在温室葡萄藤上叶面施用Rugulopteryx okamurae提取物可增强土壤的恢复力

《European Journal of Soil Biology》：Foliar application of a Rugulopteryx okamurae extract enhances soil resilience in greenhouse grapevines

　　阿西尔·卡马拉（Asier Cámara）|艾玛·坎托斯-维拉尔（Emma Cantos-Villar）|安娜·迪埃兹-纳瓦哈斯（Ana Díez-Navajas）|阿玛亚·梅纳-佩蒂特A（Amaia Mena-Petite A）|马伊特·拉库埃斯塔（Maite Lacuesta）|乌苏埃·佩雷斯-洛佩兹（Usue Pérez-López）|米克尔·伊里昂多（Mikel Iriondo）|伊拉切·扎劳纳因迪亚（Iratxe Zarraonaindia）
西班牙巴斯克大学（EHU）科学与技术学院遗传学、体质人类学和动物生理学系，莱奥亚，比斯开省

**摘要**
霉菌病在葡萄栽培中构成了重大挑战，尽管铜基化合物具有环境方面的缺点（如长期使用会对土壤微生物群产生影响），但它们仍然是主要的治疗手段。基于海藻的提取物作为可持续替代品正在兴起，然而它们对非目标微生物群的影响仍知之甚少。本研究在温室条件下评估了Rugulopteryx okamurae叶提取物（RO）对两种Tempranillo葡萄品种（RJ43和VN40）的地下影响，并将其与铜（BB）和水（W）处理过的植物进行了比较。通过16S rRNA和ITS高通量测序技术分析了土壤中的细菌和真菌群落，并结合了地下物理化学参数（土壤pH值、氮磷钾含量以及鲜重与干重比）的测量。处理前，不同品种的土壤微生物群存在显著差异，这突显了砧木对土壤微生物群的影响。铜处理增加了木材腐朽菌或潜在病原菌的数量，从而增加了葡萄藤干病（Phaeoacremonium sp.）的风险。相比之下，海藻提取物促进了有益真菌的生长，包括Hypholoma fasciculare（在RJ43中）、Trichoderma hamatum（在VN40中）和Candida subhashii（在两个品种中）。值得注意的是，RJ43品种经RO处理的土壤中病原真菌群减少了75%。RO还增强了微生物间的连接性，表明土壤真菌群更加稳定和具有抵抗力。因此，研究结果表明R. okamurae提取物可能通过调节地下微生物组来改善土壤状况。这些反应具有品种特异性，突显了砧木在生物刺激剂效果中的重要作用。总体而言，观察到的土壤-葡萄藤联盟的增强作用支持了R. okamurae作为改善葡萄栽培系统中土壤微生物平衡和抗性的可持续策略的潜力。

**1. 引言**
葡萄（Vitis spp.）是一种具有极高社会经济价值的作物。欧洲的种植面积最大，达到330万公顷，其中西班牙占94.5万公顷，是该作物种植面积最大的地区和国家[1]。尽管该作物具有丰富的遗传多样性，但只有两个品种——Airén（20.48%，白色品种）和Tempranillo（21.45%，红色品种）——占西班牙葡萄园面积的42%[2]。如今，大多数商业上重要的葡萄品种都容易受到真菌病害的侵袭[3]。由Plasmopara viticola引起的霜霉病是一种极具破坏性的病害，导致全球巨大的经济损失[4]。除了其他负面影响外，P. viticola还会导致葡萄提前落叶，阻碍果实成熟，并增加冬季损伤的风险[5]。这种病害主要通过铜基化合物进行控制，因为铜具有多种作用机制，且不易产生抗铜霜霉病的菌株[6]。然而，葡萄园土壤中铜的积累令人担忧，因为它对葡萄藤、周围植被和土壤生物具有毒性[7]。这种积累还威胁食品安全和人类健康[8]，同时渗漏还会污染附近的水体，破坏水生生态系统[9]。因此，欧盟委员会已将铜列入替代品候选名单[10]，尽管由于其高效性，铜仍然是有机葡萄栽培中最常用的抗真菌产品[11]。此外，自2019年2月起，铜的使用量被限制在每公顷每年4公斤，分7年使用[12]。欧盟的“从农场到餐桌”战略目标还包括将化学农药的使用量减少50%，并使25%的农业用地实现有机化[13]。鉴于此，寻找环保的农业解决方案迫在眉睫。

海洋藻类被视为最有前景的天然替代策略之一[13]。海藻及其提取物已被用作土壤改良剂和叶面喷剂，以促进作物生长、提高产量和生产力[14-16]，最近的研究还表明它们对增强植物健康有积极作用，例如通过激发植物对不同病原体的防御反应[17,18]。特别是在葡萄藤上，研究表明，棕色藻类Ascophyllum nodosum（研究最广泛的海藻，也是多种商业植物生长刺激剂的来源[19]）的应用可以促进营养生长，并对葡萄成熟和果实品质产生有益影响[20,21]。在葡萄藤的防护能力方面，藻类提取物显示出通过直接或间接方式减少病原体数量的能力[22]。例如，富含硫酸化多糖ulvan的Ulva armoricana粗提取物在多次叶面处理后显示出对葡萄白粉病的抑制作用（症状减少了90%[23]）。同样，基于Rugulopteryx okamurae的提取物（这种入侵物种目前正扩散到大西洋地区，包括坎塔布连海）的应用能够诱导葡萄藤的防御和免疫基因，以及产生次级代谢产物如芪类、植物激素和抗氧化酶[24]。有趣的是，R. okamurae提取物在Tempranillo品种中能够将P. viticola的发病率和严重程度分别降低20%和25%[25]。

海藻处理的另一个显著影响是它们能够改变与植物相关的微生物群，促进生长并提供额外的病原体防护[26,27]。最近，关于叶面施用的商业诱导剂对葡萄藤叶层的影响也进行了研究[28-30]，总体表明这类产品可以部分改变微生物群。此外，Zarraonaindia等人[24]发现，R. okamurae水提取物除了能够激发葡萄藤的激素和基因防御反应外，还能丰富叶片上的有益真菌群。将选定的海藻提取物直接施用于土壤已被证明可以改变根际微生物群，促进根际有益微生物的活动[31-35]。此外，这些提取物还显示出作为生物控制剂对抗细菌、病毒、真菌和线虫的有效性[36]。当海藻施用于植物根部时，也观察到了间接效应[37]。例如，A. nodosum提取物被证明可以刺激植物释放特定的根分泌物（如黄酮类化合物），这些分泌物可作为有益根际细菌的化学引诱剂[38]。同样，用A. nodosum及其有机组分处理根部可以调节豆科植物与根瘤菌之间的信号传导，从而促进共生固氮[39]。虽然这些发现突显了海藻提取物通过地下应用调节有益根-微生物相互作用的能力，但关于叶面施用对地上信号传导的间接影响以及其对地下微生物群的影响仍知之甚少[40]。鉴于土壤微生物多样性在维持农业生态系统健康中的关键作用，这一知识空白尤为重要。微生物多样性的下降会破坏重要的生态系统服务，包括养分循环和水分调节，并降低植物对生物和非生物胁迫的抵抗力[41]。此外，这种下降还会增加机会性和病原性微生物的威胁，对植物健康和生产力构成风险[42]。

鉴于这些问题，本研究调查了R. okamurae提取物叶面施用对两种Tempranillo葡萄品种的土壤物理化学性质及地下微生物生态系统（细菌和真菌）的间接影响。在生物刺激处理前后以及感染P. viticola后，对土壤微生物动态进行了评估。这些分析探讨了基于海藻的生物刺激剂在葡萄栽培中的更广泛影响，特别是它们在塑造土壤-植物-微生物相互作用和支持综合病害管理策略中的作用。

**2. 材料与方法**
**2.1. 实验设计和采样**
本研究使用了60株Tempranillo葡萄品种（Vitis vinifera L.）的植株，每个品种各30株：VN40和RJ43（分别由西班牙纳瓦拉的Vitis Navarra和Viveros Villanueva苗圃提供）。所有植株均嫁接在Richter-110砧木上，并在二级封闭温室（NCB2）中生长。每株植株种植在装有富含有机物质（90%）、泥炭藓（160 g/L）、碳酸钙（7 g/L）、氮磷钾肥料（1.5 g/L）和微量元素（PotgrondH，Klasmann-Deilmann GmbH，德国）的5升容器中。植株在受控环境中生长，直到长出10-12片完全展开的叶子（光照周期为每天16小时/夜间8小时，平均室温18°C）。随后，每个品种的10株植株接受了3次R. okamurae藻类水提取物（RO，浓度6 g/L）的喷洒处理，另外10株分别接受了水（W，阴性对照）或铜（BB，阳性对照，总浓度4.2 g/L，每次喷洒含Bordeaux broth GREENDEL JED和Cuprocalcium Sulfate 20%）。

为了制备提取物，在西班牙加的斯（Algeciras，坐标5° 25′ 34.75″ W, 36° 4′ 37.56″ N）采集了棕色大型藻类R. okamurae，然后由IFAPA工作人员进行清洗、冷冻干燥和70°C下的双重水提取，随后按照Cantos-Villar等人的方法进行化学鉴定[25]。所有处理组（RO、W和BB）都添加了0.1%的Retenol（Daymsa，萨拉戈萨，西班牙）作为叶面辅助剂。处理每48小时进行一次，第三次处理后48小时，所有植株均接种了P. viticola（5 x 10^4孢子囊/mL）。为避免处理组间的位置效应，每隔两到三天更换植株块，确保在整个实验过程中每个处理组的位置不变。为防止处理液在植株块间扩散，处理当天在块之间放置了移动挡板。此外，在每次处理过程中，用滤纸保护盆中的土壤，以防止处理液流失，从而能够评估处理对土壤的间接影响。Cantos-Villar等人[25]还报告了该实验的植物生理和代谢物分析以及病害发生率和严重程度。叶片在液氮中研磨后用于基因表达和次级代谢物分析，包括酶活性和多酚含量。病害发生率和严重程度以百分比记录，并根据欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）的标准转换为0-7等级。在第一次处理前（S0）、最后一次处理后24小时（S1，第5天）以及实验结束时（SF，第一次处理后第35天）收集土壤样本（补充图1）。

使用土壤取样器从每个盆中采集深度为1-10厘米的土壤，每个盆取三个样本。每个盆的土壤均进行均质化处理，一部分样本冷冻（-80°C）用于微生物群分析。另一部分样本用于测量pH值（使用1:5的土壤与水比例），剩余样本称重后于80°C下烘干，以确定S0、S1和SF时期的鲜重与干重比。在整个病害发展期间（直至实验结束SF），使用Les-Theresa – Smart Soil Tester仪器原位分析土壤中的氮（N）、磷（P）和钾（K）浓度（mg/kg），以评估土壤养分可用性。此外，在SF时期还测定了根生物量。通过翻转容器小心取出植株，手动摇晃后用水轻轻清洗以去除附着的基质，尽量减少细根损失。根在精密分析天平上称重，然后在80°C下烘干至恒重。

**2.2. 微生物鉴定**
使用DNeasy Power Lyzer Power Soil Kit（Qiagen，德国希伦登）对180个总样本（每个采样时间点60个样本）进行了总DNA提取。使用fITS7/ITS4引物扩增内部转录间隔区2（ITS2），使用341F/805R引物扩增16S rRNA的V3-V4高变区[44]。扩增子文库和测序在巴斯克大学（UPV/EHU）的基因组设施（SGIker）的测序和基因分型单元进行。

对于16S rRNA扩增，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix（Roche Kapa Biosystems），热循环程序的激活时间和温度如下：95°C下3分钟，随后是25个循环，每个循环30秒；55°C下30秒；72°C下30秒；最后是一个5分钟的72°C循环。为了ITS扩增，还使用了KAPA HiFi Hotstart ReadyMix（Roche Kapa Biosystems），热循环程序的激活时间和温度如下：95°C持续5分钟，随后是30个循环，每个循环包括95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒，最后是一个10分钟的72°C循环。文库使用Illumina? DNA/RNA UD试剂盒进行了独特的双索引处理。配对末端测序在Illumina MiSeq平台上进行，真菌和细菌的读取长度分别为250和300个碱基对。生成的原始序列数据已存入欧洲核苷酸档案（ENA），访问号为PRJEB104688。序列在QIIME 2中进行了质量修剪和去多重化处理[45]。DADA2用于去噪、去除嵌合体以及扩增子序列变异（ASV）的推断。对于16S数据集，合并了配对末端读段；而对于ITS数据集，则仅使用了正向读段。细菌的分类鉴定是基于预过滤了16S rRNA V3-V4区域的Silva 132数据库进行的，而真菌群落的鉴定则使用了UNITE v8_February 04, 2020版本。细菌和真菌数据的可视化和统计分析也在QIIME 2中完成。Alpha多样性是根据Shannon熵指数和观察特征指数确定的，而Kruskal-Wallis检验用于分析不同处理组之间的显著差异。使用Permanova和Adonis检验（基于beta多样性指数Bray-Curtis和Jaccard）来确定不同处理组和克隆之间的群落组成差异。通过LEfSe（线性判别分析效应大小）[46]和ACOM-BC（用于RO与W处理组的比较）[47]来确定不同处理组和克隆之间微生物类群的丰度差异。此外，还使用FAPROTAX[48]和FUNGuild[49]分别对细菌和真菌进行了土壤生态角色和代谢潜力的功能预测。

为了ITS扩增，还使用了KAPA HiFi Hotstart ReadyMix（Roche Kapa Biosystems），热循环程序的激活时间和温度设置如下：95°C持续5分钟，随后是30个循环，每个循环包括95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒，最后是一个10分钟的72°C循环。文库使用Illumina? DNA/RNA UD试剂盒进行了独特的双索引处理。配对末端测序在Illumina MiSeq平台上进行，真菌和细菌的读取长度分别为250和300个碱基对。生成的原始序列数据已存入欧洲核苷酸档案（ENA），访问号为PRJEB104688。序列在QIIME 2中进行了质量修剪和去多重化处理[45]。DADA2用于去噪、去除嵌合体以及扩增子序列变异（ASV）的推断。对于16S数据集，合并了配对末端读段；而对于ITS数据集，则仅使用了正向读段。细菌的分类鉴定是基于预过滤了16S rRNA V3-V4区域的Silva 132数据库进行的，而真菌群落的鉴定则使用了UNITE v8_February 04, 2020版本。细菌和真菌数据的可视化和统计分析也在QIIME 2中完成。Alpha多样性是根据Shannon熵指数和观察特征指数确定的，而Kruskal-Wallis检验用于分析不同处理组之间的显著差异。使用Permanova和Adonis检验（基于beta多样性指数Bray-Curtis和Jaccard）来确定不同处理组和克隆之间的群落组成差异。通过LEfSe（线性判别分析效应大小）[46]和ACOM-BC（用于RO与W处理组的比较）[47]来确定不同处理组和克隆之间微生物类群的丰度差异。此外，还使用FAPROTAX[48]和FUNGuild[49]分别对细菌和真菌进行了土壤生态角色和代谢潜力的功能预测。

为了评估微生物群落的结构特性，使用了MENA（分子生态网络分析）[50]构建了共现网络。网络是基于ASV丰度矩阵构建的，相似性阈值是通过随机矩阵理论（RMT）确定的。计算了关键的拓扑指数，如平均聚类系数（avgCC）、调和测地距离（HD）、介数中心性（CB）和模块性。为了评估观察到的网络特征的显著性，为每个实证网络生成了100个随机网络。根据Deng等人的方法[49]，使用随机网络的标准差作为变异性的估计值进行了Student's t检验。

3. 结果
3.1. 接穗基因型对土壤微生物群落的影响
在初始采样（S0）时，即处理之前，所有植物的土壤显示出相似的pH值和鲜重与干重比，样本之间的细菌或真菌alpha多样性值没有显著差异（补充表1），表明所有样本和克隆的土壤化学性质和微生物丰富度是一致的。尽管存在这些相似性，但在研究的两个Tempranillo克隆相关的土壤之间观察到了微生物群落组成的显著差异。根据成对PERMANOVA结果，“克隆”因素是群落差异的关键驱动因素，特别是使用如Jaccard这样的存在/缺失敏感指数时（补充表2）。这些差异在真菌部分更为明显（Jaccard：Pseudo-F = 1.256，p值 = 0.002，ADONIS R2 = 0.065，用于RJ43与VN40 W植物的比较）。
LEfSe分析揭示了在S0时最能有效区分两个克隆之间土壤群落的微生物类群（图1）。VN40土壤主要通过包括Elsterales、Sphingomonas、Saccharimonadales、Haliangium和Myxococcales在内的细菌类群进行区分（较低的p值和较高的LDA分数）（图1a），而真菌差异则由Talaromyces atroroseus、Lasiobolidium spirale、Clitopilus、Sebacinales和Thaumatomonadida驱动（图1b）。相比之下，在RJ43土壤中，Holosporaceae、Candidatus Nitrotoga、Aquicella、Candidatus Kaiserbacteria和Acetobacteraceae细菌类群的贡献最大，表明它们与特定克隆的土壤群落有很强的关联（图1a）。对于同一土壤中的真菌，最具影响力的类群是Cyphellophora eucalypti、Calyptella capula、Urostylida、Pseudeurotium和Ceratobasidiaceae（图1b）。

3.2. 叶面处理对地下生态系统间接影响的表征：分类学、功能和微生物相互作用
3.2.1. 基于铜的叶面处理（BB）对土壤微生物群落的影响
在S1时间点，经过三次叶面施用波尔多液（BB）后，VN40土壤中的Fimbriimonadaceae和Steroidobacter类群的细菌以及Oidiodendron flavum、Papiliotrema frias、Xylodon ramicida、Xylodon raduloides、Cystobasidium slooffiae和Hyphodontia alutaria真菌物种显著富集，而W和RO处理组则没有这种富集（Lefse LDA >2）（图2a和c）。相比之下，BB处理的RJ43土壤中属于Oligoflexales和Cephaloticoccus类群的两种细菌以及Gymnopilus penetrans真菌物种显著增多，同时Phaeoacremonium和Umbelopsidomycetes成员也有所增加（Lefse LDA >2，图2b和d）。

3.2.2. R. okamurae水提取物（RO）对土壤性质和微生物群落的影响
在最后一次海藻处理后的24小时（S1），RO对土壤生理性质和微生物群落的影响因所研究的克隆而异。在VN40土壤中，RO处理没有显著影响任何地下测量指标，包括土壤因素和微生物alpha多样性（p值 > 0.05；图3）。相比之下，RJ43土壤在RO处理后pH值显著增加（W vs RO：p值 = 0.010；图3b），同时微生物多样性降低（图3c和d）。

关于土壤群落组成，RO处理引起了显著变化，其中真菌群落受到的影响最大（补充表4）。Lefse分析确定了几个特定的真菌和细菌物种的丰度变化（图2），强调了全面评估叶面施用产品的重要性，包括它们对植物-土壤相互作用和整个生态系统平衡的广泛影响。例如，在三次叶面施用R. okamurae提取物后，VN40土壤中属于Cohnella、Sandaracinaceae、Sphingobacteriales、Pseudomonas、Rhizobiaceae、Chthoniobacteraceae、Acidipila、Gematimonadaceae和Edaphobacter类群的九种细菌物种富集（图2a）。而对于真菌，Candida subhashii和Trichoderma hamatum物种以及Eurotiales的一个成员得到了富集（图2c）。相比之下，RJ43土壤中则富集了Spirochaeta属的一个成员以及Chlamydomonas moewusii物种（图2b）。虽然富集的真菌类群包括C. subhashii、Hypholoma fasciculare和Minimelanolocus submersus物种（图2d），但ACOM-BC分析（图4）进一步证实了这些变化的稳健性，C. subhashii在VN40中富集，而H. fasciculare在RJ43中富集，这与LEfSe的结果一致。然而，由于ACOM-BC方法的显著性阈值更为严格，未能在RJ43中检测到C. subhashii。

3.3. 叶面处理对地下生态系统的影响：分类学、功能和微生物相互作用
3.3.1. 基于铜的叶面处理（BB）对土壤微生物群落的影响
在S1时间点，经过三次叶面施用波尔多液（BB）后，VN40土壤中的Fimbriimonadaceae和Steroidobacter类群的细菌以及Oidiodendron flavum、Papiliotrema frias、Xylodon ramicida、Xylodon raduloides、Cystobasidium slooffiae和Hyphodontia alutaria真菌物种显著富集，而W和RO处理组则没有这种富集（Lefse LDA >2）（图2a和c）。相比之下，BB处理的RJ43土壤中属于Oligoflexales和Cephaloticoccus类群的两种细菌以及Gymnopilus penetrans真菌物种显著增多，同时Phaeoacremonium和Umbelopsidomycetes成员也有所增加（Lefse LDA >2，图2b和d）。

3.3.2. R. okamurae水提取物（RO）对土壤性质和微生物群落的影响
在最后一次海藻处理后的24小时（S1），RO对土壤生理性质和微生物群落的影响因所研究的克隆而异。在VN40土壤中，RO处理没有显著影响任何地下测量指标，包括土壤因素和微生物alpha多样性（p值 > 0.05；图3）。相比之下，RJ43土壤在RO处理后pH值显著增加（W vs RO：p值 = 0.010；图3b），同时微生物多样性降低（图3c和d）。

3.4. 基于FAPROTAX和FUNGuild的工具对土壤微生物群落功能的预测
从16S rRNA基因衍生的细菌谱型中，使用FAPROTAX（图5）推断出了预测的生态和代谢功能。在RJ43中，RO处理增加了参与光合功能的细菌的相对丰度（图5d）。其余生态功能，包括结构生物聚合物降解、甲烷生成相关过程、甲烷氧化过程和硫化合物代谢，在S1时间点没有受到RO处理的影响。

3.5. 基于FUNGuild工具的功能预测分析
基于FUNGuild工具[50]的分析揭示了克隆特异性效应（图6），RO处理导致RJ43土壤中的病原真菌代谢减少了75%（图6f），表明在该克隆中微生物响应性更强。在VN40中，RO处理也似乎减少了这一特定群体，但减少的幅度不足以被认为是统计学上显著的。对于其余的功能群体，包括共生和腐生类群，RO处理在这个时间点对两个克隆都没有可检测到的影响。颜色代表所施加的处理方式：蓝色代表水，橙色代表波尔多液，绿色代表R. okamurae提取物。（关于此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）为了评估观察到的分类学和功能变化是否与微生物相互作用的变化有关，随后构建了共现网络。S1时间点的共现网络结果显示，RO处理在两个克隆的真菌和细菌群落中都降低了调和测地距离（HD）值。此外，特别是在真菌部分，RO处理增加了局部连通性，这体现在平均聚类系数（avgCC）上，两个克隆的avgCC都高于BB处理（补充表3：VN40：BB = 0.008，RO = 0.029；RJ43：BB = 0.020，RO = 0.046）。RO处理下的介数中心性值也高于BB处理，无论是在细菌还是真菌群落中。有趣的是，介数中心性最高的节点在VN40中属于Elsterales目，在RJ43土壤中属于Mortierella hyalina，以及在RJ43中属于候选门BRC1和Stephanosporaceae科。在最终采样点（SF），当P. viticola感染完全建立时，RO处理植物的土壤与之前用水（W）或波尔多液（BB）处理的土壤相比显示出不同的物理化学特征。观察到土壤pH值显著降低（RJ43中的p值=0.009；VN40中的p值=0.0001），并且氮、磷和钾浓度有增加的趋势，尤其是在VN40中（图7）。尽管有这些土壤变化，但不同处理或克隆之间的根生物量没有显著差异（图7c），表明海藻处理对根系结构的影响有限。

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图7. 盒形图显示了叶面处理对VN40和RJ43克隆在SF时土壤物理化学参数的影响。各面板显示了土壤鲜重与干重比（a）、土壤pH值（b）、根重（c）、氮（d）、磷（e）和钾（f）浓度（mg/kg）。颜色代表所施加的处理方式：W = 水（蓝色），BB = 波尔多液（橙色），RO = R. okamurae提取物（绿色）。箱子代表四分位数范围（Q1-Q3），中线表示中位数，须状部分表示排除异常值后的最小值和最大值。彩色点代表单个观测值，黑色点表示每组的平均值。对于每个克隆，进行了以处理为固定因素的方差分析（Anova）。（关于此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）

功能推断工具显示，RO处理导致SF时硫循环细菌的数量减少（图5j），并且在病原体暴露后共生生物的招募趋势增加（图6a和b）。重要的是，Cladosporium sphaerospermum在两个克隆的RO处理土壤中持续富集，尽管此时两个克隆的土壤组成有显著差异（SF：VN40-RO与RJ43-RO在β多样性指数上的差异：p值≤0.005；补充表2和补充图2）。值得注意的是，C. subhashii在S1时在RJ43-RO中富集，在SF时即使病原体入侵和疾病发生后仍然作为生物标志物存在。

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图8. LEfSe（线性判别分析效应大小）图显示了SF采样点时VN40（左）和RJ43（右）克隆内不同处理之间的细菌（a,b）和真菌（c,d）生物标志物。条形图表示LDA得分值（log 10）。颜色代表所施加的处理方式：蓝色：水，橙色：波尔多液，绿色：R. okamurae提取物。先前的统计分析将ASV相对丰度表汇总到物种水平。当无法进行物种水平鉴定时，使用最接近的更高分类等级进行绘图。通过排名p值最低的组别进行可视化筛选，然后按LDA得分从低到高排序。（关于此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）

有趣的是，微生物网络分析显示，RO处理的RJ43和VN40克隆土壤对P. viticola的应对方式不同，这反映在平均聚类系数（avgCC）和模块性等指标上。在SF时，RO处理的RJ43土壤中，细菌和真菌群落的avgCC平均值最低，而在VN40中最高（补充表3）。同样，RO处理的VN40土壤的模块性高于BB处理，但在RJ43中两个微生物群落的模块性较低（补充表3）。

4. 讨论

本研究关注地下过程，特别是土壤微生物群的动态，通过分析细菌和真菌群落来评估所施加的处理方式（W、BB和RO）如何影响植物健康和土壤微生物环境。此外，该研究还监测了土壤微生物群对P. viticola的响应演变，提供了关于病原体-微生物组-处理相互作用的见解。同时，Cantos-Villar等人[25]研究了相同植物的地上响应，使得数据能够得到全面解释。这些互补的分析共同提供了对海藻处理如何调节土壤微生物平衡和恢复力的综合理解，强调了地下和地上过程之间的相互作用以及葡萄品种基因型的影响。

4.1. 土壤微生物群依赖于克隆，真菌群落显示出特别明显的基因型特异性模式

土壤微生物群在支持植物健康和恢复力方面起着至关重要的作用，影响植物对有益和不利条件的响应[51]。地下微生物组的组成和动态受到植物基因型的强烈影响[52]，因此也受到克隆身份的影响，这反过来决定了植物对生物刺激剂处理（如海藻提取物）以及生物胁迫（如病原体攻击）的响应[53]。在葡萄园中，这种效应更为明显，因为葡萄藤被嫁接在不同的砧木上，引入了来自砧木和接穗的遗传影响，从而塑造了相关的微生物组组成[54,55]。理解这些相互作用对于开发有针对性的、可持续的葡萄保护和生产策略至关重要。

在我们的研究中，任何采样时间点，土壤细菌群落的多样性都高于真菌群落，这与先前的研究结果一致[56,57]。值得注意的是，尽管如此，与细菌群落相比，真菌群落表现出更大的克隆依赖性差异，表明接穗对真菌微生物群的调节更为显著。这些发现与之前在木本多年生植物中的研究结果一致，强调了宿主基因型在塑造植物-土壤真菌微生物群中的作用。例如，Liu等人[58]在苹果树中证明基因型显著影响了真菌内生菌群的组成，而对细菌群落的影响很小或没有影响。在葡萄藤中也观察到了类似的模式。Shi等人[59]虽然关注的是不同的砧木基因型而不是接穗，但也发现真菌群落对遗传变异的响应比细菌种群更敏感。支持这一点的是Marasco等人[55]，他们研究了七种葡萄砧木-接穗组合，发现更高比例的真菌是特定于每种基因型组合的（例如，每种组合中独特的OTUs占土壤真菌群的19.8%，而在细菌群落中仅为4.8%）。

在这个特定的温室实验中，我们在任何处理或病原体接种之前就识别出几个依赖于克隆的富集分类单元。与VN40土壤相关的分类单元似乎与病原体抑制和害虫控制有关，表明建立了与RJ43土壤不同的潜在保护机制。VN40土壤中Sphingomonas的富集特别值得注意，因为这一属已被确定为栖息在葡萄藤内生圈所有区域的七个主要微生物群之一[56]。据报道，它能够保护A. thaliana免受多种叶部病原体的侵害[60]，进一步支持了Sphingomonas可能通过生态位竞争或与植物病原体的拮抗作用来抑制疾病的假设。同样，VN40土壤中Haliangium的增加可能反映了有利于植物健康的合作微生物动态。由于先前的研究表明，在用B. subtilis PTA-271接种后，Haliangium在葡萄藤根际的丰度会增加[57]，这表明它可能参与有益微生物联合体的形成，并具有重塑根际群落结构的潜力。最后，检测到Cordyceps这种已知能寄生昆虫幼虫的昆虫病原真菌属，进一步表明VN40土壤可能有助于生物害虫的调控。这一属的生物控制潜力突显了其在可持续作物保护和生态系统生物多样性维护中的重要性[61]。

相比之下，Cand. Nitrotoga与RJ43土壤的关联更为紧密。这一属具有高代谢能力，包括代谢氮、硫、氢和有机碳[62]。因此，Cand. Nitrotoga在分解复杂有机物和转化土壤养分方面起着关键作用，从而通过增强养分循环促进植物生长。此外，Aquicella和Pseudoeurotium属在用除草剂处理的葡萄藤根际中也很丰富[63]，这表明它们能够承受恶劣环境。Lophiostoma属以及其他真菌被Bai等人[64]认为在树木生长、土壤养分循环和疾病保护中发挥作用。重要的是，属于Lophiostoma sp.的一种内生菌株显示出强大的抗菌活性[65]。有趣的是，用Bacillus subtilis PTA-271（一种已知对葡萄藤病原体具有生物控制效果的菌株[57,66,67]接种土壤后，与根际中Lophiostoma丰度的增加有关，这表明促进了更具防御性的土壤微生物组。因此，上述分类单元的增加丰度表明RJ43土壤具有内在的功能优势，可能与其增强的养分循环、保护功能和提高的环境抗性有关。

总体而言，无论在任何生物刺激或处理之前，根据接穗基因型观察到的不同分类单元的富集表明，克隆水平的遗传差异可以塑造土壤微生物组结构，这可能是通过根系分泌物组成和植物免疫信号的变化实现的。Seitz等人[68]的研究支持了这一点，他们证明了模型物种中根系分泌物谱型的变化会塑造土壤微生物组的组成和功能。Ali和Glick[69]也证明根系分泌物代谢物可以改变作物微生物组，影响植物的生物控制和生长。这些代谢物作为信号，促进特定有益微生物群在植物根部的吸引和定植，直接影响或间接影响植物-微生物相互作用的动态，以满足植物的特定生态需求[70]。特别是在葡萄园中，Vink等人[71]在涉及多个品种×砧木组合的田间试验中显示，根际细菌群落主要按品种聚集，突出了接穗的主导作用。接穗基因型可能有助于选择根系微生物组[72]，通过光合作用产生糖分并将其分配给砧木[73]。由于植物与地下根系和土壤环境之间的持续反馈循环，这种影响可能是长期的。总体而言，两个克隆拥有不同的土壤微生物群，并且在产量、活力和果串紧凑度上存在差异（品种部分 – 克隆选择在https://vitisnavarra.com），这支持了每种克隆类型的完整生物体可能对海藻处理和病原体挑战有不同的响应这一观点（在第4.3节中进一步讨论）。

4.2. 基于铜的叶面处理（BB）在短期内有利于土壤中机会性真菌的增加

波尔多液以铜为主要活性成分，在葡萄栽培中广泛用作杀菌剂。然而，基于铜的产品与生态系统生态平衡的负面影响有关，导致对其农业使用的监管限制[74,75]。此外，基于铜的杀菌剂与葡萄园土壤中微生物功能的损害和微生物群落组成的改变有关[[76], [77], [78]]。事实上，长期或过度使用可能导致微生物多样性减少、群落组成改变以及与养分循环和植物健康相关的土壤微生物功能紊乱[79]。一些研究报告称，关键有益细菌的数量减少，这可能随着时间的推移影响土壤肥力和葡萄藤的恢复力[80]。由于土壤微生物群落在诸如养分循环和有机物分解等关键生态系统过程中发挥着重要作用，因此铜积累带来的任何不利影响都可能损害葡萄栽培土壤的长期肥力和可持续性[81]。Cantos-Villar等人[25]证明，本研究中使用的铜剂量有效减少了P. viticola的发生率和严重程度，与W和RO处理相比，接种病原体后十天内两种克隆的病害水平均有所下降。此外，在本研究中还观察到了BB处理对土壤中细菌和真菌群落的间接影响，这表明基于铜的处理方式可能通过其直接影响叶部病害的方式，进一步影响植物-微生物组-病原体之间的相互作用。VN40土壤中两种Xylodon物种的富集可能表明宿主植物存在根组织压力或腐烂现象，这两种真菌能够分解被子植物和裸子植物中的木质素[82]；同样，Hyphodontia alutaria（一种木材腐朽真菌[83]）在施用铜后也有所增加。在RJ43土壤中，Phaeoacremonium属成员的富集可能表明即使仅作为叶面喷雾使用，基于铜的处理方式也可能对土壤健康产生影响。该属中的几种物种与木质植物的衰退有关，并常与葡萄藤干病害（如Esca病和Petri病[84,85]）相关联。由于本研究中土壤表面被滤纸覆盖，观察到的土壤微生物反应很可能反映了植物转移的效果。

综合这些结果表明，虽然基于铜的处理方式可以抑制叶部病原体，但它们也可能促进具有木材腐朽或致病潜力的次级真菌类群的增殖。这突显了一个潜在的生态权衡：即地上部分的病害控制可能会无意中损害土壤微生物状态和葡萄藤的长期活力。值得注意的是，铜的影响不仅限于潜在问题类群的富集，还影响了土壤网络结构的整体布局，这一点从共现分析中可以看出。较低的真菌avgCC和HD值（分别衡量网络中模块结构的程度[86]和微生物相互作用的强度[87]）表明网络虽然具有较高的全局连通性，但组织结构较为松散。这种模式表明网络由通用型节点主导，功能专业化程度较低，相互作用较为简单。这样的结构可能反映了虽然整体上保持连通性，但在局部组织上较为缺乏稳定性的情况，生态韧性可能因此受到限制。

4.3 叶面RO处理增强了土壤微生物的韧性，RJ43植物的土壤表现出更明显的响应

多项研究表明，基于海藻的叶面处理可以刺激植物的防御反应并提高叶球微生物多样性，从而增强植物的韧性[18,88,89]。根据Zarraonaindia等人的研究[24]，RO的叶面施用可以丰富葡萄叶上的有益真菌群落。然而，该提取物对植物-土壤-微生物连续体的潜在系统效应仍很大程度上尚未被探索，植物宿主（具体品系基因型）如何调节这种反应也尚未明确。RO叶面处理对土壤微生物群落产生了持久且依赖于基因型的影响，这对植物健康和病原体抗性具有潜在意义。有趣的是，在S1时间点，C. subhashii（一种具有对抗植物病原真菌潜力的竞争性和拮抗性土壤酵母[90]）在两种克隆的土壤中均得到富集。相比之下，其他微生物变化则具有克隆特异性，表明对处理的反应依赖于基因型。例如，在VN40土壤中，Pseudomonas和Gematimonadaceae家族的成员得到富集，这可能表明微生物对植物生长和养分吸收有积极作用。Pseudomonas物种已知可以促进葡萄藤的生长和健康，具有促进植物生长、耐受压力以及生物控制和诱导抗性的功能[91,92]，而Gematimonadaceae家族则有助于磷酸盐的溶解[93]，可能改善葡萄藤的磷营养。在RJ43土壤中，C. moewusii的富集可能表明其具有额外的功能益处，因为该属与生物肥料效应相关，能够提高作物产量、保持土壤肥力和稳定性，并有助于减少二氧化碳排放[94]。此外，RO处理增加了与生物控制活动相关的类群的丰度，包括VN40中的T. hamatum[95]和RJ43中的H. fasciculare[96]。后者是一种腐生菌，能够拮抗全球葡萄园中主要的根系病原体Armillaria spp.[96,97]，这表明RO可能在促进土壤介导的植物保护方面发挥作用。与此一致的是，这些微生物变化伴随着特定生态功能的提升。例如，参与光合过程的细菌在RO处理后得到富集，这可能通过促进生物结皮形成、增加肥力和支持有益微生物群落来改善土壤健康[99,100]。此外，RJ43中病原菌群的减少与先前报道的地上生理效应一致，因为Cantos-Villar等人[25]观察到RO处理的RJ43植物表现出与植物免疫相关的防御基因和抗氧化酶的表达增加。这表明植物的健康状态与土壤健康密切相关，两者像相互沟通的管道一样运作。

真菌网络分析显示，RO处理导致平均聚类系数增加、调和测地距离减小以及介数中心性最高。这种模式表明微生物网络更加模块化、高效且集中，可能促进生态位专业化、优化内部信号传递，并存在协调群落反应的枢纽节点。有趣的是，这里发现的几个枢纽物种具有明确的功能作用，可以将网络组织与潜在的植物益处联系起来。例如，VN40中的关键枢纽物种M. hyalina是一种根际定殖真菌，可以促进地上生长并激活拟南芥（A. thaliana）的钙依赖性防御机制，限制病原体Alternaria brassicae的发展[101]，同时还能在氮饥饿条件下调节氨基酸平衡[102]。同样，Stephanosporaceae家族的成员在RJ43中起到桥梁节点的作用，该家族参与有机物分解[103]，可能有助于养分循环和资源利用，加强微生物网络中的合作互动。作为中心连接器，这些枢纽物种可能促进有益功能（如病原体抑制、养分转化和抗逆性）在土壤微生物群落中的整合。随着病害的发展（SF），RO处理的土壤表现出向共生型类群转变的趋势，可能增强了养分吸收和植物韧性。事实上，尽管两种克隆对病原体入侵的反应不同（导致土壤微生物群落差异显著），但两种克隆的土壤中都出现了C. sphaerospermum这一与植物生长促进和土壤健康相关的真菌类群[104,105]。此外，C. subhashii在RJ43中作为RO的生物标志物，在S1和SF阶段均得到富集，表明其在这种条件下的持续性和竞争优势，可能有助于地下生态系统的健康，因为这种土壤酵母已被报道具有生物控制活性[90]。这些发现表明，RO处理可能对塑造具有韧性的微生物群落和促进有益的植物-微生物相互作用具有持久影响，即使在病原体压力下也是如此。

上述微生物变化伴随着土壤群落的结构和功能变化。VN40土壤形成了更加聚集和模块化的微生物网络，表明更高的凝聚力和功能稳定性以及高效的养分交换，而RJ43土壤则主要由防御性类群主导，多样性较低且相互作用减少，这可能反映了由病原体驱动的急性反应。重要的是，这些地下变化与地上植物的反应密切相关。Cantos-Villar等人[25]报告称，RO处理的RJ43植物表现出P. viticola的发生率和严重程度降低了20-25%，而在VN40中效果不那么明显。这表明土壤微生物组成与植物免疫力之间存在紧密联系，表明地上和地下过程紧密相关，RO诱导的微生物枢纽和功能变化可能有助于病害抑制、养分循环和整体植物韧性。

5. 结论

本研究揭示了波尔多液和海藻提取物R. okamurae的叶面施用可以引发超出叶球范围的微生物变化，有助于理解土壤微生物生态学以及地上和地下生态系统之间的复杂联系。虽然基于铜的处理方式可以有效抑制叶部病害（如使用相同实验设计的补充研究[25]所示），但本研究的结果表明，它也可能导致土壤中机会性和木材腐朽真菌类群的富集，可能对长期地下微生物平衡产生影响。相比之下，RO处理促进了土壤真菌群落的有益变化，包括C. subhashii和C. sphaerospermum的富集，同时减少了病原菌群。此外，它还增强了微生物连通性，表明R. okamurae有助于形成更加合作和有韧性的土壤微生物组。这种增强的连通性有可能强化土壤功能、支持病害抑制、改善养分循环，并最终提高植物的整体韧性。

关于土壤微生物群落的敏感性，细菌的反应相对较弱，这突显了真菌作为系统处理效应更敏感指标的重要性。值得注意的是，RJ43土壤对海藻处理的微生物反应比VN40更为明显，显示出明显的克隆依赖性。即使在处理之前，两种克隆之间的土壤真菌群落也存在基线差异，这强调了接穗遗传结构在塑造地下微生物群落及其对生物刺激剂和病原体压力响应方面的影响。尽管这些发现突显了叶面生物刺激剂在促进土壤健康和微生物介导的病害韧性方面的潜力，但研究的实验条件（即使用富含养分的培养基和封闭盆栽系统）可能放大了观察到的效果。因此，需要在田间条件下进行进一步验证。此外，还需要深入研究根系分泌物的组成，以阐明地上处理与地下微生物变化之间的机制联系。

**作者贡献声明**

Asier Cámara：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、数据管理。
Emma Cantos-Villar：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目协调。
Ana Díez-Navajas：方法学设计、实验实施、概念构建。
Amaia Mena-Petite A：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验实施、概念构建。
Maite Lacuesta：方法学设计、实验实施、概念构建。
Usue Pérez-López：方法学设计、实验实施、概念构建。
Mikel Iriondo：资源获取、资金申请。
Iratxe Zarraonaindia：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目协调、方法学设计、实验实施、概念构建。

**资助与致谢**

本研究得到了SEAWINES项目（PID2020-112644RR-C21和-C22）的支持，该项目由MCIN/AEI/10.13039/501100011033资助；得到了巴斯克政府（GRUPO IT1571-22和IT1682-22项目）以及SEA4GREEN项目（PID2024-1552060R-C31-C32-C33）的支持。Asier Cámara感谢巴斯克政府资助的Ikertalent 2022博士前计划的支持。作者们还感谢巴斯克大学SGiker通用研究服务提供的实验室分析支持。同时，我们也非常感谢Nicholas Bokulich对本文的宝贵意见。