOXP1或对照质粒（pcDNA3.1）24小时，然后用100 μmol/L PM2.5刺激48小时，观察FOXP1过表达对PM2.5诱导的HK?2细胞衰老的影响。研究结果表明，转染FOXP1过表达载体后，FOXP1的mRNA和蛋白质水平显著增加，而P21的mRNA和蛋白质水平则显著降低。与PM2.5处理组相比，FOXP1过表达降低了CDKN1A的mRNA水平和P21的蛋白质水平（图6A和B）。这些发现表明，FOXP1过表达影响了P21的转录和蛋白质表达水平。随后，我们评估了FOXP1过表达对HK?2细胞周期分布的影响，发现它减少了PM2.5暴露引起的G1期停滞，使细胞周期分布恢复正常（图6C）。此外，Western blot分析显示，FOXP1过表达后，衰老标志物P16和γH2AX的表达减少，而Klotho蛋白的表达增加（图6D）。另外，FOXP1过表达还降低了HK?2细胞中的SA-β-Gal活性（图6F），核内γH2AX荧光灶的强度显著降低（图6G），并且与仅暴露于PM2.5的组相比，SASP水平也显著降低（图6E）。总体而言，这些结果表明，FOXP1过表达可以缓解PM2.5引起的HK?2细胞衰老。

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图6. FOXP1过表达缓解了PM2.5引起的HK?2细胞衰老。(A&B) FOXP1和P21的蛋白质水平及其定量，以及相对的FOXP1和CDKN1A mRNA表达。(C) 细胞周期分布及其定量。(D) P16、Klotho和γH2AX的蛋白质水平及其定量。(E) IL6、IL1A、IL1B和CTGF的相对mRNA表达。(F) SA-β-Gal染色及其定量分析。比例尺，50 μm。(G) γH2AX的免疫荧光（绿色）及其定量。比例尺，20 μm。数据以平均值±标准差表示。n=3/组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. OE-V组。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs. OE-V+PM2.5组。

3.5. 山柰酚激活了FOXP1表达并减轻了PM2.5引起的HK?2细胞衰老
山柰酚被认为是一种有效的抗衰老剂。我们研究了山柰酚与FOXP1之间的关系，特别是探讨山柰酚是否可以缓解PM2.5引起的HK?2细胞衰老。为了识别潜在的保护剂，我们系统地评估了几种已知具有肾保护作用的物质——二甲双胍（Met，500 μM）（Han等人，2021年）、白藜芦醇（Rsv，10 μM）（Liu等人，2019年）、人参皂苷Rb1（G-Rb1，20 μM）（Liu等人，2020年）、山柰酚（Qct，10 μM）（Giuliani等人，2025年）和姜黄素（Cur，10 μM）（An等人，2025年）在PM2.5暴露的HK?2细胞模型中的细胞保护作用。通过CCK-8检测和Ki67增殖标志物的免疫荧光成像初步筛选发现，二甲双胍、白藜芦醇和山柰酚显著减弱了PM2.5引起的细胞增殖抑制（图7A-C）。进一步使用Western blot分析评估了脂质过氧化标志物4-HNE、衰老标志物Klotho和增殖标志物PCNA的水平。结果显示，只有二甲双胍和山柰酚表现出明显的抗脂质过氧化作用，并减轻了PM2.5暴露的HK?2细胞中的增殖抑制（图7D和E）。值得注意的是，我们发现山柰酚是唯一能够上调FOXP1表达的化合物，这一发现与先前的文献报道一致（图7F和G）（FOXP1，2024年）。

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图7. 评估肾保护剂对PM2.5引起的细胞损伤的作用。(A) 通过CCK-8检测，在PM2.5暴露的HK?2细胞中加入二甲双胍（Met）、白藜芦醇（Rsv）、人参皂苷Rb1（G-Rb1）、山柰酚（Qct）和姜黄素（Cur）后的细胞活力测试。(B&C) Ki67（绿色）的免疫荧光及其定量。比例尺，30 μm。(D&E) 4-HNE、Klotho和PCNA的蛋白质水平及其定量。(F&G) 在PM2.5暴露的HK?2细胞中加入二甲双胍（Met）和山柰酚（Qct）后的FOXP1的蛋白质水平及其定量。数据以平均值±标准差表示。n=3/组。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001 vs. NC组。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs. PM2.5组。

我们根据文献报道，使用10 μM浓度的山柰酚进行了体外干预研究。为了更好地评估山柰酚对PM2.5引起的细胞损伤的保护作用，我们建立了从0到10 μM的浓度梯度。在细胞活力评估后，我们选择8 μM作为后续实验的最佳浓度（图8A）。当HK?2细胞用山柰酚处理48小时后，FOXP1和P21的蛋白质水平没有显著变化。然而，当山柰酚与PM2.5共同处理时，FOXP1的蛋白质和mRNA水平部分恢复，而P21的表达比单独暴露于PM2.5时降低（图8B和C）。细胞周期分布结果显示，当山柰酚与PM2.5共同作用时，G1期的细胞数量减少（图8D）。接下来我们使用SA-β-Gal染色检测衰老细胞，结果表明，同时用山柰酚和PM2.5处理的HK?2细胞中的衰老细胞显著减少（图8G）。Western blot检测显示，PM2.5处理增加了衰老标志物P16和γH2AX的表达，并降低了Klotho的表达，而与山柰酚共同孵育显著降低了P16和γH2AX的水平，并增加了Klotho的表达（图8E）。免疫荧光还显示，山柰酚的共同处理降低了HK?2细胞核内的γH2AX荧光强度（图8H）。此外，当山柰酚加入处理时，PM2.5暴露上调的SASP mRNA水平也显著降低（图8F）。这些发现表明，山柰酚激活了FOXP1表达，这似乎介导了P21水平的降低，从而对其在HK?2细胞中对PM2.5引起的衰老具有保护作用。

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图8. 山柰酚激活了FOXP1表达并缓解了PM2.5引起的HK?2细胞衰老。(A) 在PM2.5暴露后通过CCK-8检测加入山柰酚处理后的细胞活力测试。(B&C) 山柰酚处理后FOXP1和P21的蛋白质和mRNA水平及其定量。(D) PM2.5暴露和山柰酚处理后的细胞周期分布及其定量。(E) P16、Klotho和γH2AX的蛋白质水平及其定量。(F) SASP、IL6、IL1A和CTGF的相对mRNA表达。(G) SA-β-Gal染色及其定量分析。比例尺，50μm。(H) γH2AX的免疫荧光（绿色）及其定量。比例尺，7.5μm。数据以平均值±标准差表示。n=3/组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. 对照组。#p<0.05 和 ##p<0.01 vs. PM2.5组。

4. 讨论
本研究首次提供了PM2.5引起肾脏衰老的证据，并确定了FOXP1-P21轴是驱动肾小管上皮细胞衰老的关键调控途径。具体来说，我们证明了PM2.5下调了FOXP1的表达，导致P21激活和随后的不可逆细胞周期停滞以及与衰老相关的表型。重要的是，山柰酚对FOXP1的药理激活有效对抗了PM2.5引起的HK?2细胞衰老，确立了山柰酚作为对抗颗粒物相关肾毒性的新治疗策略。越来越多的证据表明，PM2.5在多个器官（包括肾脏）中的积累可能导致不可逆的损伤（Li等人，2019年；Peng等人，2021年）。需要注意的是，PM2.5的化学组成可能因地区和当地污染源的不同而显著变化。尽管PM2.5的主要成分如多环芳烃（PAHs）、金属和内毒素在大多数地方都存在，但它们的比例可能有所不同。这些差异可能会影响动物暴露研究中的生物学效应（Fu等人，2020年；Shim等人，2021年）。因此，未来的研究应重点收集不同地区的PM2.5样本，并在小鼠中进行比较暴露实验。这种方法将有助于阐明PM2.5组成的区域差异如何影响健康结果。在我们的研究中，暴露于PM2.5的小鼠表现出肾功能受损、肾脏形态改变以及常见的损伤生物标志物（包括炎症和纤维化）增加，表明PM2.5暴露可能导致肾脏损伤。此外，我们的发现证实，PM2.5暴露通过上调P21导致肾小管上皮细胞周期停滞。P21由CDKN1A基因编码，在G1期通过抑制周期依赖性激酶活性在调节细胞周期进展中起关键作用（Manohar等人，2023年）。在急性肾损伤中，肾小管中的P21上调可以减轻早期损伤，但也促进了“衰老”过程，相关系数为0.83（Johnson和Zager，2018年）。与我们的发现一致，Liu等人发现，暴露于PM2.5中的可提取有机物通过上调P21在心肌细胞中引起G1/S转换期的细胞周期停滞（Liu等人，2024年）。衰老细胞的特征是形态增大，它们招募非同源末端连接机制到DNA损伤位点的能力受损，使其极易受到ROS等遗传毒性应激的影响，导致γH2AX表达增加、SASP分泌和SA-β-Gal活性增加（Schmitt和Melk，2017年；Manohar等人，2023年）。因此，PM2.5组中这些衰老生物标志物的相似变化表明，肾上皮细胞的衰老是由PM2.5暴露引起的。最近的研究强调了FOXP1下调在细胞衰老中的作用（Zhang等人，2023b；Wu等人，2024b）。与这些研究一致，我们在PM2.5暴露的肾组织中观察到FOXP1水平降低，且FOXP1下调与CDKN1A、IL6和IL1A的表达呈负相关，表明FOXP1的降低可能显著促进了PM2.5暴露后HK?2细胞的衰老。我们假设FOXP1的降低主要是由于其前体mRNA或mRNA的稳态失衡。这一假设得到了研究的支持，即FOXP1前体mRNA可能受到U2小核核糖核蛋白复合物的异常剪接（Zhou等人，2020年）。此外，FOXP1 mRNA也可能通过N4-乙酰胞苷酸化酶NAT10的催化作用被修饰，从而提高其翻译效率（Chen等人，2023b）。而且，FOXP1表达还受到PI3K/Akt/p70S6K信号通路的直接调控（Halacli和Dogan，2015年），这为PM2.5暴露与我们在研究中观察到的FOXP1水平降低提供了潜在的机制联系。因此，FOXP1 mRNA的不适当修饰可能会影响其mRNA和蛋白质水平。尽管如此，涉及的精确分子机制仍需进一步研究。此外，体外FOXP1过表达减轻了PM2.5暴露引起的衰老标志物的上调。我们推测这可能是由于其转录抑制了CDKN1A，因为我们的发现表明FOXP1可以结合到CDKN1A启动子区域，这与先前的研究一致（Li等人，2021b；Naudin等人，2017年）。鉴于山柰酚作为潜在抗衰老剂的已知作用——归因于其对年龄相关代谢功能障碍的保护作用及其延长寿命的特性（null和Maurya，2022年；Islam等人，2023年；Xu等人，2018年），我们研究了其在我们的PM2.5诱导的衰老体外模型中的有效性。山柰酚处理显著减轻了衰老标志物并减少了PM2.5暴露的HK?2细胞中的SASP因子分泌。这种保护作用可能通过两种互补机制实现：激活FOXP1导致随后P21下调，以及山柰酚的羟基团提供的强大抗氧化能力。此外，我们观察到单独使用山柰酚时，HK?2细胞中G1期的比例增加。然而，当山柰酚与PM2.5共同使用时，G1期的细胞比例降低。Xiaoqin等人也发现，单独使用山柰酚可以通过诱导G1期停滞来防止细胞进入细胞周期，从而抑制肿瘤发生（Li等人，2022年）。在这个由PM2.5引起的HK?2细胞衰老模型中，山柰酚表现出不同的效果。我们推测山柰酚可能通过激活FOXP1表达部分恢复了细胞活力，从而发挥其抗衰老作用。因此，我们的发现确定了山柰酚介导的FOXP1调控机制作为对抗PM2.5引起的HK?2细胞衰老的保护策略，为解决空气污染相关的健康问题提供了新的见解。

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图9. 山柰酚缓解了PM2.5引起的肾小管细胞衰老的示意图。PM2.5暴露通过下调FOXP1表达引起肾小管衰老，导致CDKN1A的上调，这是由于FOXP1的转录抑制所致。山柰酚作为一种肾保护化学物质，通过部分激活FOXP1表达来对抗肾小管细胞周期停滞，从而发挥抗衰老作用。结论
总之，我们的研究揭示了一条关键的分子途径，通过该途径，PM2.5的暴露会加速肾脏老化，其特征是FOXP1的表达下调以及随后P21的表达增加，最终导致肾小管上皮细胞周期停滞和衰老。值得注意的是，我们的研究发现槲皮素是一种有效的PM2.5诱导衰老的缓解剂，其作用机制是通过激活FOXP1来实现的。这些发现不仅显著加深了我们对空气污染与肾脏老化之间机制联系的理解，还强调了槲皮素在预防或减轻环境污染物不良健康影响方面的治疗潜力，从而为开发旨在促进健康衰老和减少污染相关疾病负担的新干预措施提供了有希望的方向。

作者贡献声明
Dan Li：方法学研究、实验设计
Mengqiu Lu：实验设计
Li Chen：方法学研究、数据管理
Juan Peng：数据分析、数据管理
Zhijun Huang：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思
Bin Yi：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思
Zishun Zhan：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据管理、概念构思
Hengbing Chen：初稿撰写、方法学研究、数据分析、数据管理

资助
本研究得到了国家自然科学基金（82173905）、湖南省自然科学基金（2024JJ5519）以及富荣实验室科研计划（2022RC3023）的支持。