杀螨剂氟氯氰菊酯对蜜蜂（Apis mellifera）的表观遗传影响

《Environmental Pollution》：Epigenetic Impacts of the Acaricide Flumethrin on Honeybees ( Apis mellifera)

氟虫腈通过改变RNA m?A、DNA 5mC/6mA等表观遗传修饰，影响Hedgehog/Hippo和FoxO/MAPK信号通路相关基因表达，导致蜜蜂嗅觉敏感度下降和神经毒性，并识别出EDD1、PI3K等潜在生物标志物。

　　

王雪|齐素珍|丁牧|张伟|黄爱迪|孙长路|范曼|吴丽明|王淼

中国农业科学院蜜蜂研究所资源昆虫国家重点实验室，北京 100093

摘要

表观遗传修饰有助于生物体适应环境毒素。虽然已记录了氟氯氰菊酯对蜜蜂的毒性，但其对表观遗传修饰的影响机制仍不清楚。风险筛查显示，在蜜蜂群体中氟氯氰菊酯残留物普遍存在，并且在蜜蜂大脑中表现出显著的生物积累。在10 μg/L的暴露浓度下（最低检测到的残留水平），氟氯氰菊酯显著改变了多种表观遗传修饰的水平，包括RNA m⁶A、A_m、m⁵C、m⁷G以及DNA 5mC和6mA，同时也影响了相关基因的表达。m⁶A-seq分析表明，氟氯氰菊酯显著改变了与Hedgehog和Hippo信号通路相关的神经活动和记忆功能转录本上的m⁶A甲基化。关键的是，m⁶A甲基化调节了12种气味受体的转录本，这与电触角图谱学证实的氟氯氰菊酯诱导的嗅觉敏感性缺陷相关。此外，氟氯氰菊酯还改变了FoxO和MAPK信号通路中编码应激传感器和免疫调节因子的转录本的甲基化，从而触发了防御反应。这些由氟氯氰菊酯诱导的表观遗传标记和m⁶A介导的转录本，包括EDD1、PI3K、Ptc、FoxO和Jra、Argk，可以作为评估蜜蜂神经毒性的潜在生物标志物。我们的发现为氟氯氰菊酯的毒性提供了新的机制见解，并为使用表观遗传生物标志物评估蜜蜂的环境风险提供了框架。

引言

作为重要的传粉者，蜜蜂对农业经济做出了巨大贡献，同时在维持生态系统平衡和促进植物多样性方面发挥着关键作用^[1]。然而，近年来由于农药的使用，蜜蜂种群数量显著下降，引发了广泛关注。特别是氟氯氰菊酯在养蜂业中被广泛用作拟除虫菊酯类杀螨剂，用于控制Varroa destructor的侵扰^[2]。这种化合物具有高度亲脂性，容易在蜂巢内积累，对蜂群构成严重威胁。研究表明，在花蜜流期，蜂蜜样本中的氟氯氰菊酯含量可达到0.126 mg/kg，蜂蜡中的含量可高达3.0 mg/kg^[3]。由于其高亲脂性（Log P = 6.2）^[4]，氟氯氰菊酯在蜂蜡中持久存在，并在蜂产品中表现出显著的稳定性；例如，在室温下约九个月内蜂蜜中没有观察到明显的降解^[5]。这种环境持久性和长的有效半衰期可能加剧了蜜蜂群体的慢性暴露风险。

与氟氯氰菊酯广泛使用相关的环境和生态风险日益明显，尤其是其对蜜蜂健康的潜在威胁。在我们之前的研究中，我们确定氟氯氰菊酯的48小时半数致死剂量为0.47 μg/只蜜蜂，表明其对蜜蜂具有高急性毒性。这种毒性超过了多种商业拟除虫菊酯杀虫剂，但低于tau-fluvalinate的毒性^[6]。此外，研究发现，氟氯氰菊酯残留物会通过干扰控制记忆、解毒、免疫和发育的基因表达，损害幼虫发育和成年工蜂的功能^{[7]、[8]、[9]。具体来说，在环境相关浓度10 μg/L下（Yu[3]等在中国蜂蜜样本中检测到的浓度，以及本研究接近的浓度范围13.4 μg/L），氟氯氰菊酯已被证明可以降低酶活性[10]，扰乱肠道微生物代谢，并改变代谢平衡[11]。总体而言，这些发现强调了氟氯氰菊酯在慢性低浓度暴露下对蜜蜂健康的多方面威胁。}

表观遗传修饰在不改变DNA序列的情况下调节基因表达，在生物体应对和适应环境压力方面起着关键作用。常见的RNA甲基化包括N⁶-甲基腺苷（m⁶A）、2′-O-甲基腺苷（A_m）、5-甲基胞嘧啶（m⁵C）和N⁷-甲基鸟苷（m⁷G），而DNA甲基化主要表现为5-甲基脱氧胞嘧啶（5mC）和N⁶-甲基脱氧腺苷（6mA）^[12]。这些核酸修饰是动态且可逆的，由特定的“写入”、“擦除”和“读取”蛋白控制^[13]。现有证据强烈支持表观遗传修饰作为疾病进展的媒介和环境风险评估潜在生物标志物的观点^[14]。RNA m⁶A是真核生物中最丰富的转录后修饰之一。迄今为止，许多研究表明，污染物（如空气中的颗粒物（例如炭黑和PM₂.₅）、内分泌干扰物（例如双酚A和 vinclozolin）和重金属（例如砷、铬和镍）可以改变全局m⁶A甲基化模式^[15]。这些干扰可以直接通过破坏m⁶A的稳态来促进疾病发生。m⁶A甲基化水平与环境暴露的程度和类型密切相关^[16]，这使得m⁶A成为风险评估的潜在生物标志物。然而，关于农药诱导的m⁶A失调的研究仍然很少。考虑到m⁶A-seq已成功用于绘制全转录组范围内的m⁶A修饰并揭示其在生物过程中的调控作用（如蜜蜂品级分化和营养信号响应^[17]，它也可以成为毒理学评估的有用工具。将其应用于这一领域将有助于系统地识别m⁶A修饰的转录本和通路，从而揭示农药毒性的表观转录组机制并识别与毒性相关的m⁶A标记物。

为了系统地阐明氟氯氰菊酯对蜜蜂的环境风险和机制，本研究结合了暴露风险筛查和综合表观遗传及m⁶A表观转录组方法。在验证了蜂蜜中氟氯氰菊酯的残留情况后，评估了其在蜜蜂组织中的特异性积累。计算了氟氯氰菊酯在蜜蜂大脑中的生物积累量以及蜜蜂群体中的平均含量。此外，10 μg/L的氟氯氰菊酯显著改变了多种DNA和RNA甲基化的水平，并干扰了相关基因的表达。对蜜蜂大脑的m⁶A-seq表观转录组分析显示，氟氯氰菊酯显著改变了与FoxO、Hedgehog、Hippo和MAPK信号通路相关的转录本上的m⁶A甲基化。这些差异甲基化的转录本参与了嗅觉敏感性、神经功能、抗压能力和免疫反应的调节。总体而言，本研究阐明了氟氯氰菊酯毒性和蜜蜂防御反应背后的关键表观遗传机制。氟氯氰菊酯诱导的表观遗传标记变化和m⁶A介导的转录本变化被认为是蜜蜂神经毒性的潜在早期预警生物标志物。

章节片段

蜜蜂中氟氯氰菊酯的普遍存在

2024年秋季，从中国北京的三个养蜂场（每个养蜂场10个样本）收集了30个蜜蜂样本。提取过程中，首先用1 mL水匀浆整个蜜蜂，然后加入2 mL乙酸乙酯，涡旋2分钟，再以8,000 rpm离心5分钟。此提取过程重复两次，合并上清液并在氮气流下干燥。浓缩液重新溶解在1 mL正己烷中，

氟氯氰菊酯的剂量会破坏蜜蜂大脑中的表观遗传修饰

使用经过验证的方法筛查了养蜂业中氟氯氰菊酯的普遍风险。在三个随机选择的养蜂场检测到了氟氯氰菊酯残留物，蜜蜂体内的平均浓度分别为31.43 μg/kg（养蜂场2）、4.03 μg/kg（养蜂场3）和6.77 μg/kg（养蜂场1）（图1A）。不同养蜂场之间的检测频率存在显著差异，养蜂场3的检测频率最高达到80%，而养蜂场2的最低为10%（图1B）。这些结果表明了氟氯氰菊酯的普遍存在

讨论

氟氯氰菊酯是一种广泛使用的杀螨剂，据报道会干扰蜜蜂的发育、免疫系统、肠道微生物群和代谢。然而，蜜蜂对氟氯氰菊酯反应的分子途径和基因调控机制仍知之甚少。我们的研究发现，通过摄入受污染的食物，氟氯氰菊酯在蜜蜂大脑中显著积累。在生态相关浓度（10 μg/L）下，氟氯氰菊酯显著改变了多种表观遗传修饰的水平

结论

总之，我们的研究表明，氟氯氰菊酯残留物在蜜蜂群体中普遍存在，并可在蜜蜂大脑中大量积累，导致神经毒性。表观遗传修饰是蜜蜂大脑对氟氯氰菊酯诱导的压力敏感的响应指标。RNA修饰（m⁶A、A_m、m⁵C、m⁷G）和DNA甲基化（5mC和6mA）及其调控基因的水平与氟氯氰菊酯暴露显著相关。全转录组范围内的m⁶A甲基化

CRediT作者贡献声明

王淼：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、数据分析、概念构思。王雪：初稿撰写、资源获取、调查、数据分析、数据管理。齐素珍：审稿与编辑、资源获取、调查、数据分析、概念构思。黄爱迪：数据分析。孙长路：资源获取。丁牧：资源获取、调查。张伟：调查、数据分析。范曼：调查。吴丽明：监督、资金提供

利益冲突

作者声明没有竞争利益。

资助

本工作得到了中国农业科学院的青年创新计划[Y2023QC11, Y2023QC12]、国家自然科学基金[32472970, 32272936]、北京自然科学基金[6232040]以及上海化学生物学重点实验室的启动基金[SKLCB-2024-05]的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢LC Bio Technology有限公司的杨一帆和盛斌在测序和生物信息学分析方面的协助。