《Food Bioscience》：Revealing the interaction between the internal microbiota of Daqu pests and Daqu microbes based on metagenomics technology
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Daqu传统固态发酵制剂因开放环境易受环境因素影响，其微生物群落易受害虫（如Tribolium castaneum）干扰。本研究通过季节性（春、夏、秋）Daqu样本的代谢组测序，发现环境温度和湿度是塑造Daqu微生物群落结构的主因，而QC内部菌群（含Lactococcus garvieae、Klebsiella pneumoniae等）对Daqu菌群影响极小，仅13种夏季Daqu微生物与QC内源菌群存在低丰度重叠。研究证实Daqu环境对QC菌群具有反向塑造作用，为传统发酵工艺优化提供新视角。
周尧|张春雪|张翱|张梦佳|刘江帆|张瑞泽|郎芳芳|宋佳|郑宇|王敏
中国天津科技大学生物工程学院生物基纤维材料国家重点实验室，天津300457
摘要
“大曲”是一种通过固态发酵生产的传统发酵剂，其开放的环境使其微生物群落极易受到环境因素的影响。虽然“大曲”经常受到如Tribolium castaneum等害虫的侵扰，但这些害虫内部微生物群对“大曲”微生物群落的具体影响仍不清楚。本研究的目的是阐明它们之间的相互作用。为此，我们应用宏基因组技术分析了春季、夏季和秋季生产的“大曲”的微生物组。结果表明，春季生产的“大曲”质量优于夏季和秋季生产的“大曲”。相关性分析显示，害虫（QC）内部微生物群对“大曲”微生物群落结构的影响显著小于温度和湿度的影响，因此环境温度和湿度是塑造“大曲”微生物群落结构的主要因素。宏基因组分析鉴定出害虫体内的核心微生物，包括Lactococcus garvieae、Klebsiella pneumoniae等细菌，以及Erysiphe pulchra和Fusarium avenaceum等真菌。共现网络和Upset分析表明，夏季“大曲”中仅有13种微生物可能来自害虫，且其丰度极低。害虫与夏季“大曲”共有的微生物种类占害虫内部微生物总数的半数以上。这些发现表明，害虫微生物群对“大曲”发酵的影响微乎其微，而“大曲”所处的环境对害虫微生物群的影响更为显著。总之，本研究强调了环境控制在“大曲”生产中的重要性，为优化发酵条件提供了关键见解。
引言
“大曲”是酿造中国白酒和谷物醋不可或缺的重要发酵剂，在糖化和酒精发酵过程中起着重要作用（He等人，2022年）。“大曲”主要由大麦、小麦或豌豆通过自发固态发酵制成。在发酵过程中，未灭菌的原材料暴露在环境中，因此“大曲”中含有多种多样的微生物（Huang等人，2017年）。“大曲”中的微生物主要包括乳酸菌、酵母和霉菌。这些微生物不仅能分泌多种酶，还能产生许多风味物质（Du等人，2019年）。
由于谷物的丰富，害虫常常在“大曲”发酵过程中出现，包括Tribolium castaneum、Stegobium paniceum、Araecerus fasciculatus和Cryptolestes turcicus等种类（Meng等人，2014年）。害虫对“大曲”的危害主要体现在三个方面：首先，害虫会啃食“大曲”，导致材料损失；储存时间越长，损失越严重（Zhou等人，2019年）；其次，害虫在“大曲”中的大量存在会破坏其微生物群落结构；第三，它们的排泄物和尸体会污染产品。夏季是害虫爆发的高峰期，其大量繁殖会影响工厂周围人群的生活（Huang等人，2024年；Liao等人，2018年）。害虫主要有三个来源：（1）通过谷物原料带入的虫卵；（2）在制作“大曲”过程中通过工具或人员传播；（3）在储存成品“大曲”时受到外部害虫的侵入或内部害虫的感染，导致害虫在整个发酵车间和仓库中扩散（Du & Liang，2024年；Huang等人，2024年）。Liu（Liu等人，2020年）基于培养方法分析了小麦（原料）的微生物群，发现从小麦中分离出的菌株与从“大曲”中分离出的菌株相同。此外，“大曲”中的真菌群主要来源于制作“大曲”的环境（主要是工具和室内地面）（Du等人，2019年）。
众所周知，区域性的微生物种群是动物微生物群的主要来源（Bright & Bulgheresi，2010年）。新的证据表明，害虫可能与发酵生态系统有超出物理损害的相互作用。它们的幼虫具有酶分泌能力，其肠道微生物群（可能与环境微生物不同）可能作为微生物载体，间接影响“大曲”的微生物动态。这种双重生态角色（既是害虫又是潜在的中介）凸显了重新评估它们对传统发酵系统影响的必要性。类似的微生物组成模式可能源于共同的饮食或环境暴露。某些动物宿主体内的微生物分类群可以追溯到它们的食物来源或栖息地。例如，食草甲虫的肠道微生物群通常反映了从食物中摄入的微生物（Hannula等人，2019年；Hosokawa等人，2016年）。社会性昆虫如蜜蜂的肠道微生物组也是通过在花丛中觅食而形成的（McFrederick等人，2012年）。饮食也被证明能够快速且可重复地重塑不同昆虫分类群的肠道微生物组（Santos-Garcia等人，2020年）。值得注意的是，一些物种（如叶食性毛虫）没有固定的肠道微生物，而是从土壤中获取微生物组（Hannula等人，2019年）。
鉴于害虫作为微生物载体和破坏群落稳定性的双重作用，阐明害虫与微生物之间的相互作用对于深入理解传统发酵过程至关重要。尽管取得了进展，但害虫在调节微生物动态方面的生态作用仍知之甚少。
为了阐明害虫内部微生物群与“大曲”发酵微生物组之间的相互作用及其生态联系，本研究采用宏基因组测序技术全面分析了这两种微生物群落。具体来说，以无害虫的春季和秋季“大曲”样本作为对照，我们分析了春季、夏季和秋季“大曲”中微生物组成的季节性变化，进一步确定它们与害虫侵扰的相关性。Venn图量化了害虫微生物群与发酵微生物群之间的物种重叠情况。这些结果将有助于深入理解传统发酵系统中的微生物组演替，并为开发针对害虫-微生物的生物控制策略提供新的框架。
样本采集
样本采集
我们从山西紫林醋业有限公司获得了不同季节的“大曲”样本（春季、夏季和秋季批次；冬季不生产“大曲”），采集日期分别为2023年3月、6月和10月。样本来自发酵室内的三个关键位置：中央区域、靠近窗户的位置和墙角，并在7个不同时间点（1-2天、2-4天、4-7天、7-11天、11-19天、19-23天和23-30天）进行采集，分别命名为WQ、SM、LM、CH、DH、HH等。
季节对“大曲”理化性质的影响
测定了发酵阶段“大曲”的理化性质，包括水分含量、酸度、糖化能力、发酵能力、酯化能力和液化能力（图1）。在整个发酵过程中，“大曲”的理化性质发生了显著变化。如图1B所示，三个季节的“大曲”水分含量随发酵时间的延长而降低。除了春季“大曲”外，其他季节的“大曲”水分含量均有所下降。
结论
本研究表明，“大曲”的微生物群落结构和理化性质受到季节变化的显著影响，春季生产的“大曲”具有更好的发酵性能。主要发生在夏季的害虫携带了以Lactococcus、Wolbachia和Enterobacter为主的独特内部微生物群，这些微生物群在很大程度上受到它们从“大曲”中获取的营养物质的影响。尽管害虫与“大曲”之间共享的微生物种类有限，但它们的存在仍对“大曲”的微生物群落产生了影响。
作者贡献声明
张瑞泽：调查、数据整理、可视化。
郎芳芳：资源获取、数据分析、软件使用。
宋佳：数据分析、可视化。
郑宇：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法论制定、资金申请、资源协调。
王敏：撰写——审稿与编辑、监督、方法论制定、概念构思。
周尧：撰写——初稿撰写、可视化、调查、数据分析。
张春雪：数据整理、数据分析、软件使用。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32472321）、国家重点研发计划（2025YFF1107305）、山西省创新研究团队、山西省重点研发项目（202402130501001）以及太原市关键技术研究项目（2024TYJB0146）的支持。
