具有不同物理化学性质和微生物特性的家禽粪便，与兽用抗菌药物的降解程度存在显著差异

《Journal of Agriculture and Food Research》：Poultry litters with diverse physicochemical and microbial characteristics are associated with significant variation in the degradation of veterinary antimicrobials

　　贝丝·亚当斯 | 克里斯·辛克莱 | 爱德华·海恩斯 | 保罗·凯 | 菲利普·鲁尼 | 维多利亚·普拉特 | 劳拉·卡特
利兹大学地理学院，利兹，LS2 9JT，英国

**摘要**
通过环境风险评估来评估兽用抗菌剂对环境的影响，该评估包括模拟这些化合物在粪便中的降解过程，以更精确地估计环境暴露量。然而，关于粪便降解的指导仅适用于液态粪便，且现行法规要求在这些研究中使用每种动物类型对应的一种粪便来源。家禽垫料的含水量显著较低，相关研究相对较少，对其物理化学性质和微生物特性的变化对抗菌剂降解的影响了解不足。目前关于所需垫料样本数量的指导可能无法准确反映抗菌剂降解的固有变异性，从而无法全面评估这些化合物带来的环境风险。本研究通过一系列实验探讨了来自不同生产策略的农场家禽垫料对五种抗菌剂（莫能菌素、盐霉素、磺胺嘧啶、噻咪啉和三甲氧嘧啶）降解的影响。不同农场的垫料在物理化学性质（p < 0.05）和微生物多样性（p < 0.05）方面存在显著差异。所有测试的抗菌剂的降解速率在各个农场间也存在显著差异（p < 0.05），尤其是盐霉素的DT50值（化合物浓度减半所需时间）从0.6天到超过10,000天不等。这些结果表明，需要进一步研究以了解粪便的具体化学和生物学特性对降解过程的影响。研究发现，为了获得可靠且现实的环境风险评估，需要使用具有不同特性的多种垫料样本。

**1. 引言**
抗菌剂，包括兽药（VMPs）和饲料添加剂（FAs），在禽业中被广泛用于预防和治疗疾病。由于集约化养殖导致的高饲养密度，兽用抗生素和抗球虫药成为最重要的兽药产品，因为这增加了动物间疾病传播的风险。使用后，抗菌剂会随动物粪便排出，并在不同粪便中以0.0002至91毫克/千克干物质含量的浓度被检测到[1][2]。尽管人们对抗菌素耐药性（AMR）的担忧日益增加，许多国家也实施了限制其使用的法规，但预计到2030年，食品生产动物中抗菌剂的全球消耗量将达到200,325吨[3]。高达90%的抗菌剂会被排出体外，并通过将粪便作为肥料施用于土地而分散到环境中[4]。这种污染通过食物和水源对人类健康构成威胁。此外，抗菌剂残留物在植物中的吸收会干扰光合作用等重要生理过程，可能导致作物产量下降，进而影响经济效益[5]。环境中抗菌剂残留物的存在还会对微生物群落产生选择压力，促进抗菌素耐药性的发展和传播[6]。
兽药或饲料添加剂在上市前必须经过环境风险评估（ERA）。欧盟（EU）的兽药ERA分为两个阶段[7]：第一阶段基于兽药的预期用途评估潜在的环境暴露情况，并确定哪些兽药需要更全面的风险评估（采用第二阶段指导）。第二阶段评估分为A级和B级。A级要求提供一组强制性实证数据，基于暴露情况和相关环境中的影响来评估风险；如果A级评估认为风险不可接受，则进入B级进行风险细化。对于集约化饲养的陆地牲畜，A级评估还包括土壤中的环境归趋性和陆地效应研究。评估需计算土壤中的预测环境浓度（PECsoil），假设所有施用的产品都会被排出体外。如有必要，可以利用农场储存期间粪便降解的信息来细化预计到达土壤环境的浓度（PECsoil）。因此，粪便的降解程度是决定兽药是否通过ERA的重要因素。目前，ERA要求每种动物类别仅使用一种粪便类型进行降解研究[8]。欧盟内的饲料添加剂ERA流程类似，也采用总残留量方法，随后可以利用粪便降解信息来细化PECsoil[9]。
在禽业中，由于垫料类型、喂养制度和粪便管理方式的不同，家禽垫料的成分可能存在很大差异[10]。常见的垫料类型包括木屑和稻草，这导致垫料的物理化学性质（如水分含量、pH值、有机碳和金属含量）各不相同。关于家禽垫料变异性的研究有限，尚不清楚这种变异性是否会影响抗菌剂和饲料添加剂的降解速率。先前的研究表明，猪粪pH值的变化会显著影响抗菌剂的降解速率[11]，但作为具有复杂变异性的关键基质，家禽垫料的研究仍严重不足。缺乏此类数据可能导致当前的风险评估低估或高估这些物质在环境中的持久性。
所选化合物莫能菌素、盐霉素、磺胺嘧啶、噻咪啉和三甲氧嘧啶代表了禽业中常用的多种抗生素类别。值得注意的是，将离子载体抗生素（莫能菌素和盐霉素）纳入研究，尽管它们被归类为饲料添加剂而非治疗性抗生素，但有助于探讨这些在不同监管下使用的物质对禽类健康管理的实际影响，尤其是预防球虫病方面。这种寄生虫病对禽类福利和农场盈利能力构成重大威胁，因此必须预防性使用离子载体抗生素。相反，治疗性抗生素如磺胺嘧啶（常与三甲氧嘧啶联合使用）和噻咪啉用于治疗细菌感染（包括大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌引起的感染以及支原体相关疾病）。2023年，强效磺胺类药物（如磺胺嘧啶-三甲氧嘧啶组合）占肉鸡抗生素使用的7%[12]，凸显了其重要性。因此，本研究旨在通过将不同生产和管理方式导致的垫料变异性与抗菌剂和饲料添加剂的降解联系起来，为风险评估提供关键数据，支持更可持续的禽业废弃物管理实践。

**2. 材料与方法**
2.1. 化合物和样品制备
分析级抗生素（包括盐霉素钠、噻咪啉富马酸氢盐和三甲氧嘧啶）购自VWR（美国）；莫能菌素钠购自Fisher Scientific（美国）；磺胺嘧啶钠购自Sigma-Aldrich（美国）。所选化合物的物理性质总结见附录A中的表S1。所有化合物的剂量设定为0.2毫克/千克，因为该剂量低于粪便中预测最高环境浓度（PECmanure）的10%，并在初步降解研究中进行了验证（数据未显示），以确保在选定浓度下能够检测到这些抗生素。这些值在文献报道的环境浓度范围内[1][2]。预测环境浓度是根据EMA和EFSA指南中的公式计算得出的[13]。

2.2. 家禽垫料采样、处理和特性
从英国的三个农场收集了共45千克家禽垫料（每个农场15千克）。垫料来自每个农场的一个鸡舍，未重复使用之前任何鸡群的垫料，采集前也未进行任何处理。这三个农场分别标记为A、B和C，采集时鸡的年龄分别为49周、23天和12天。农场A饲养肉种鸡，农场B和C饲养肉鸡，所有鸡均为Ross 308品种。选择不同的生产类型和鸡龄以确保收集的垫料类型具有足够的变异性，以便进行对比分析。采集前未给鸡使用任何研究化合物，采集后的垫料在室温下有氧条件下储存不超过四周，符合规定要求。垫料使用Kenwood食品加工机在室温下均质化5分钟，然后称重并放入测试容器中。通过重量法测定水分含量，并根据需要用电阻率为18.2 MΩ-cm的水（ELGA LabWater，英国）进行调整，以保持40 ± 5%的干物质含量。使用vario MICRO cube（Elementar，英国）测定垫料的总碳、有机碳和氮含量；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）用于测定可提取金属。使用Ensure? Touch Luminometer（Hygeina?，美国）测定垫料的微生物活性，手持式pH计（Oxitop?，英国）测定pH值。每个生物重复样本测量三次，得到三个技术重复样本。

2.3. 降解动力学
2.3.1. 实验设计
首先将测试化合物完全溶解在甲醇中，制备成1毫克/毫升的浓度作为储备溶液；然后用水稀释该储备溶液，以减少溶剂对垫料中微生物群落的影响。选择10个时间点（0天、2天、4天、6天、13天、24天、35天、49天、63天、90天和120天）来测定降解动力学。这些时间点的选择是因为研究了多种抗菌剂和饲料添加剂，收集了DT50前后的浓度数据，以确保动力学建模的准确性，最长不超过120天的时间限制。准备了五个重复处理组、两个质量控制组和一个空白样本。质量控制组用于验证整个研究过程中的提取效率。空白垫料样本中加入1毫升水。每个测试容器中加入50克（干重）垫料，并加入1毫升处理溶液，使其浓度为0.2毫克/千克。用铲子混合以确保均匀性。在孵育过程中，容器在20 ± 2°C的黑暗环境中保持，干物质含量为40 ± 5%（d/w），符合粪便降解研究的法规要求。使用Tinytag数据记录仪（Gemini Dataloggers，英国）监测储存环境的温度。

2.3.2. 化学提取与分析
按照法规建议，在21天的预孵育期后，向每个样本中加入100毫升乙腈（50克/100毫升），手动摇晃5秒后放入涡旋混合器中混合1分钟。然后将样本放入20°C的超声浴中处理10分钟，再在300转/分钟的轨道振荡器中振荡45分钟，最后在4°C下以3,724 RCF离心20分钟。上清液移除后转移到2毫升Eppendorf?管中，并在室温下以20,000 RCF离心5分钟。样品随后转移到琥珀色2毫升高效液相色谱（HPLC）小瓶中，并在-20°C下冷冻后进行分析。提取和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法按照SANTE/2020/12830 rev.2 [14]和VICH GL2指南[15]进行验证，包括线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率和选择性评估（详见补充信息中的附录E）。 LOD（检测限）范围从蒂阿霉素的0.0183 ng/mL-1到磺胺二甲嘧啶的3.86 ng/mL-1，LOQ（定量限）范围从蒂阿霉素的0.0554 ng/mL-1到磺胺二甲嘧啶的12.9 ng/mL-1。为了补偿基质效应，准备了与基质匹配的校准标准品，这些标准品是在提取空白禽类垫料样本后制备的。为了定量分析，生成了一个在1 ng/mL-1到150 ng/mL-1范围内的八点线性校准曲线。使用Triple Quad 5500+ LC-MS/MS（SCIEX，美国）的正向和反向模式对测试化合物进行了检测和定量。两种方法都使用了ACQUITY UPLC HSS T3柱子（100 ?，1.8 μm，2.1 x 100 mm），柱温保持在40°C，进样体积为1 μL。数据处理和定量分析使用Analyst 1.6软件（SCIEX，美国）完成。正向模式用于检测和定量磺胺二甲嘧啶、蒂阿霉素和三甲氧嘧啶，梯度洗脱的流速为0.3 mL/min。正向模式的流动相为（A）0.1%甲酸水溶液和（B）0.1%甲酸乙腈溶液。负向模式用于检测和定量莫能菌素和盐霉素。负向模式的流动相由（A）0.1%甲酸水溶液和（B）0.1%甲酸乙腈和甲醇（50:50 v/v）组成。有关所用梯度的更多信息，请参阅补充材料（附录B）。

每种测试化合物的动力学曲线是使用计算机辅助动力学评估（CAKE v3.7）建模软件得出的。针对每种化合物和每种垫料类型，独立选择了最佳拟合的动力学模型。统计分析使用R和RStudio软件进行。使用Kruskal-Wallis检验对三种垫料类型进行了统计比较，并应用了Bonferroni-Holm校正。统计分析使用了五个重复样本，结果以95%置信区间报告（p < 0.05）。

2.4. 代谢条形码分析
从农场收集的垫料在室温下使用Kenwood食品加工机处理并混合五分钟。在实验的三个时间点（第0天、第61天和第120天）从每个农场（A、B和C）采集一个样本进行代谢条形码分析，并在提取脱氧核糖核酸（DNA）之前将其储存在-20 ± 2°C。DNA提取使用QIAmp DNA Power Soil Kit（Qiagen，德国）按照制造商提供的协议进行，每个时间点和农场有三个生物学重复样本。简要来说，将缓冲液加入含有250毫克预先混合的禽类垫料的无菌容器中，然后用涡旋器以最大速度搅拌10分钟。随后进行离心和硅胶膜旋转柱纯化。提取的DNA储存在-20°C，直到进行测序分析。来自农场A、B和C的九个禽类垫料样本用于16S核糖体RNA（rRNA）和内部转录间隔区（ITS）基因的微生物群落分析。使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶（New England Biolabs，美国）进行聚合酶链反应（PCR）扩增，以扩增细菌的16s rRNA V4区域和真菌的ITS1区域。有关所用引物的更多信息，请参阅补充材料（附录C）。16S样本的循环条件如下：初始变性98°C 2分钟，然后是22个循环，每个循环温度降低0.5°C，从65°C降至54°C 45秒，72°C 60秒，98°C 20秒，接着是8个循环54°C 45秒，72°C 60秒，最后扩展72°C 10分钟。ITS的循环条件为：98°C 2分钟，98°C 20秒，然后是25个循环54°C 30秒，72°C 90秒，最后扩展72°C 5分钟。PCR样本的质量通过凝胶电泳确认。扩增子使用AMPure XP磁珠（Beckman Coulter，美国）进行纯化，并在第二个PCR步骤中进行索引。最终文库使用Qubit 4荧光计（Invitrogen，美国）进行定量，并使用Agilent TapeStation系统（Agilent，美国）评估片段大小和质量。文库被标准化、等摩尔混合后，使用Illumina MiSeq平台（Illumina，美国）和V3 MiSeq试剂盒（Illumina，美国）进行测序，以获得2 x 300 bp的双端读取。使用阳性对照来确认PCR和测序方法的有效性。人工阳性对照包含所有主要PCR引物的结合位点。使用分子级生物纯净水作为阴性对照，以评估PCR和索引阶段的试剂污染情况，确保没有污染。在整个过程中采集的提取缓冲液空白样本用于确认提取过程没有引入样本污染。本研究方法的另一个局限性是，所使用的阴性对照没有考虑上游阶段（如垫料收集、处理和混合过程中）可能引入的微生物类群。控制数据在补充信息的附录F中呈现。由于读数非常低，阴性对照和提取空白样本在质量控制过程中被剔除。另一个局限性是没有使用模拟微生物群落对照。作者承认DNA提取方法会对代谢条形码结果产生显著影响，这是该方法固有的几个偏差来源之一。

16S rRNA和ITS的结果分别进行分析。原始读取数据使用QIIME2软件包（版本2024.5）处理，并可在SRA数据库[16]上获取。质量控制和去噪使用Divisive Denoising Algorithm 2（DADA2）进行，该方法基于模型从读取数据中推断出真实的生物序列并去除嵌合体和低质量序列。随后进行了读取的去重复和扩增子序列变体（ASVs）的推断。使用预训练的朴素贝叶斯分类器对99% SILVA v.128数据库的V3-V4区域进行代表性序列的分类[17]、[18]、[19]。ITS分类器使用了NCBI RefSeq Target Loci ITS数据库序列以及Unite数据库中的Oomycete序列[20]、[21]、[22]。使用Multiple Alignment Fast Fourier Transform（MAFFT）程序对ASVs进行了多序列比对。然后将比对后的ASVs放入FastTree构建的系统发育树中。样本被稀释到在任何给定样本中观察到的最小序列深度。估计了alpha多样性（观察到的ASVs、Faith’s Phylogenetic Diversity、Shannon’s Diversity Index和Pielou’s evenness）和beta多样性（Bray-Curtis距离、Jaccard距离、unweighted UniFrac距离和weighted UniFrac距离）的指标。

进行了微生物组组成分析（ANCOM）测试，以确定不同农场之间任何类群的相对丰度是否存在显著差异。使用QIIME2进行alpha和beta多样性指标的统计分析。使用Kruskal-Wallis检验确定所有组之间的alpha多样性是否存在显著差异以及农场之间的成对比较。使用两个重复样本（n = 2）进行统计分析，统计显著性以95%置信区间报告（p < 0.05）。

2.5. 抗微生物敏感性测试
为每个农场（A、B和C）在三个时间点（第0天、第61天和第120天）准备了每个处理过的重复样本和一个空白样本进行抗微生物敏感性测试。在每个时间点，从每个空白样本中取10克样品，从每个处理过的重复样本中取两个10克样品。每个样品加入一个无菌通用管中，加入90毫升最大回收稀释液（Thermo Fisher Scientific，美国），然后涡旋混合。制备适当的稀释液，从每个稀释液中取0.1毫升接种到Slanetz和Bartley琼脂平板（Thermo Fisher Scientific，美国）上，并在37 ± 1.7°C下有氧培养48小时。从每个稀释液中取0.1毫升接种到改良的Charcoal Cefoperozone Deoxycholate琼脂平板（mCCDA）（Thermo Fisher Scientific，美国）上，并在含有微需氧包的玻璃罐中在41.5 ± 0.9°C下培养48小时。从每个稀释液中取0.1毫升接种到Tryptone Bile X-glucuronide（TBX）琼脂平板（Thermo Fisher Scientific，美国）上，并在37 ± 1.7°C下培养4小时，然后转移到设定在43.5 ± 0.9°C的培养箱中，总培养时间为44小时。根据每种选择性琼脂平板的标准操作程序选择培养时间和温度。培养后，鉴定并计数Enterococcus spp.（Slanetz和Bartley琼脂上呈粉红色）、Campylobacter spp.（mCCDA琼脂上呈灰色）和E. coli（TBX琼脂上呈蓝色）的菌落。由于没有可用的Enterococcus spp.测试化合物的折点，因此无法确定菌株是临床耐药还是敏感，因此报告了菌落直径以指示菌株之间的耐药性差异[23]、[24]。

3. 结果
3.1. 禽类垫料特性
禽类垫料的物理化学特性表现出高度变异性（表1），不同农场之间存在显著差异。农场A和农场B在pH值、总氮、总碳、总有机碳、砷浓度和锌浓度方面存在显著差异（p < 0.05）。农场A和农场C在总氮含量、总碳、总有机碳、锌、铜和砷浓度方面也存在显著差异。相比之下，农场B和农场C在铜和锌浓度以及总氮含量方面存在显著差异。

表1. 不同农场禽类垫料样本的物理化学特性总结
| 物理化学特性 | 农场A | 农场B | 农场C |
| --- | --- | --- | --- |
| 生产类型 | 肉鸡 | 肉鸡 | 肉鸡 |
| 床垫材料 | 木屑 | 木屑和稻草混合物 | n/a |
| pH值 | 8.86 | 9.16 | 9.25 |
| 微生物活性（lux） | 150 | 31 | 104 | 85 |
| 总氮（%） | 2.75 | 3.31 | 2.24 | 3.05 x 10-7 *** |
| 总碳（%） | 35 | 41 | 1.54 | 2.80 | 0.000 |
| 总有机碳（%） | 31.63 | 38.6 | 38.4 | 1.4 x 10-5 *** |
| 铜浓度（mg/kg） | 87.2 | 92.4 | 51 | 1.80 | 0.000 |
| 锌浓度（mg/kg） | 41 | 24 | 37 | 25 | 40.000 |
| 砷浓度（mg/kg） | 0.31 | 90 | 20 | 17 | 80.000 |
| 统计差异以*p < 0.05、**p < 0.01和*** p < 0.001表示 |

3.2. 降解动力学
除了蒂阿霉素从第6天开始才显著不同外，每个时间点和农场中每种化合物的浓度都存在显著差异。这反映在本研究中计算的不同的降解速率上，特别是对于盐霉素和三甲氧嘧啶（表2）。在本研究中，降解定义为可提取母体残留物随时间的减少，并以DT50表示，即浓度减半所需的时间。尽管未确定降解途径，但假设它们是吸附到垫料基质中、降解为代谢物或矿化。

表2. 每个农场每种兽用抗生素和饲料添加剂的DT50值
| 化合物 | DT50（天） |
| --- | --- |
| 莫能菌素 | 20.8 | 18.4 | 7.4 |
| 盐霉素 | >1000 | 09.8 | 40.6 |
| 磺胺二甲嘧啶 | 0.67 | 62.0 | 11.4 |
| 蒂阿霉素 | 53.1 | 27.1 | 18.7 |
| 三甲氧嘧啶 | 104 | 101 | 37.2 |
| 统计比较使用Kruskal-Wallis检验进行，对于每个化合物和时间点。如果超过一半的时间点显示统计显著差异，则进行Dunn检验。 |

盐霉素的降解在不同农场之间差异显著，六个时间点的浓度都有显著差异：第2天（p = 0.0246）、第4天（p = 0.0374）、第6天（p = 0.0193）、第24天（p = 0.0193）、第35天（p = 0.0306）、第120天（p = 0.0193）（图1a），并且农场A的降解速度明显慢于农场B和农场C的样本。观察到三甲氧嘧啶的浓度在五个时间点存在显著差异：第2天（p = 0.0336）、第4天（p = 0.0492）、第24天（p = 0.0270）、第63天（p = 0.0336）和第120天（p = 0.0212）。然而，与盐霉素不同，三甲氧嘧啶在农场A和农场B的降解速度比农场C慢得多（图1c）。相比之下，磺胺嘧啶、噻吗啉和莫能菌素的降解速率变化较小，每个农场的DT50值在14天内相差不大。下载：下载高分辨率图片（480KB）下载：下载全尺寸图片

图1. 从农场A（绿色圆圈）、B（橙色三角形）和C（紫色方块）收集的家禽垫料样本中五种兽药和饲料添加剂（盐霉素（A）、莫能菌素（B）、三甲氧嘧啶（C）、噻吗啉（D）和磺胺嘧啶（E）的平均浓度（n=5）随时间的变化趋势。浓度（mg kg-1干重）在120天的研究期间进行了绘制。数据展示了化合物特定的降解曲线和农场间的差异。

从粪便降解研究中确定的DT50值对于计算VMPs和FA的PECsoil至关重要。为了了解不同降解速率对PECsoil的影响，本研究中的DT50值被纳入了计算。结果显示，当考虑来自不同农场的垫料时，PECsoil的值存在显著差异（图2）。磺胺嘧啶的PECsoil值从农场A的1.15 × 10-6 μg kg-1到农场A的1060 μg kg-1不等。使用农场C样本中的磺胺嘧啶DT50值计算得出的PECsoil值比农场A降低了99.9%。相比之下，将农场A与农场C的PECsoil值进行比较时，仅降低了20%。下载：下载高分辨率图片（237KB）下载：下载全尺寸图片

图2. 使用从农场A（绿色）、B（橙色）和C（紫色）收集的家禽垫料样本的DT50值计算的五种兽药和饲料添加剂（盐霉素（A）、莫能菌素（B）、三甲氧嘧啶（C）、噻吗啉（D）和磺胺嘧啶（E）的PECsoil初始值和PECsoil精炼值。条形图表示预测的土壤浓度（μg kg-1（干重），突出了不同地点和化合物之间的模型值与观测值之间的差异。由于农场C的PECsoil精炼值远低于初始值且接近零，因此磺胺嘧啶（A）和磺胺嘧啶（E）的条形图显示较少。

3.3. 元条形码分析
不同农场垫料样本的α多样性存在显著差异。垫料中存在的细菌群落的Faith’s系统发育多样性（Faith’s PD）在不同农场之间存在显著差异（p = 0.0154），但仅在农场A与农场B（p = 0.0176）和农场C（p = 0.0283）之间显著。农场A的平均Faith’s PD指数高于其他两个农场，这意味着农场A的垫料中的细菌群落更加多样化。相比之下，真菌群落的Faith’s PD在不同农场之间没有显著差异（p = 0.205）。然而，真菌群落的Shannon多样性在不同农场之间存在显著差异（p = 0.0380），表明物种丰富度和均匀性都有所变化。Shannon多样性仅在农场A与农场C之间显著不同（p = 0.0285）。农场C的平均Shannon多样性较低，表明其真菌群落不如农场A或农场B的垫料多样化。在比较给药前后细菌和真菌群落的α多样性指标时，所有计算的α多样性指标（Faith’s PD、Shannon多样性、Pielou均匀度和观察到的ASVs）组间没有显著差异（p > 0.05）。

β多样性分析显示不同农场垫料样本之间存在统计学上的显著差异（Bray-Curtis距离；16S，p = 0.004，ITS，p = 0.001）。成对比较显示农场A和B以及农场A和C之间的细菌群落β多样性存在显著差异（Bray-Curtis距离；农场A和B p = 0.037，农场A和C p = 0.011）。进行了主坐标分析（PCoA）（图3和图4）以直观评估β多样性参数之间的关系。对于16S和ITS的结果，Bray-Curtis距离或细菌或真菌物种组成在不同地点之间的差异大部分可由时间解释，这与预期一致，因为群落预计会随时间变化。然而，23.25%（16S）和21.63%（ITS）的方差归因于农场之间的差异，这一点也得到了置换多元方差分析（PERMANOVA）结果的支持（p < 0.05）。

图3. 随时间变化从农场A、B和C收集的家禽垫料样本中细菌16S rRNA基因谱的Bray-Curtis差异的主坐标分析（PCoA）。轴1和轴2分别解释了38.52%和23.25%的变异。颜色和符号代表农场和时间点：绿色（农场A）、橙色（农场B）、紫色（农场C）、菱形（第0天）、方形（第61天）和圆圈（第120天），表明微生物群落随时间和地点的变化。

图4. 随时间变化从农场A、B和C收集的家禽垫料样本中真菌ITS基因谱的Bray-Curtis差异的主坐标分析（PCoA）。主成分1（轴1）和2（轴2）分别解释了32.30%和21.63%的总方差。数据点根据农场和采样天数进行颜色编码和形状区分：绿色（农场A）、橙色（农场B）、紫色（农场C）、菱形（第0天）和圆圈（第120天），显示了真菌谱的聚类模式和时间变化。

在家禽垫料样本中发现的最丰富的属是短杆菌属（Brachybacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和葡萄球菌属（Staphylococcus），这些属包含致病性和非致病性物种，并且常见于家禽粪便中（见补充信息附录D中的图S1）。肠球菌属（Enterococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和大肠杆菌/志贺氏菌属（Escherichia/Shigella）是研究中检测到的属，这些属包含潜在的病原体；然而，由于16S元条形码的分辨率有限，无法进一步确定病原体的存在情况。农场B的葡萄球菌相对丰度最高，而γ-变形菌门（Gammaproteobacteria）在农场C中的丰度高于其他两个农场。放线菌门（Actinobacteria）在所有农场中都很普遍，但其水平在不同农场之间有所不同。乳杆菌目（Lactobacillales）相关的细菌在农场A和B中含量较高，但在农场C中较低，而糖单胞菌科（Saccharimonadaceae）在农场A和B中较少见，在农场C中较为丰富。这些样本中鉴定出的一些类和属与本研究中研究的测试化合物的降解和抗性有关，包括放线菌门、假单胞菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属（Bacillus）、Comamonas属和链霉菌属。

3.4. 抗微生物敏感性测试
从家禽垫料样本中未分离出大肠杆菌（E. coli）或弯曲杆菌属（Campylobacter）；然而，所有样本中都分离出了肠球菌。由于缺乏肠球菌中测试化合物的临床临界值，因此无法将这些分离株分类为临床耐药或敏感。相反，使用清除区来比较不同地点之间的差异。噻吗啉的清除区存在显著差异（p = 0.0213）（图5d），尽管其他所有测试化合物在不同农场之间的清除区没有显著差异（图5）。

4. 讨论
4.1. 家禽垫料特性
多种因素可能导致垫料物理化学性质的显著差异，这些差异可能会影响不同VMPs和FA的降解速率。新鲜垫料材料的pH值通常接近中性，但随着排泄物的积累而发生变化，这可能受到所用垫料材料的影响。例如，木屑往往能保持更中性的pH值。相比之下，稻草和干草在分解过程中会产生有机酸，最初会变得更具酸性。然而，随着分解过程中释放的碱性阳离子中和H+离子，它们可能会变得更加碱性[25]。pH值影响抗生素的化学稳定性，某些抗生素在碱性条件下会更快降解，而其他抗生素在中性或酸性pH值下可能更稳定。这可能是导致本研究中某些测试化合物降解速率差异的因素之一（图1）。例如，农场B和C的垫料pH值高于农场A，这可能解释了农场B和C的噻吗啉降解速度比农场A快（图1d）。这可能是由于分子的化学结构和行为；噻吗啉中的酯键容易在碱性条件下发生水解，尤其是在氢氧根离子的亲核攻击下。相比之下，磺胺嘧啶是一种磺胺类抗生素，在农场B和C的碱性垫料条件下似乎更稳定，而在农场A的样本中观察到更快的降解（图1e），这与先前文献的发现一致[11]。

4.2. 降解动力学
如前所述，粪便降解研究被用作VMPs和FA的风险评估工具。可以使用多种方法进行粪便降解研究，也可以使用放射性标记物质（如14-C）来计算活性分数，从而获得PECsoil精炼的数据。与土壤降解研究指南不同，粪便降解研究只需要使用一种粪便类型来评估产品在粪便中的降解情况。有几种方法可以精炼PEC，其中一种是基于粪便中的降解。粪便储存时间的一半被计算为总储存时间，以考虑动物处理期间的变化。如果动物在储存期开始时接受处理，则活性成分有更多时间降解。然后将PECsoil精炼值与预测无效应浓度（PNEC）进行比较，以计算风险商数（RQ）。如果RQ值< 1，则可以得出第二阶段A级的评估结果。土壤是主要的暴露途径，PECsoil和PECsoil精炼的计算会影响其他环境部分的量化风险。粪便降解研究中生成的DT50值也用于地下水和地表水模型。因此，DT50值的任何不准确性都会导致PECsoil精炼值的误差，从而影响整个评估结果，可能导致产品被错误批准或拒绝市场授权。本研究的结果突显了DT50值的潜在变异性，以及随后的PECsoil精炼值的变异性，如图2所示，某些值相差高达十个数量级。以农场A的垫料为例，如果使用其计算PECsoil，RQ将为1.03。由于RQ > 1，这将触发进一步的测试或拒绝市场授权。然而，如果使用来自农场B或C的垫料，RQ值将分别为0.00138和2.88 × 10^-10，从而可以完成风险评估并批准产品上市。关于本研究中使用的测试化合物的DT50值的信息有限，尤其是在家禽垫料方面。然而，与当前研究的结果相比，降解情况可能会有所不同（表3）。Berendsen等人（2018年）报告称，替米考星的DT50为280天，这表明替米考星在某些垫料中的持久性比本研究中测试的垫料更强，后者中最长的DT50为33.1天。这进一步突显了家禽垫料的变异性以及理解这种变异性的重要性，以提高环境风险评估（ERA）的准确性。需要进一步的研究来更全面地了解家禽行业中使用的VMPs的降解情况及其差异程度。应进一步调查导致这些差异的具体参数，以便对ERA指南进行相应的调整，确保这种变异性得到考虑，避免产品被错误地批准或拒绝上市。

表3. 选定兽药和饲料添加剂的文献DT50值总结
化合物 | DT50值（天）
---------|---------|
莫能菌素 | 7.4 | 牛粪 [45]
盐霉素 | 5.1 ± 0.3 | 猪粪 [46]
磺胺二甲嘧啶 | 4.4 | 肉鸡粪 [26]
替米考星 | 280 | 肉鸡粪 [26]
三甲氧苄胺嘧啶 | 31.5 | 污泥 [45]
4.3

**宏条形码分析**
垫料中微生物群落组成的差异会影响不同VMPs和FA的降解速率，这取决于存在的微生物的分类学和相对丰度。抗抗生素细菌与其他耐药细菌不同，因为它们可以利用抗生素进行营养和细胞稳态。农业和医疗环境可能含有最高水平的抗抗生素细菌。在本研究的样本中鉴定出几种已知或疑似的抗抗生素细菌，包括假单胞菌、微杆菌和无色杆菌[27][28][29]。如果不同粪便中这些抗抗生素细菌的丰度不同，可能会影响它们所依赖的抗生素的降解速率。与农场A和B相比，农场C样本中的假单胞菌相对丰度要高得多，这可能会影响磺胺二甲嘧啶的降解。农场B和C中的无色杆菌和微杆菌的相对丰度相似；然而，农场A的样本中没有检测到无色杆菌。

**共代谢**
共代谢是指细菌在摄取其他碳源的同时降解抗生素，而抗抗生素细菌则将抗生素作为唯一的碳源。在研究样本中检测到的具有共代谢能力的细菌属包括芽孢杆菌、葡萄球菌和大肠杆菌[30]。芽孢杆菌在农场B的样本中丰度最高，其次是农场C，而在农场A的垫料中丰度最低。大肠杆菌和葡萄球菌在农场B的样本中最丰富，在农场A的样本中较少，在农场C的样本中最少。使用16S rRNA测序检测到大肠杆菌的现象表明16S rRNA测序结果与培养结果可能存在差异，因为从垫料样本中未分离出大肠杆菌。这可能有几个原因：首先，测序的DNA可能是来自死细胞的游离DNA，因为宏条形码技术无法区分活细胞和死细胞；其次，存在的物种可能不是大肠杆菌，而是相关物种，例如阿尔伯特大肠杆菌（Escherichia albertii）。这种细菌在全球家禽环境和英国野生鸟类中都有发现[31][32]，但它缺乏产生β-D-葡萄糖醛酸酶的能力[33]，而这种酶是大肠杆菌在TBX琼脂上变色的原因。然而，由于非典型菌落的丢失，无法进一步调查这一点。最后，这也可能是由于家禽垫料的异质性，即大肠杆菌确实存在于用于DNA提取的样本中，但在培养过程中未被检测到。例如，所有样本中都分离出了肠球菌，但在宏条形码数据中未检测到它们，尽管这可能是由于两种方法的灵敏度差异所致。

这些结果表明，不同农场之间的α多样性存在显著差异，因为家禽垫料反映了肠道微生物群和环境微生物的情况。β多样性显示了农场A样本中的微生物群落分类学差异的程度，即使两者的丰富度相似（图3和图4）。β多样性受与α多样性相似的因素影响。β多样性差异越大，这些因素在农场之间的差异就越明显。农场之间Faith’s PD的显著差异表明，家禽垫料中的细菌群落在生态角色和适应性方面可能存在差异。Faith’s PD值较高表示生态系统更稳定和有韧性，因为具有更多样的进化背景，能够更好地应对环境变化。Faith’s PD的显著差异可能归因于不同农场中鸟类的年龄差异；然而，这需要进一步研究。相比之下，垫料中的真菌群落在Faith’s PD方面没有显著差异，但根据Shannon多样性指数来看存在差异。这表明不同类型垫料中的真菌群落在分类学丰富度和均匀性方面存在差异。农场C的平均Shannon多样性较低可能归因于该鸡舍中鸟类的年龄较小，因为已有研究表明老年和年轻鸟类的肠道微生物群存在差异[34]。每个农场都是一个独特的生态系统，具有不同的鸟类遗传学、饲料、管理和环境条件，这些因素共同塑造了微生物多样性。影响α多样性的因素包括生产类型、鸟类品种和年龄，因为每种情况都有不同的微生物组。肉鸡、蛋鸡和种鸡有不同的生理需求和肠道微生物组。每个农场通常根据成本、生长目标或健康策略使用不同的饲料配方。饮食的差异，如玉米基饲料与小麦基饲料、饲料的蛋白质含量以及不同FA（包括预混料和益生菌）的使用，都会影响粪便微生物组，进而影响α多样性。农场管理实践，如垫料重复使用和饲养密度，会增加压力和病原体负荷，改变细菌群落结构并影响α多样性[35]。

粪便管理实践，如粪便储存时间的长短、是否堆肥、干燥或堆积，也会改变微生物群落和好氧菌与厌氧菌的丰度。重复使用的垫料会随着时间的推移积累细菌，包括大肠杆菌、真菌和抗生素抗性基因（ARGs）[36]。每次重复使用都会改变微生物基线，使群落变得更加多样化或病原体含量更高，具体取决于管理方式。环境因素如温度和湿度也会影响微生物的存活和生长。使用不同的当地土壤或水源也会引入不同的环境细菌。农场采取的生物安全措施也是影响α和β多样性的重要因素，因为生物安全措施较差的农场可能导致垫料微生物组受到外部微生物污染的影响。α多样性指标是评估每个样本中微生物群落丰富度的有用工具；然而，它们不能解释农场之间分类学组成的差异。

本研究检测到几种与测试化合物降解相关的细菌属，包括假单胞菌属，这些细菌与三甲氧苄胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和盐霉素的降解有关[30][37]。农场C中的假单胞菌相对丰度高于其他两个农场（见附录D中的补充信息图S1），这可能促进了农场C垫料中盐霉素和三甲氧苄胺嘧啶的更快降解。据报道，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌参与了三甲氧苄胺嘧啶的生物降解[30]。莫能菌素的生物降解与Stenotrophomonas mataphilia有关[38]，而盐霉素的降解则与Enterobacter agglomerans有关[37]。然而，关于具体微生物降解途径的数据有限，特别是对于不用于人类医学的测试化合物（如替米考星）或作为FA监管的化合物（如莫能菌素和盐霉素）。Nguyen等人[39]报告称，无色杆菌、Delftia、黄杆菌、假单胞菌和Stenotrophomonas的丰度与替米考星的降解有关；然而，涉及的机制和物种尚不清楚。农场C样本中黄杆菌和假单胞菌的相对丰度可能促进了替米考星在农场C中的更快降解（见图1d）。在样本中还检测到了一些先前观察到对测试化合物具有抗性的细菌属。磺胺二甲嘧啶是一种磺胺类抗生素，可抑制叶酸合成途径中的二氢蝶酸合成酶（DHPS）。常见的携带磺胺类抗性的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、柠檬酸杆菌属、鲍曼不动杆菌和志贺氏菌属[40]。在本研究中，农场B和C的样本中检测到了鲍曼不动杆菌。在革兰氏阳性菌中，通过宏条形码技术鉴定出肠球菌属，并通过培养方法在所有样本中都检测到它们。

这种相对丰度、抗性机制和ARGs的差异很重要，因为这些微生物具有多种功能，可能会影响VMPs和FA在家禽垫料中的命运和行为。

**抗菌素敏感性测试**
对肠球菌分离株的抗菌素敏感性测试显示，不同农场中含替米考星的孔周围的清除区存在显著差异（见图5）。然而，作者认识到样本量n=2的局限性，难以得出可靠结论。多种抗性机制可能导致这种差异，例如23S rRNA基因突变引起的核糖体修饰，这会降低替米考星的结合亲和力；或者通过修饰核糖体蛋白L3或L4来改变结合位点[41]。外排泵是另一种潜在的抗性机制，活性外排系统可以将替米考星泵出细菌细胞，从而降低细胞内浓度[42]。肠球菌还可以通过质粒或转座子获得抗性基因，从而导致多重耐药性；然而，在肠球菌对替米考素的抗性情况下，这一点记录较少。替米考素很少直接用于治疗肠球菌感染；然而，在广泛使用替米考素的兽医环境中，监测抗性至关重要。人们担心动物肠球菌菌株中的抗性基因可能会转移到人类病原体上。抗性可能会降低pleuromutilins的效果，虽然替米考素不直接用于人类医学，但如果新型人类用pleuromutilins（如Lefamulin）的使用增加，这可能会成为一个问题[43]。

比较第1天和第61天的清除区，磺胺二甲嘧啶的清除区有所扩大，表明其效果随时间增强（见图5e）。这一观察结果特别值得注意，因为其他抗菌剂的效果相对稳定，显示出农场C分离株对磺胺二甲嘧啶的独特时间响应。考虑到降解数据，磺胺二甲嘧啶在农场C的垫料中降解迅速（DT50 = 1.44天），表明分离株的抗性随时间减弱。肠球菌属通常在移动遗传元件（如质粒或转座子）上携带抗性基因。由于缺乏选择压力或适应成本，这些分离株可能随时间失去了这些遗传元件，从而增加了对磺胺二甲嘧啶的敏感性。然而，这些变化在另外两个农场的分离株中并未观察到，因为这些垫料中的磺胺二甲嘧啶也降解得非常迅速。这种现象可能是由于农场C样本中的种群发生了变化，即更易感的亚群在61天时超过了耐药亚群。进一步的研究，包括筛选sul基因，可以帮助确定观察到的差异是由于农场C分离株的抗性丧失（可能是由于质粒丢失或基因丢失），还是从一开始就存在更易感的亚群但未被检测到（由于采样限制）。此外，还需要确定抗性是否与sul基因的突变激活或表达改变有关，或者在没有sul基因的情况下抗性仍然存在，这表明可能存在其他机制（如外排泵）的参与。这些可能性可以通过PCR、定量PCR或全基因组测序来研究。在第61天，从农场B的垫料样本中分离出的细菌对盐霉素（图5a）和噻胺ulin（图5d）的抑制圈直径增大，这可能是由于在61天内垫料中存在低水平的抗生素导致细菌产生了抗性。尽管抗菌素耐药性（AMR）是一个日益重要的全球性问题，但目前它并未被纳入兽用药物（VMPs）或饲料添加剂（FAs）的评估标准（ERAs）中。大多数关于AMR的研究集中在仅用于人类医学的抗菌素上。然而，人们越来越关注兽用抗菌素的影响，特别是这些物质产生的抗性可能对动物和环境健康造成的影响，以及它们如何促进共同选择并最终影响人类健康。本研究的结果表明，禽类垫料可能是潜在耐药细菌的储存库，但由于缺乏针对肠球菌分离株的明确耐药性临界值，这种抗性的临床意义仍不确定。需要进一步的研究来确定耐药性临界值、流行病学截断值和最低抑菌浓度，以准确评估兽用抗菌素在环境中的风险。持续监测禽类生产环境中的AMR对于了解耐药基因（ARGs）的传播情况以及是否应将这些化合物的耐药性纳入其ERAs中也至关重要。

5. 结论
本研究强调了在ERAs中进行粪便降解研究时使用来自不同来源的多种垫料类型的必要性。五种测试化合物的降解动力学观察到的变异性进一步强调了需要进一步研究其他VMPs和FAs的环境行为，以便全面评估它们的潜在环境风险。经合组织（OECD）的307号土壤降解研究指南要求使用四种不同的土壤类型来考虑土壤之间的差异[44]。本研究的结果表明，粪便中的降解研究也应类似地结合多种垫料类型，以充分捕捉环境变化。VMPs和FAs在禽类垫料中的命运和行为仍然研究不足。需要进一步的研究来加深我们对这一复杂基质的理解，并完善现有的风险评估指南。未来的研究应重点关注影响禽类垫料变异性的因素，这些因素可能包括垫料材料、物理化学性质（如pH值）、微生物群落组成以及垫料中其他共污染物的存在。

作者说明：
Chris Sinclair和Philip Rooney已不再在Fera Science Ltd的化学安全与管理工作中心工作。
作者声明没有利益冲突。
作者确认支持本研究结果的数据可以在手稿和支持信息中找到。原始测序数据可从NCBI获取（访问号：PRJNA1347738）。
本工作得到了Leeds-York-Hull自然环境研究委员会（NERC）博士培训合作伙伴计划（DTP）Panorama项目（资助号NE/S007458/1）和Fera Science Ltd的支持。

CRediT作者贡献声明：
Beth Adams：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
Laura Carter：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。
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Philip Rooney：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、概念化。
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Chris Sinclair：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念化。