生命周期中的三苯基磷酸盐暴露会在斑马鱼中引发性别特异性的生殖毒性以及跨代毒性效应

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Life-cycle triphenyl phosphate exposure triggers gender-specific reproductive and transgenerational toxicities in zebrafish

　　梁晓平|严浩伟|钱晓琪|高翔|郝春燕|栾天刚
广东工业大学生物医学与药学科学院，广州510006，中国

**摘要**
三苯基磷酸酯（TPHP）是一种常见的有机磷酸酯阻燃剂，被认为是水生生态系统中普遍存在的环境污染物。尽管其生殖毒性已被认可，但其性别特异性和代际影响仍不甚明了。在本研究中，斑马鱼在环境相关浓度（26 μg/L）下经历了生命周期暴露，以评估F0代的生殖损伤以及对F1后代的潜在代际效应。结果表明，TPHP在生殖腺中显著积累，睾丸中的浓度约为卵巢的七倍。TPHP暴露导致性别比例偏向雌性，并降低了生殖输出，同时伴随着严重的生殖腺损伤，包括雄性精子发生受抑制和雌性卵子成熟受阻。这些不良效应与下丘脑-垂体-生殖腺-肝脏（HPGL）轴的性别依赖性紊乱有关，这通过关键激素水平的改变和HPGL轴内基因表达的失调得到证实。值得注意的是，亲代TPHP暴露在未暴露的F1后代中引发了显著的发育毒性，表现为死亡率增加、畸形率升高、心率降低以及体长减少，同时还伴有内分泌紊乱。亲本双方的基因型都对这些效应有贡献；然而，某些效应在父代暴露后更为明显。分子对接分析表明，TPHP可能通过涉及雄激素受体（AR）、雌激素受体（ER）和芳香化酶（CYP19）的复杂机制发挥其作用。本研究揭示了TPHP的性别特异性生殖和代际毒性，突显了保护水生生态系统的环境措施的紧迫性。

**1. 引言**
三苯基磷酸酯（TPHP）是一种典型的有机磷酸酯（OPE），广泛用作各种消费品中的阻燃剂和增塑剂，如玩具、纺织品、家具、油漆和电子设备[1][2]。由于它在这些产品中以物理方式存在而非化学键合，因此容易通过挥发、泄漏和制造过程进入环境。因此，TPHP已成为全球最普遍的OPE之一，在多种水生系统中频繁被检测到。例如，在意大利其地表水浓度为165 ng/L[3]，在美国为220 ng/L[4]，而在丹麦则高达7900 ng/L[5]。废水是重要的污染源，其中TPHP浓度更高，挪威为3.50 μg/L，丹麦为14.0 μg/L，中国为44.0 μg/L[6][7][8]。此外，TPHP也在饮用水中被检测到，美国浓度高达1.49 ng/L，巴基斯坦为7.86 ng/L，韩国为40.5 ng/L，中国为84.1 ng/L[9][10][11][12]。TPHP还存在于多种人体生物样本中，包括头发、胎盘、血液、尿液、母乳甚至脑脊液中[13][14][15][16]。TPHP在环境介质和人体组织中的广泛存在强调了对其生态和健康风险进行全面评估的紧迫性。

越来越多的证据表明，TPHP是一种典型的内分泌干扰化学物质（EDC），对水生物种的生殖健康有显著不良影响[17][18][19][20][21]。在雌性斑马鱼中，Liu等人观察到生育能力随剂量增加而下降，表现为产卵频率和卵子产量减少[18]。类似地，Li等人报告称，环境相关浓度的TPHP会阻碍雌性青鳉（Oryzias latipes）的卵巢发育并降低卵子产量[19]。在雄性中也观察到了类似效应：同一研究小组发现TPHP会损害雄性青鳉的睾丸发育，导致受精率和孵化率下降[20]。Chen等人进一步证实，TPHP暴露会显著降低成年雄性中国小鱼的精子活力并增加异常短尾精子的发生率[21]。总体而言，这些研究表明TPHP通过损害生育能力、引起生殖腺损伤和干扰生殖行为来影响生殖适应性。尽管TPHP的生殖毒性在水生物种中已有充分记录，但迄今为止的大多数研究仅单独考察了雄性或雌性个体。即使在同时研究两性的情况下，对性别特异性敏感性和反应机制的比较分析仍然有限。因此，系统评估TPHP的性别差异效应是必要的，以全面了解其生殖危害潜力。

环境污染物引起的生殖损伤可能不仅影响直接暴露的个体，还会对幼体后代产生负面影响，并改变水生生态系统的种群动态。先前的研究表明，亲代长期暴露于污染物可能导致代际效应，即有毒后果从暴露的亲代传递给未暴露的后代，通常具有性别特异性[22][23][24][25]。例如，Zhang等人发现斑马鱼母体传递的三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯会导致后代甲状腺内分泌紊乱和发育毒性[24]。Xu等人则表明，与父代暴露相比，母体暴露与代际抗生素毒性更为相关[25]。最近的一项研究进一步表明，产前暴露于OPE可能会增加学龄前儿童情绪和行为轨迹的异质性，这种差异基于性别和暴露的具体孕期，突显了性别特异性代际传递的潜力[26]。然而，目前尚不确定TPHP在生命周期暴露后是否会在水生生物中引起性别特异性的代际毒性。

在硬骨鱼类中，下丘脑-垂体-生殖腺-肝脏（HPGL）轴是生殖的核心调控系统[27]。该轴通过复杂的反馈机制协调关键的生殖过程，包括精子发生、卵子发生和生殖腺成熟[28]。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GNRH），刺激垂体释放促性腺激素，如卵泡刺激激素（FSH）[29]。这些激素作用于生殖腺，调节配子发生和性类固醇激素（包括17β-雌二醇（E2）和睾酮（T）的产生[30]。在雌性中，肝脏在雌激素（尤其是E2）的调控下产生卵黄蛋白（VTG），后者随后被整合到发育中的卵子中[31]。作为基本的内分泌调控网络，HPGL轴不仅支持生殖系统的正常发育和功能，也是环境EDC的主要靶标。越来越多的证据表明，如TPHP这样的EDC会扰乱激素平衡并影响鱼类的生殖生理。因此，研究TPHP对硬骨鱼类HPGL轴的毒理学影响为阐明其生殖毒性机制提供了有力方法。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品
TPHP（CAS编号115–86-6，纯度>98%）和二甲基亚砜（DMSO，CAS编号67–68-5，纯度≥99.0%）购自Sigma-Aldrich（美国）。用作TPHP内标的TPHP-d15购自Aladdin（中国）。TPHP溶解在0.01% DMSO中，随后在4°C下避光储存以备后续使用。其他HPLC级溶剂，包括甲醇、明胶、羧甲基纤维素（CMC）、乙腈和甲酸，购自Thermo Fisher Scientific或Sinopharm Chemical Reagent Co.

2.2. 斑马鱼的饲养和暴露
野生型斑马鱼（AB品系）来自广东工业大学，饲养条件为28±1°C，光照/黑暗周期为14:10小时。每天喂食两次卤虫。所有实验均遵循广东工业大学动物护理和使用委员会的规定（编号GDUTXS20250072）。

2.2.1. F0代斑马鱼
根据计算得出的72小时半数致死浓度（LC50）值10.63 μM（图S1），选择26.00 μg/L的浓度（相当于80 nM或约LC50的0.75%）进行生命周期暴露。该浓度低于急性发育毒性的阈值，用于研究慢性、亚致死性的生殖效应。这一浓度低于污染废水中报告的TPHP浓度上限，从而保持了“最坏情况”暴露的环境相关性。暴露期从受精后2小时（hpf）持续到受精后240天（dpf），如图1所示。正常发育的胚胎被随机分配到100 mm培养皿中，并在暴露溶液中维持至受精后5天（dpf）。随后，斑马鱼被转移到含有400 mL暴露溶液的500 mL水箱中，从受精后15天（dpf）开始转移到每个水箱含有2 mL暴露溶液的2.5 L水箱中。实验设计包括两组：TPHP暴露组（TP）和DMSO溶剂对照组（DM），每组包含三个重复实验，每个重复实验有30条鱼。所有水箱，包括对照组和处理组，都含有0.01%（v/v） DMSO，该浓度先前已被证实对斑马鱼的发育或生殖没有显著影响。在整个240天的暴露期间，每24小时更新最多50%的测试溶液以维持稳定的TPHP浓度。

**图1. 斑马鱼培养时间线**
暴露实验结束前24小时，斑马鱼禁食，然后使用冰镇的冷水进行安乐死，随后采集血液、生殖腺、肝脏和大脑样本。记录雄性和雌性样本的身体、生殖腺、肝脏和大脑的湿重，然后储存在-80°C下进行后续的基因表达分析（每个重复实验n=6）、TPHP定量（n=6）和生殖腺组织学检查（n=3）。从尾静脉提取血液样本以测量性激素和VTG。此外，通过生殖腺体指数（GSI）和生殖性能评估F0代斑马鱼的生殖毒性。

2.2.2. F1代斑马鱼
在受精后240天（dpf），从每组中随机选择性成熟的F0代雌性和雄性进行杂交，以评估潜在的亲本效应（见图1）。具体的交配方案如下：模式1为DM组内的内部交配，产生类型1的F1后代；模式2为TP组雄性与DM组雌性交配，产生类型2的F1；模式3为TP组雌性与DM组雄性交配，产生类型3的F1；模式4为TP组内的内部交配，产生类型4的F1。所有F1胚胎用清洁的饲养水冲洗几次，随后在100 mL的相应饲养水中维持，每天更换一次。在F1胚胎发育期间，使用 upright 显微镜（Zeiss，德国）检查死亡率（受精后24小时（24 hpf）、心率（受精后48小时（48 hpf）、畸形率（受精后72小时（72 hpf）和体长（受精后72小时（72 hpf））。在受精后96小时（96 hpf），收集幼体后代并储存在-80°C下进行后续分析，包括定量实时PCR（qPCR）和性激素定量（n=6），以评估亲本暴露对F1代内分泌功能和基因表达程序的潜在影响。

2.3. 生殖评估
在受精后210天（210 dpf）至240天（240 dpf）期间，评估成年斑马鱼的生育能力。从每组中随机选择三条每性别的个体进行每周一次的生育能力测试。在正式测试之前，将雄性与对照组雌性配对，以验证基线生殖一致性并排除雄性间的显著差异。随后，在清洁水中以1:1的雄性/雌性比例进行每周生育能力测试。连续三周记录卵子产量以进行分析。**TPHP在F0组织中的含量及暴露溶液**
从每组三个240天大的F0斑马鱼中收集了包括肝脏、大脑和生殖腺在内的组织样本。每个重复实验使用来自同一实验水箱的三条鱼的组织，从而为每个处理组提供了三个独立的生物学重复样本（n=3）。每个混合样本在冻干前后都进行了称重。在提取之前，样品中添加了氘标记的TPHP（TPHP-d15）。分析物的提取和定量按照先前发表的方法[32]进行。在每次更换水样的间隔期间（开始后1小时和结束前1小时），从暴露水箱中收集水样以测定TPHP浓度。TPHP的定量使用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）（LCMS8060，岛津公司，日本）进行。更多细节见支持信息（文本S1和表S1）。

**2.5. 生殖腺组织学检查**
从暴露组和对照组中的F0鱼中获取新鲜生殖腺组织（每种性别3个样本），将其固定在10%的甲醛溶液中约24小时，然后在分级乙醇和二甲苯中脱水，嵌入石蜡中，并使用冷冻切片机（ERMA INC.，日本）切成5微米的切片。随后，用苏木精和伊红（HE）对切片进行染色，并在Zeiss显微镜（ZEISS，德国）下观察。使用ZEN软件对不同发育阶段的精原细胞和卵母细胞进行计数。

**2.6. 性激素和VTG的测定**
使用市售的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（MEIMIAN，江苏，中国）在F0鱼的血清和F1幼鱼96天大时测定性激素（包括T、E2、FSH和GNRH）和VTG的水平。所有测定均按照制造商的协议进行。详细的实验程序见表S2。

**2.7. 基因表达分析**
根据已建立的协议[33]，通过定量PCR（qPCR）测定与HPGL轴相关的基因的转录水平，包括雌激素受体α（esrα）、促卵泡激素受体（fshr）、促卵泡激素β（fshβ）、黄体生成激素受体（lhr）、黄体生成激素β（lhβ）、细胞色素P450家族19亚家族A（cyp19a）、细胞色素P450家族19亚家族B（cyp19b）和卵黄生成蛋白1（vtg1）。简要来说，使用商业RNA提取试剂（Vazyme，南京，中国）从F1幼鱼（每个重复实验30条鱼）以及F0成年斑马鱼的肝脏、大脑和生殖腺组织（每个重复实验3个样本）中提取总RNA。使用Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，美国）通过分光光度法评估RNA的浓度和纯度。随后，使用Script III RT Master Mix（Vazyme）从提取的RNA合成cDNA。实时qPCR在Applied Biosystem?检测系统上进行，使用2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（Vazyme）和SYBR-Green方法。目标基因的特异性引物见表S3。通过2-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平，以β-actin作为内参基因。

**2.8. 同源建模和分子对接**
为了探索目标蛋白（CYP19、FSH、ER和AR）与化学物质（TPHP、E2、formestane和enzalutamide）之间的分子相互作用，进行了同源建模和分子对接。使用E2（ER激动剂）、formestane（CYP19拮抗剂）和enzalutamide（AR拮抗剂）作为阳性参考化合物。斑马鱼的蛋白质序列从NCBI蛋白质数据库中获取。目标蛋白质的三维结构通过自动化SWISS-MODEL服务器和Modeller软件使用同源建模生成，而化学结构则从PubChem数据库中获取。基于人类模板构建了四个蛋白质模型：CYP19（PDB ID 4KQ8）、ER（PDB ID 2IOG）、AR（PDB ID 1E3G）和FSH（PDB ID 8I2H）。需要注意的是，斑马鱼基因组中某些受体（如ERα和ERβ）存在多个旁系同源物；在本研究中，选择了与人类模板序列同源性最高的异构体进行建模，以初步评估潜在的分子相互作用。在对接之前，使用Pymol软件优化了初始蛋白质结构，并使用SAVES进行评估。然后使用Autodock软件v1.5.7（Autodesk，美国）进行分子对接。使用Discovery Studio分析了氢键、疏水相互作用等参数。最终，选择结合能（kcal/mol）最低的蛋白质-配体复合物作为最具生物活性的构象，并在Pymol中可视化。

**2.9. 统计分析**
所有实验数据均以平均值±标准误差表示。统计分析使用SPSS Statistics 25.0软件（IBM SPSS，美国）进行。使用Kolmogorov-Smirnov检验和Leven's检验分别检查所有实验数据的正态性和齐性。通过单因素方差分析（ANOVA）评估对照组和TPHP处理组之间的差异，随后进行Dunnett's post hoc检验，p值小于0.05视为统计学上显著。图表使用GraphPad Prim Version 9.0（GraphPad Software，美国）生成。此外，还进行了Pearson相关性分析，以评估基因表达水平与性激素含量之间的关系。

**3. 结果**

**3.1. 选择用于生命周期实验的慢性暴露浓度**
急性毒性的评估为设计亚致死和慢性暴露实验奠定了基础。在本研究中，确定了斑马鱼TPHP的72小时LC50值为3468.36 μg/L（10.63 μM）（图S1）。基于此值，选择了三个亚致死暴露浓度：26.00 μg/L（0.75% LC50）、130.0 μg/L（3.00% LC50）和650.0 μg/L（15.00% LC50），以评估TPHP对斑马鱼早期发育阶段的影响。最低浓度（26.00 μg/L）在环境上具有相关性[8]。72小时暴露后，该浓度未导致孵化率（图S2）、心率或体长（图S3）显著降低，也未引起明显的形态异常，如心包水肿、卵黄囊水肿或脊柱弯曲（图S4）。相比之下，中等和高浓度暴露对这些发育阶段产生了显著的、剂量依赖性的不良影响。鉴于在环境相关低浓度下未观察到毒性，并且符合研究旨在在现实暴露条件下调查慢性效应和生殖效应的目的，因此选择26.00 μg/L的TPHP作为所有后续生命周期暴露实验的名义浓度。然而，需要注意的是，在环境毒理学中使用单一浓度限制了建立剂量-反应关系的能力。未来包含多个浓度的研究将有助于确认这些反应的单调性，并识别与TPHP的性别特异性和跨代毒性相关的潜在阈值效应。

**3.2. TPHP在雄性和雌性斑马鱼生殖腺中的差异积累**
为了评估TPHP在雄性和雌性斑马鱼的大脑、生殖腺和肝脏组织中的积累特性，在240天暴露期后进行了LC-MS/MS分析。如图2A所示，雄性斑马鱼的睾丸中TPHP浓度最高（192.9 ± 33.17 ng/g），其次是大脑（171.0 ± 64.05 ng/g）和肝脏（142.9 ± 43.24 ng/g）。相比之下，雌性斑马鱼的大脑组织中TPHP积累最多（172.6 ± 45.85 ng/g），其次是肝脏（149.8 ± 36.25 ng/g），卵巢中的浓度最低（27.58 ± 1.363 ng/g）。值得注意的是，虽然大脑和肝脏组织中的TPHP水平在两性间相似，但生殖腺中的积累有显著差异：睾丸中的TPHP浓度是雌性组织中的最高值，大约是雌性的七倍。与这些积累模式一致，与对照组相比，两性的GSI均显著降低（p < 0.05，图2B-C），其中雄性的降低更为明显（p < 0.01，图2C）。暴露水中的TPHP浓度在更换水之前为24.8 ± 2.1 μg/L，更换水之后为26.6 ± 3.5 μg/L，与名义暴露浓度接近。总体而言，这些结果表明TPHP在生殖腺组织中以性别特异性的方式积累，可能对生殖产生性别特异性的不良影响。

**3.3. TPHP暴露影响F0斑马鱼的性别比例和生育能力**
为了评估TPHP暴露对性别分化的影晌，在60天大时通过次级性特征和生殖腺组织的组织学检查确定斑马鱼的性别。如图2D所示，TP处理组（TP）中的雌性比例显著增加至78.6 ± 6.10%，而对照组（DM）为54.5 ± 7.42%。这些发现表明TPHP通过促进雌性偏向的分化来扰乱性别比例。进一步通过比较不同暴露条件下的受精率和平均产卵数量（每对每时间）来评估F0成年斑马鱼的生育能力：未暴露（T1）、雄性TP暴露（T2）、雌性TP暴露（T3）和双重TP暴露（T4）。如图2E所示，T4组的受精率明显低于T1组。此外，T2和T4组的产卵数量显著减少，表明TP暴露在雄性中导致产卵能力受损。相反，T3组（雌性TP暴露）的产卵数量与未暴露对照组（T1）无显著差异（图2F）。

**3.4. TPHP暴露导致F0斑马鱼生殖腺的组织病理学改变**
在所有实验组中，对雄性斑马鱼的睾丸切片进行组织学检查，发现存在三种不同的生殖细胞类型：精原细胞（SG）、精母细胞（SS）和精子（ST）（图2G和S5）。与对照组（DM）相比，TP暴露的睾丸中成熟精子在生精小管腔内的积累减少或完全消失。此外，TP组的生精小管中保留了大量的SG和SS。形态测量分析表明，TP暴露导致SG和SS占据的横截面积比例增加，同时减少了与ST相关的面积（图2H）。这些发现共同表明，环境相关浓度的TPHP暴露会损害睾丸发育，可能导致异常的精子发生。此外，暴露于TP的睾丸显示出凋亡细胞增殖、隔膜扩张和生精上皮退化的特征（表S4）。

**3.5. TPHP改变F0斑马鱼的性激素水平和HPGL轴上的基因表达**
在雄性斑马鱼中，TP暴露导致GNRH和VTG浓度显著降低（图3A，C），而T水平在处理组中显著升高（图3E）。相比之下，所有组中的E2水平保持不变，导致TP处理后E2/T比率显著降低（图3D，F）。FSH水平没有显著变化（图3B）。在雌性中，TP暴露显著降低了GNRH、FSH和E2的浓度（图3A，B，D），同时显著增加了VTG和T的水平（图3C，E）。与雄性中的发现一致，TP暴露的雌性中也观察到E2/T比率的显著下降（图3F）。F0期斑马鱼血清中性类固醇激素的浓度，包括GNRH（A）、FSH（B）、VTG（C）、E2（D）和T（E），以及E2/T比值（F）。雄性和雌性F0期斑马鱼大脑（G, J）、生殖腺（H, K）和肝脏（I, L）中相关基因的表达水平。雄性（M）和雌性（N）斑马鱼中激素水平与HPGL轴相关基因表达之间的相关系数。数据以平均值±标准差表示。对照组和暴露组之间的显著差异用*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示。为了研究性激素合成紊乱的潜在机制，研究了长期暴露于TPHP后成年斑马鱼大脑、肝脏和生殖腺中HPGL轴关键基因的表达情况。在雄性大脑中，esrα和lhβ的转录水平显著上调，而cyp19b下调（图3G）。在雌性大脑中，TPHP暴露显著提高了fshβ、lhβ和cyp19b的表达（图3J）。在生殖腺组织中，TPHP处理导致两性中esrα、lhr和cyp19a的表达均受到抑制（图3H, K）。此外，卵巢中的fshr表达下调，但在睾丸中未受影响。在肝脏中，esrα和vtg1的表达在雄性中显著降低，在雌性中显著升高（图3I, L）。这些结果表明TPHP诱导了与HPGL轴相关的基因表达失调。进一步使用皮尔逊相关分析来阐明TPHP暴露组中血清激素水平与HPGL轴相关基因表达之间的关联（图3M, N）。在雄性中，大脑中的esrα和lhβ表达与GNRH和VTG的水平呈正相关。相反，在大脑中，血清T水平与fshβ和cyp19b的表达呈负相关，在睾丸中，lhr和cyp19a的表达也呈负相关。此外，大脑中的esrα和lhβ以及肝脏中的esrα与T水平呈正相关。在雄性中，没有发现任何分析基因与E2浓度之间的显著相关性。在雌性中，生殖腺和肝脏中的基因表达与血清激素水平的关联比雄性更强。具体来说，卵巢中的esrα、lhr和cyp19a表达与T和VTG浓度呈负相关，而与E2、FSH和GNRH呈正相关。在肝脏中，esrα和vtg1的表达与E2、FSH和GNRH水平呈负相关。TPHP暴露以性别特异性方式损害F1后代的发育。为了评估TPHP的跨代毒性，从四个不同的亲本暴露组（未暴露组（T1）、仅父本暴露组（T2）、仅母本暴露组（T3）和双亲暴露组（T4）产生了F1后代。随后在无TPHP的环境中监测这些F1代的发育情况以评估跨代效应。与T1对照组相比，所有亲本暴露组的24小时胚胎死亡率均升高，其中T4组的增加最为显著（p<0.001，图4A）。在48小时时，所有暴露的F1胚胎的心率显著降低（图4B）。此外，在72小时时，T2和T4组的体长显著缩短（图4C）。72小时时的畸形率也显著增加，主要表现为心包水肿（PE）和脊柱弯曲（SC）（图4D）。这些结果共同表明，尽管在无TPHP的环境中培养，亲本暴露于TPHP仍会导致F1代的显著发育障碍。

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**图4. 亲本TPHP暴露以性别特异性方式损害F1斑马鱼的发育毒性。不同组别F1斑马鱼在24小时时的死亡率（A）、48小时时的心率（B）、72小时时的体长（C）和72小时时的畸形率（D）。不同组别F1斑马鱼的GNRH（E）、FSH（F）、VTG（G）、E2（H）、T（I）和E2/T比值（J）的浓度。（D）T2（K）、T3（L）和T4（M）组F1斑马鱼中HPGL轴相关基因的转录变化。数据以平均值±标准差表示。不同组别之间的显著差异用*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示。**

为了评估TPHP的跨代内分泌效应，检查了F1幼体中HPGL轴的关键激素和遗传成分。所有来自TPHP暴露亲本的F1后代的T水平显著升高（T2、T3和T4）（图4I）。相比之下，其他激素基本保持不变，除了T2组的GNRH（图4E）和T3组的FSH（图4F）。因此，T2、T3和T4组的E2/T比值显著降低（图4J），这与F0代的观察结果一致。基因表达分析显示了组别特异性改变：父本暴露（T2）导致F1幼体中fshr和vtg1的表达显著下调（图4K），而母本暴露（T3）导致其上调（图4L）。在双亲暴露组（T4）中，esra、lhb和cyp19a的表达上调，而lhr下调（图4M），这种模式也在F0成体中观察到。

**3.7. 与CYP19、FSH、ER和ARA的结合分析**
根据先前的实验结果，HPGL轴基因的转录与激素水平有显著相关性。为了进一步了解TPHP对HPGL轴的影响，通过分子对接模拟研究了TPHP与参与激素合成的关键蛋白质之间的潜在相互作用。ER和AR分别是E2和T的主要靶点。此外，CYP19（芳香化酶）控制E2的生物合成过程，而FSH调节生殖腺类固醇生成。因此，选择ER、AR、FSH和CYP19进行分子对接，以进一步探索TPHP的作用模式。结果显示，TPHP对这四个靶点均具有结合潜力，结合能分别为?8.44、?7.44、?5.54和?1.71 kcal/mol（图5和S6）。鉴于其更强的结合亲和力，选择AR、CYP19和ER进行进一步的结构分析。在ER-TPHP复合物中，TPHP与氨基酸残基Trp405形成氢键（图5A），其结合模式类似于参考配体E2（图5B）。同样，在CYP19-TPHP复合物中，TPHP与Gly458和Val457形成两个氢键（图5C），类似于CYP19-formestane与Val457和Leu496的相互作用模式（图5D）。此外，TPHP对AR的结合亲和力为?8.44 kcal/mol，与Arg702、Pro632和Glu633形成三个氢键（图5E）。这种结合能明显高于参考拮抗剂enzalutamide（?7.21 kcal/mol），后者与Gln751和Lys758形成氢键（图5F）。TPHP的结合模式类似于enzalutamide，两种配体均未占据AR的典型激活位点。这些结构相似性表明TPHP以类似于其参考配体的方式与ER、CYP19和AR结合。

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**图5. 化合物（TPHP、E2、formestane和enzalutamide）与靶蛋白（ER、CYP19和AR）之间的结合模式。分子表面的疏水性势能图和结合模式：（A）ER–TPHP；（B）ER–E2；（C）CYP19–TPHP；（D）CYP19–formestane；（E）AR–TPHP；（F）AR–enzalutamide。黄色虚线表示配体（红色）与蛋白质氨基酸残基（蓝色）之间的氢键。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）**

**4. 讨论**
TPHP的广泛工业应用导致其在地表水中频繁被检测到，据报道其浓度对水生生物具有生态毒性[1]、[3]、[8]、[9]、[34]。本研究系统地研究了TPHP在环境相关水平下对斑马鱼生命周期暴露后的性别特异性生殖毒性。结果表明，TPHP显著损害了F0代的生殖能力，表现为生育力下降、生殖腺组织改变、性激素水平紊乱以及与HPGL轴相关的基因转录失调。值得注意的是，这些毒性效应表现出明显的性别差异。此外，亲本暴露导致F1代出现发育缺陷，表明存在跨代不良后果。相关分析和分子对接模拟表明，TPHP的生殖毒性可能通过AR-、ER-和CYP19依赖的途径介导，从而破坏HPGL轴的功能。

**TPHP在各种生物样本中的显著积累**
已有文献记录了TPHP的显著积累[19]、[35]。例如，Li等人研究了日本青鳉（Oryzias latipes）中TPHP的组织分布和生物浓度，发现卵巢和肝脏中的浓度高于肌肉和大脑[19]。这种器官特异性积累表明TPHP可能增加鱼的生殖毒性。在我们的研究中，我们研究了F0期斑马鱼在环境相关浓度下暴露于TPHP后肝脏、大脑和生殖腺中的TPHP积累情况（图2A）。两性肝脏和大脑中检测到相似水平的TPHP。然而，生殖腺中的积累表现出显著的性别差异，睾丸中的浓度是卵巢的七倍。尽管潜在机制尚不清楚，但几个因素可能导致这种差异。首先，浓度按干重进行了标准化；然而，组织成分的差异（如卵巢中的脂质含量较高）可能导致测量浓度的稀释，如果TPHP分布不均匀[19]。其次，生殖腺中代谢酶或外排转运蛋白的性别特异性表达可能导致化合物的差异保留和积累[35]。需要进一步的研究来阐明这种差异性积累模式的机制。鉴于生殖腺在生殖系统中的关键作用，这种差异性积累可能导致性别特异性的不良影响。

**TPHP暴露导致GSI显著降低**
GSI是广泛用于衡量脊椎动物性成熟度和生殖腺发育的定量参数[32]、[36]。这种下降通常伴随着生殖腺组织的组织病理学改变[37]。在雌性中，组织学检查显示PO比例增加，VO数量减少，表明卵子成熟受损。这些变化还与结构异常相关，包括基底膜破坏、透明带内陷和细胞坏死，共同证实了卵巢功能障碍。通过产卵量测量的生育力下降以及观察到的组织病理学损伤表明可能存在生殖损伤，这与先前在青鳉和小鼠模型中的发现一致[19]、[38]。在雄性中，TPHP暴露导致更严重的生殖障碍，表现为GSI显著下降、精原细胞（SG）增加和精子（ST）减少。还观察到睾丸病变，如生精小管紊乱和广泛坏死。这些病理变化可能解释了雄性生殖能力的显著下降，这与在中国稀有鲦鱼中的观察结果一致[21]。性别间的比较分析表明，TPHP通过不同的机制表现出性别特异性的毒性效应：雌性主要表现为卵子发育停滞，而雄性则表现为精子生成受到更严重的抑制。这些发现突显了该化合物破坏水生物种生殖适应性的潜力，这对维持种群稳定性和生态系统健康至关重要。

**TPHP暴露导致F0鱼群中性比改变**
TPHP暴露导致F0鱼群中的性别比例发生改变，雌性比例显著增加。在斑马鱼中，性别分化通常发生在21至42 dpf之间，大约在60 dpf时完成，并在90 dpf时达到性成熟[39]。先前的研究表明，在关键时期暴露于环境污染物会影响性别决定[40]。在本研究中，生命周期暴露于TPHP导致雌性比例显著高于对照组，表明在性别分化期间内分泌系统受到干扰。尽管这种性别偏向的性别比例通常与雌激素类化学物质有关[36]、[41]、[42]、[43]，但成体中E2/T比值的降低和分子对接数据表明机制更为复杂。具体来说，TPHP对AR具有高结合亲和力，类似于拮抗剂enzalutamide，表明抗雄激素效应可能有助于雌性化。在关键的性别分化窗口期间抑制AR信号传导已知可以促进斑马鱼的女性化[40]。此外，TPHP可能抑制CYP19（芳香化酶），这一点通过对接结果和cyp19a的下调得到了支持，可能会破坏发育中生殖腺的局部类固醇平衡，进一步促进女性化[42]。因此，观察到的性别比例变化很可能是由于早期发育过程中AR和CYP19活性的双重破坏，而不仅仅是雌激素机制的作用。重要的是，这项研究首次报告了斑马鱼在长期暴露于环境相关浓度的TPHP后出现女性偏高的性别比例，表明TPHP干扰了性别分化和决定过程。

在脊椎动物中，成功的繁殖依赖于生殖腺（睾丸和卵巢）与中枢神经内分泌系统的精确功能整合，这一过程由沿HPGL轴分泌的激素调控[28]、[29]、[44]。在F0代雌性斑马鱼中，暴露于TPHP导致GNRH和FSH水平降低，相应地血清E2水平也下降（图2）。另一方面，T水平升高。这些变化导致E2/T比率显著降低。大量证据表明，雌激素和雄激素之间的平衡对鱼类的性别分化至关重要，因此E2/T比率是内分泌紊乱的一个公认生物标志物[30]、[33]。鉴于性别分化是由雄激素和雌激素之间的相互作用调节的，并考虑到之前报道的TPHP的雌激素效应[19]，我们提出TPHP通过促进女性化同时抑制促性腺激素分泌和内源性E2合成来发挥作用，这与早期研究结果一致[20]、[45]。尽管雌性的E2水平下降，但VTG浓度显著增加，这可能是由于与卵黄生成相关的基因补偿性过表达[46]。在雄性斑马鱼中，观察到血清T水平升高和E2/T比率降低，这可能抑制了VTG的产生[47]。这些非典型的性激素水平与观察到的表型改变一致，进一步证明了生命周期中暴露于环境相关浓度的TPHP会以性别特异的方式引起生殖功能障碍。

转录分析进一步阐明了HPGL轴基因的性别依赖性失调。在雄性中，观察到大脑特异性芳香化酶基因cyp19b的下调，该酶是负责将雄激素转化为雌激素的关键酶[48]，这可能导致T积累和E2/T比率降低。esrα和lhβ的同时上调可能表明了一种补偿性反应或对雌激素和促性腺激素反馈回路的直接干扰[49]。在睾丸中，esrα、lhr和cyp19a（生殖腺芳香化酶）的协调下调表明生殖腺类固醇生成功能受损。cyp19a的抑制通过限制T向E2的局部转化进一步促进了雄激素的优势[48]。肝细胞中esrα/vtg1表达与T水平之间的正相关，加上它们的整体下调，表明雄激素受体信号传导受损或TPHP直接干扰了雌激素介导的卵黄生成[50]。在雌性中，大脑中fshβ、lhβ和cyp19b的上调可能反映了对外周类固醇生成抑制的不成功补偿反应。卵巢中esrα、lhr和cyp19a的抑制，加上在雄性中的观察结果，可以解释E2产生的减少，因为它们在卵泡发育和雌激素合成中起着重要作用[51]。雌性特有的fshr下调进一步损害了卵泡生成。值得注意的是，肝脏表现出雌性特有的esrα和vtg1上调，伴随着肝细胞中esrα/vtg1与循环T/VTG水平之间的强正相关。这表明升高的T可能作为异常雌激素信号传导的前体，或者TPHP本身可能作为雌激素类似物直接诱导VTG的产生[52]。尽管VTG水平升高，但E2水平总体下降，表明内分泌反馈调节受到显著干扰。这些性别特异性的反应可能源于生殖生理和化学敏感性的内在差异，强调了在毒理学评估中纳入性别特异性分析的重要性。

除了对F0代斑马鱼产生不良影响外，TPHP还对其后代胚胎的发育造成了毒性。我们的发现表明，亲代暴露于TPHP会导致F1代幼体出现严重的有害影响，包括死亡率增加、孵化延迟、心率异常和体长减少。此外，在F1代中观察到HPGL轴相关基因的表达紊乱和激素水平异常。值得注意的是，这些激素变化在96小时pf时就被检测到，此时HPGL轴尚未完全建立，生殖腺分化尚未发生。因此，这些改变可能反映了发育中的内分泌轴的程序性破坏，代表了亲代内分泌紊乱传递给后代的早期分子特征，而不是这一阶段生殖功能的直接评估。需要承认一个限制：尽管这些早期内分泌紊乱提供了关于代际干扰的宝贵见解，但需要进一步的长期研究来确定它们如何精确地转化为后期的生殖结果。尽管如此，这些改变被认为是潜在生殖或代谢异常的宝贵早期指标，这些异常可能在后期表现出来[51]。这种内分泌紊乱与F0代的观察结果相似。有趣的是，一些效应在父代暴露（T2）后比母代暴露（T3）后更为明显。这些性别特异性的毒性模式可能归因于TPHP在亲代生殖腺中的性别特异性生物积累，其中精子发生和卵子发生之间的生物学差异可能导致了后代的差异性结果[22]、[23]、[24]、[25]。尽管在F1代后代中没有检测到TPHP，但在F0代和F1代中都观察到了关键基因的类似转录变化和激素失衡。这些发现进一步支持了父代和母代暴露于TPHP都可以在后代中引起显著内分泌紊乱效应的结论。总体而言，结果表明，暴露于TPHP不仅直接损害了F0代斑马鱼的生殖和内分泌功能，还通过代际传递在未暴露的F1代后代中引发了效应。

为了补充体内发现，进行了分子对接模拟以探索潜在的分子相互作用。尽管这种计算机预测存在固有的局限性，特别是由于使用了基于人类模板的同源性模型，但它们作为生成假设的工具，有助于识别合理的机制。结果表明，TPHP对AR、CYP19和ER具有高结合亲和力，表明它可能通过多种途径作为内分泌干扰物发挥作用。然而，这些对接结果需要谨慎解释，未来的实验研究（如竞争性结合测定）是验证预测相互作用的必要条件。考虑到这一点，对接分析提供了一个与观察到的基因表达和激素调节下游效应一致的合理分子起始事件。与已建立的拮抗剂enzalutamide相比，TPHP与AR的强相互作用表明它可能作为AR配体并发挥拮抗作用，正如先前的研究结果所报告的[40]、[53]。TPHP与CYP19的高亲和力结合，类似于抑制剂formestane，直接证实了cyp19a基因表达的下调和随后两性中E2合成的抑制。与ER的相互作用，采用类似于E2的结合模式，可能解释了在雌性肝脏中观察到的雌激素效应，如vtg1的诱导。这些直接的受体相互作用经常被报道为鱼类内分泌紊乱的机制[49]、[54]。因此，数据表明TPHP的性别特异性生殖毒性可能与涉及AR-、ER-和CYP19依赖性途径的复杂相互作用有关。这种初始的分子相互作用触发了HPGL轴上的连锁失调（图6），导致类固醇生成途径的紊乱。最终的表现型特征是雄性中雄激素过剩和雌激素缺乏，以及雌性中中枢激素抑制和周围雌激素效应的复杂状态，这主要由HPGL轴在每种性别中的不同生理作用和调节反馈回路决定。

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图6. 性别差异在生殖毒性机制中的作用

5. 结论
本研究表明，生命周期中暴露于TPHP会导致斑马鱼出现性别特异性的生殖损伤，表现为TPHP的差异性生物积累、生殖腺病理、激素失衡以及HPGL轴上的基因失调。因此，在种群中观察到了持续的女性偏高的性别比例。这些不同的效应可能主要通过干扰ER-、AR-和CYP19介导的信号通路来介导。此外，观察到的毒理学表型是可遗传的，亲本双方都有显著贡献，从而揭示了TPHP相关的显著代际风险。这些发现为TPHP在鱼类中的生殖毒性提供了新的见解，并强调了在生态风险评估中评估性别特异性和代际效应的重要性。

作者贡献声明
梁晓萍：撰写——原始草稿、验证、调查、资金获取、正式分析。
严浩伟：调查、正式分析、数据管理。
钱晓琪：正式分析、数据管理。
高翔：正式分析、数据管理。
郝春燕：撰写——审阅与编辑、监督。
栾天刚：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。