基于DNA的方法鉴定海洋底栖鱼类胃内容物中的溯河性鱼类（Alosa属，鲱科）

《Journal of Fish Biology》：DNA-based identification of anadromous fishes (Alosa spp., Family Clupeidae) in stomach contents of marine groundfish

　　摘要

使用DNA技术进行猎物鉴定是一种新兴的方法，旨在提高营养信息的精确度和准确性。我们评估了基于DNA的猎物鉴定方法与视觉胃内容物分析相结合在缅因湾近岸商业重要底栖鱼类中的应用效果，重点在于区分被食用的溯河性鱼类（Alosa spp.）及其密切相关的海洋猎物（大西洋鲱鱼Clupea harengus和大西洋鲱鱼Brevoortia tyrannus）。通过对179个被食用猎物样本进行DNA条形码分析，在122个案例中实现了物种或属级别的鉴定（68.2%），其中包括104个案例的分类分辨率得到提高，以及3个与视觉鉴定结果不一致的情况。将基于DNA的鉴定方法与对部分或完全消化猎物的广泛视觉分析相结合，显著提高了饮食指标的量化程度，从而能够更好地反映溯河性鱼类和海洋鲱科鱼类的相对饮食贡献。通过DNA鉴定确定的被食用Alosa spp.的体型与0年或1年幼鱼阶段一致。DNA鉴定成功率的可能限制因素包括样本保存质量（乙醇）、参考数据库的质量（凭证样本鉴定的准确性）以及测序错误（核苷酸碱基的错误识别）。尽管如此，分子方法的整合显著提高了对形态相似但生态学上具有重要差异的猎物之间营养相互作用的可解释性。这些结果强调了如何通过有针对性地应用基于DNA的猎物鉴定方法来补充传统的饮食分析，从而更准确地量化最终决定生态系统过程的营养相互作用。

1 引言

尽管在识别部分消化的猎物方面存在局限性，但胃内容物分析仍是鱼类饮食评估中最常用的方法（Amundsen & Sánchez-Hernández, 2019; Hynes, 1950; Hyslop, 1980）。传统的胃内容物分析方法依赖于使用诊断性形态特征进行猎物视觉鉴定。这种方法相对于间接饮食评估方法（如脂肪酸分析、同位素分析）的主要优势在于，直接检查胃内容物可以提供关于被食用猎物的数量、大小和生命阶段的精确信息（da Silveira et al., 2020; Nielsen et al., 2018）。然而，在咀嚼和消化过程中，诊断性特征的降解常常限制了猎物鉴定的分类分辨率，尤其是在胃内容物由形态相似的物种和/或猎物的早期生命阶段组成时（Buckland et al., 2017; da Silveira et al. 2020; Hyslop, 1980; Legler et al., 2010; Schooley et al., 2008）。因此，从传统胃内容物分析中获得的饮食数据通常具有较低的分类分辨率、不完整的猎物大小和生命阶段信息，以及可能影响其实用性的消化相关偏差。基于DNA的猎物鉴定方法是一种有前景的方法，可以提高从胃内容物中获得的信息的特异性和准确性。使用DNA的主要优势在于，即使猎物被完全消化且只剩下少量组织，它也能提供可验证的、通常是物种级别的鉴定（例如Dunn et al., 2010; Jarman et al., 2002; Thalinger et al., 2016）。基于DNA的物种鉴定遵循标准化协议，其中一段诊断基因被扩增、测序，并与来自已知物种的参考序列数据库进行比对，这一过程通常被称为DNA条形码技术（Hebert et al., 2003）。线粒体DNA细胞色素c氧化酶1（COI）常被用作诊断性分子标记，因为其在物种间的变异性高而在物种内的变异性低，从而能够高效地进行密切相关的动物之间的物种级别鉴定（Hajibabaei et al., 2006; Hebert et al., 2003; Waugh, 2007; Weigt et al., 2012）。通用COI鱼类引物的开发以及从数千种鱼类物种中编译的COI序列（例如GenBank [Benson et al., 2004]、Barcode of Life Database [Ward et al., 2009]）为使用DNA方法改进涉及鱼类作为捕食者和猎物的饮食评估提供了标准化基础（Traugott et al., 2021综述）。尽管有这些优势，基于DNA的鉴定方法在处理部分消化的猎物时仍面临自身的挑战和限制。使用DNA序列进行可靠物种鉴定依赖于参考数据库的完整性和准确性，以及从降解材料中成功提取和扩增DNA的能力（Berry et al., 2015; Deagle et al., 2007; Leray et al., 2013; Pentinsaari et al., 2020）。DNA条形码技术的分析要求也可能限制其可扩展性，相比之下，简单的形态学方法可能更为适用。比较研究表明，将形态学方法和分子方法相结合可能是最大化猎物鉴定率和饮食评估生态洞察力的最佳解决方案（Aguilar et al., 2017; Berry et al., 2015; Casper et al., 2007; Oehm et al., 2017; Tollit et al., 2009）。本研究应用DNA条形码技术来识别海洋底栖鱼类胃内容物中的溯河性鱼类（Alosa spp.，鲱科）。Alosa属鱼类包括银鲱Alosa pseudoharengus（Wilson 1811）、蓝背鲱Alosa aestivalis（Mitchill 1814）和美洲鲱Alosa sapidissima（Wilson 1811）。Alosa spp.的溯河性生活史涉及季节性迁徙至淡水流域的入口（Acolas & Lambert, 2016）。尽管对海洋食物网中溯河性鱼类的捕食者-猎物相互作用了解不多，但由于Alosa spp.体型较小，它们成为多种海洋捕食者的潜在猎物（Jones et al., 2010; Juanes et al., 1993; Leach et al., 2024; McDermott et al., 2015; Smith & Link, 2010; Toth et al., 2018）。然而，由于进入淡水产卵和育苗栖息地的机会减少，Alosa spp.的种群数量在其分布范围内有所下降（Hall et al., 2011; Limburg & Waldman, 2009）。大规模的恢复措施，如拆除水坝或建设鱼类通道工程，旨在重新建立迁徙路径以支持溯河性物种的恢复（Hall et al., 2011, 2012）。这增加了对量化近岸食物网中溯河性猎物饮食贡献的兴趣（Falke et al., 2024; McDermott et al., 2015; Willis et al., 2017）。然而，由于传统视觉分析的分类分辨率有限，量化Alosa spp.猎物的饮食贡献具有挑战性。Alosa spp.的饮食中可能同时存在形态相似的纯海洋鲱科鱼类（Falke et al., 2024），包括与大西洋鲱鱼Brevoortia tyrannus（Latrobe 1802）——它们与Alosa spp.属于同一亚科——以及大西洋鲱鱼Clupea harengus L. 1758。因此，在亚科、科或更低分辨率水平上计算的饮食指标可能会忽略这些猎物物种及其生命阶段之间的重要生态差异。因此，通过DNA技术实现更高分辨率的鉴定对于推进与溯河性鱼类相关的营养生态学和生态系统管理至关重要。我们的主要目标是评估基于DNA的猎物鉴定方法在识别胃内容物中潜在Alosa spp.猎物方面的有效性，研究影响条形码鉴定成功率的因素，并评估结合视觉和基于DNA的鉴定方法如何改进定量饮食指标的计算。为了实现这些目标，我们将DNA条形码技术应用于从海洋底栖鱼类胃内容物中回收的视觉上难以识别的鲱科猎物，并将分子结果与传统的视觉鉴定方法相结合。我们假设消化状态和保存条件（样本年龄）会显著影响条形码鉴定的成功率，但预期DNA条形码技术总体上会提高猎物鉴定的分类分辨率。因此，我们预期结合视觉鉴定和针对性的DNA分析将使饮食指标更倾向于更高分辨率的猎物类别，从而增强对溯河性鱼类在海洋食物网中作用的生态学理解。

2 材料与方法

2.1 伦理声明

实验动物的护理和使用符合美国联邦动物福利法律、指南和政策。所有采样程序均按照NOAA东北渔业科学中心批准的协议进行。胃内容物采样是作为缅因-新罕布什尔近岸拖网调查（MEDMR, 2023）的一部分进行的，并得到了NOAA拨款/奖项编号NA22NMF4540361的支持。

2.2 样本区域和野外采集

在2012年至2022年的两年一次的调查期间（春季和秋季），使用底拖网在缅因湾近岸海域采集银鳕Merluccius bilinearis（Mitchill 1814）、大西洋刺狗鱼Squalus acanthias L. 1758、僧鱼Lophius americanus Valenciennes 1837、白鳕Urophycis tenuis（Mitchill 1814）和红鳕Urophycis chuss（Walbaum 1792）（图1）。McDermott等人（2015）选择肯纳贝克河和佩诺布斯科特河口附近的区域进行采样，因为这些河流中有现存的溯河性鱼类种群和持续的恢复工作。胃内容物采样集中在潜在的鱼类捕食者上，这些捕食者的最小中心线长度分别为15厘米（L. americanus）或20厘米（M. bilinearis, U. chuss, U. tenuis, S. acanthias）。整个胃被取出并在渔船上用95%乙醇保存。Falke等人（2024）提供了2012-2022年饮食研究的额外采样设计细节。图1显示了在缅因湾近岸海底栖鱼类胃内容物中发现的接受DNA分析的猎物样本的野外采集位置（实心圆圈）。较小的空心圆圈表示2012-2022年饮食研究期间采集的所有其他海底栖鱼类胃内容物的位置。采样区域靠近缅因州的两个主要淡水流域：（1）肯纳贝克河和（2）佩诺布斯科特河。插图显示了采样区域的位置（用红色标出）在美国东北部。

2.3 胃内容物的实验室处理

从每个胃中取出所有内容物，并根据显微镜下（6×至50倍放大）对形态特征的视觉评估为猎物分配最佳可能的分类鉴定。用于视觉鉴定鲱科鱼类的形态特征包括耳石形状、腹侧鳞片的存在/缺失、腹膜色素沉着、肋骨结构以及体型（例如背腹宽度、眼睛大小）。记录了完整鱼类猎物的实际或估计总长度。所有鱼类猎物被分为新鲜（消化迹象少，外部特征基本完整）、部分消化（猎物变软且外部侵蚀，大部分组织仍存在）或完全消化（猎物的外部特征缺失，鉴定依赖于内部特征和硬部分；图S1）。在DNA处理之前，胃内容物被重新置于95%乙醇中。

2.4 样本选择和DNA提取

根据它们被鉴定为可能的Alosa spp.（例如亚科Alosinae、未分类的鲱科鱼类、未鉴定的硬骨鱼类或需要确认的物种级别），2020年（n=93）和2023年（n=86）选择了179个鱼类猎物样本进行DNA分析。选择进行组织提取的未鉴定硬骨鱼类是因为它们具有成为Alosinae的潜力；由于成本和时间限制，未选择那些不具有成为Alosinae潜力的硬骨鱼类。样本选择优先考虑那些接近DNA分析日期采集的样本，并按时间顺序逆向进行，直到达到处理能力上限。极度降解的样本（例如食糜、颗粒物、骨头）未被选中。2020年的DNA分析样本来自2019年（n=39）、2018年（n=37）和2017年（n=17）的调查。2023年的DNA分析样本来自2022年（n=23）、2021年（n=51）和2019年（n=12）的调查。2023年，来自同一调查区域的阳性鉴定的拖网捕获的A. pseudoharengus（n=2）、A. aestivalis（n=2）和A. sapidissima（n=1）的肌肉组织样本使用相同的DNA协议进行了分析，以提供溯河性物种鉴定的对照。所有阳性对照样本都是在DNA分析前两年采集的。在DNA提取之前，从每个样本中切取200-400毫克肌肉组织。为了避免样本之间的交叉污染，使用一次性塑料托盘和/或非吸水性纤维素称重纸作为工作表面，并用乙醇清洁和消毒解剖工具（剪刀、刀具、手术刀、镊子）。尽可能避免使用严重降解和表面组织。样本被放入2毫升Eppendorf管中，并通过向每个管中加入1毫升1XPBS缓冲液进行洗涤，然后以8500g离心4分钟，随后去除上清液。洗涤重复一次，之后将每个干净干燥的组织样本放入新的2毫升Eppendorf管中并冷冻直至提取。提取按照Qiagen公司的Quick-Start Protocol for QIAamp? Fast DNA Stool Mini Kit进行。提取后，使用Qubit dsDNA Quantification, High Sensitivity Assay kit进行定量。将50微升样本 aliquots放入0.1毫升无菌PCR管条中并冷冻，准备进行PCR和Sanger测序，测序在东北大学海洋基因组遗产中心进行。

2.5 DNA扩增和测序

使用尾部M13 COI引物FISHCOILBC_ts和FISHCOIHBC_ts（Handy et al., 2011）扩增了大约700 bp的线粒体细胞色素氧化酶I（COI）区域。对于每次PCR反应，将2 μL的DNA模板（阴性对照使用2 μL的H2O）、17.5 μL的OneTaq 2X Master Mix（New England Biolabs）以及10 μM的正向和反向引物混合在一起，并用MilliQ水调整到总体积为35 μL。热循环包括在94°C下进行30秒的热启动，然后是30个循环，每个循环在94°C下30秒、52°C下40秒和68°C下60秒，最后在68°C下进行5分钟的延伸，使用的是PCT-200热循环仪（MF Research, Inc.）。PCR的成功通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳来可视化。阴性对照在琼脂糖凝胶上没有产生可见的条带，因此没有进行测序。从每个扩增产物中取出15 μL，在Applied Biosystems 3730xl DNA Analyser上进行双向测序，该设备位于Maryland州的Rockville。所得序列使用Geneious v.8进行编辑和分析，自动修剪末端以去除每个碱基错误概率大于1%的序列，并将500个碱基设置为成功读取的最低阈值。物种鉴定是通过BLAST与FDA参考标准序列库进行比对来确定的，同时参考了Barcode of Life Data Systems（BOLD）和国家生物技术信息中心（GenBank）的数据库。只有当查询序列与参考序列之间的匹配度超过99%时，才会确定物种。

2.6 统计分析

进行了逻辑回归分析，以验证猎物大小和消化状态对鱼类猎物鉴定分辨率的影响（即不包括基于DNA的猎物鉴定）。在2012-2022年的调查期间，所有在底层鱼类胃内容物中观察到的完整鱼类猎物的数据（n=1202）都被纳入了这项分析。使用广义线性模型和logit链接函数来模拟二元响应（1=进行了物种或属级别的鉴定，0=进行了较低分辨率的鉴定）。鱼类猎物的大小（总长度以毫米为单位）和消化状态被作为附加预测变量。在这个模型中，消化状态被视为一个两级的分类变量（新鲜/部分消化和完全消化），因为所有被分类为“新鲜”的猎物都使用视觉方法进行了物种级别的鉴定。逻辑回归还用于研究样本年龄和消化状态对179个选定样本的基于DNA的猎物鉴定成功的影响。使用广义线性模型和logit链接函数来模拟基于DNA的鉴定的成功/失败（即与参考数据库序列的物种或属级别匹配）。样本年龄（连续变量；从初始样本保存到DNA提取之间的时间）和消化状态（三级分类变量；新鲜、部分消化或完全消化）被作为预测变量纳入模型。首先使用似然比检验（LRT）来确定样本年龄和消化状态之间的双向交互作用的显著性，其中包含双向交互作用的完整模型与仅包含主要效应的简化加法模型进行了比较。在确定双向交互作用不显著后，使用加法模型来确定样本年龄和消化状态的主要效应的显著性。由于不期望捕食者物种能够解释成功鉴定猎物的概率，因此数据被汇总在五个捕食者物种中，尽管大多数胃内容物样本来自M. bilinearis。

2.7 饮食指标计算

为了比较整合DNA分析前后获得的信息，首先使用仅基于视觉的方法计算了频率出现次数，然后使用基于DNA和视觉方法的组合重新计算。频率出现次数是一个标准的饮食指标，定义为含有感兴趣猎物分类单元的捕食者胃的数量除以采样的捕食者胃的总数。我们关注频率出现次数，因为它是一个稳健且易于解释的指标，可以描述鱼类饮食的组成（Baker等人，2014年）。使用来自与DNA分析重叠的调查部分的饮食数据，分别计算了所有捕食者物种和每个捕食者物种的每个鲱科猎物分类单元的频率出现次数（2017-2022年）。在用DNA支持的数据计算频率出现次数之前，如果条形码识别成功，则使用DNA结果更新猎物鉴定；而对于条形码识别不成功的猎物，则保留其之前给出的视觉鉴定结果。通过DNA鉴定到属级别的Brevoortia sp.与物种级别的Brevoortia tyrannus鉴定合并为一个猎物类别（Brevoortia sp.），用于计算频率出现次数。

3 结果

3.1 基于视觉的猎物鉴定

在2012-2022年的调查中，通过对底层鱼类胃内容物的视觉分析，为1797个鱼类猎物中的970个（54.0%）提供了物种或属级别的鉴定，以及为选中进行DNA分析的179个样本中的22个（12.3%）提供了鉴定。对于1797个鱼类猎物中的1202个（66.9%），可以测量其体型。对于鲱科猎物，有183个观察结果被视觉鉴定到科级别，144个观察结果被视觉鉴定到物种级别。使用视觉方法对较小（βSIZE = 0.007，标准误差[SE] = 0.001；X2[1, N = 1202] = 28.6，p < 0.001）和更完全消化的样本（βWELL = -2.339，SE = 0.178；X2[1, N = 1202] = 172.5，p < 0.001），进行鱼类猎物的物种或属级别鉴定显著困难。对于长度小于100毫米的样本，尤其是部分消化或完全消化的样本，几乎不可能将鲱科猎物视觉鉴定到物种级别（图2）。图2显示了2012-2022年在缅因湾近岸收集的底层鱼类胃中观察到的可测量（即完整的）鱼类猎物的分类，使用仅基于视觉的方法。每个点代表一个单独的猎物，并根据其消化状态（新鲜、部分消化或完全消化）进行着色。每个点沿水平轴的位置表示每个猎物的总长度。为了便于可视化，在猎物类别内沿垂直轴添加了随机变化和50%的透明度。显示的分类单元包括属于鲱科的物种或较低分辨率的类别以及未分类的硬骨鱼类（即骨骼鱼残余）。

3.2 猎物样本的DNA条形码鉴定

在179个接受DNA分析的样本中，有122个（68.2%）找到了数据库匹配，其中109个被鉴定到物种级别，13个被鉴定到属级别（表1和表2）。23个样本被鉴定为Alosa spp.物种（18个A. pseudoharengus和5个A. aestivalis），其中14个之前使用视觉方法被鉴定为较低分辨率的类别（Alosinae、Clupeidae或未分类的硬骨鱼类）（表2）。77个样本被鉴定为C. harengus，其中62个被视觉鉴定到科级别（表2）。8个未分类的硬骨鱼类被鉴定为鲱科物种（表2），另外两个被鉴定为非鲱科分类单元M. bilinearis和大西洋沙丁鱼Scomberesox saurus（Walbaum 1792）。基于DNA的鉴定显示，拖网捕获的A. pseudoharengus、A. aestivalis和A. sapidissima（即阳性对照样本）与其现场鉴定结果完全匹配；两个A. pseudoharengus样本和两个A. aestivalis样本都获得了完美匹配，而一个A. sapidissima样本的匹配度为99.3%（见表S1中的扩增子序列和BOLD序列匹配编号）。表1显示了2017-2022年在缅因湾近岸捕获的五种底层鱼类胃内容物中通过DNA分析成功鉴定的鲱科猎物样本数量。

3.2 猎物样本的DNA条形码鉴定

在179个接受DNA分析的样本中，有122个（68.2%）找到了数据库匹配，其中109个被鉴定到物种级别，13个被鉴定到属级别（表1和表2）。23个样本被鉴定为Alosa spp.物种（18个A. pseudoharengus和5个A. aestivalis），其中14个之前使用视觉方法被鉴定为较低分辨率的类别（Alosinae、Clupeidae或未分类的硬骨鱼类）（表2）。77个样本被鉴定为C. harengus，其中62个被视觉鉴定到科级别（表2）。8个未分类的硬骨鱼类被鉴定为鲱科物种（表2），另外两个被鉴定为非鲱科分类单元M. bilinearis和大西洋沙丁鱼Scomberesox saurus（Walbaum 1792）。基于DNA的鉴定显示，拖网捕获的A. pseudoharengus、A. aestivalis和A. sapidissima（即阳性对照样本）与其现场鉴定结果完全匹配；两个A. pseudoharengus样本和两个A. aestivalis样本都获得了完美匹配，而一个A. sapidissima样本的匹配度为99.3%（见表S1中的扩增子序列和BOLD序列匹配编号）。表1显示了2017-2022年在缅因湾近岸捕获的五种底层鱼类胃内容物中通过DNA分析成功鉴定的鲱科猎物样本数量。

3.3 饮食指标计算

为了比较整合DNA分析前后获得的信息，首先使用仅基于视觉的方法计算了频率出现次数，然后使用基于DNA和视觉方法的组合重新计算。频率出现次数是一个标准的饮食指标，定义为含有感兴趣猎物分类单元的捕食者胃的数量除以采样的捕食者胃的总数。我们关注频率出现次数，因为它是一个稳健且易于解释的指标，可以描述鱼类饮食的组成（Baker等人，2014年）。使用来自与DNA分析重叠的调查部分的饮食数据，分别计算了所有捕食者物种和每个捕食者物种的每个鲱科猎物分类单元的频率出现次数。在用DNA支持的数据计算频率出现次数之前，如果条形码识别成功，则使用DNA结果更新猎物鉴定；而对于条形码识别不成功的猎物，则保留其之前给出的视觉鉴定结果。通过DNA鉴定到属级别的Brevoortia sp.与物种级别的Brevoortia tyrannus合并为一个猎物类别，用于计算频率出现次数。

3.1 基于视觉的猎物鉴定

在2012-2022年的调查中，通过对底层鱼类胃内容物的视觉分析，为1797个鱼类猎物中的970个（54.0%）提供了物种或属级别的鉴定，以及为选中进行DNA分析的179个样本中的22个（12.3%）提供了鉴定。对于1797个鱼类猎物中的1202个（66.9%），可以测量其体型。对于鲱科猎物，有183个观察结果被视觉鉴定到科级别，144个观察结果被视觉鉴定到物种级别。使用视觉方法对较小（βSIZE = 0.007，标准误差[SE] = 0.001；X2[1, N = 1202] = 28.6，p < 0.001）和更完全消化的样本（βWELL = -2.339，SE = 0.178；X2[1, N = 1202] = 172.5，p < 0.001），进行鱼类猎物的物种或属级别鉴定显著困难。对于长度小于100毫米的样本，特别是部分消化或完全消化的样本，将鲱科猎物视觉鉴定到物种级别几乎是不可能的（图2）。图2显示了2012-2022年在缅因湾近岸收集的底层鱼类胃中观察到的可测量（即完整的）鱼类猎物的分类，使用仅基于视觉的方法。每个点代表一个单独的猎物，并根据其消化状态（新鲜、部分消化或完全消化）进行着色。垂直轴上的随机变化和50%的透明度仅用于可视化目的。显示的分类单元包括属于鲱科的物种或较低分辨率的类别以及未分类的硬骨鱼类（即骨骼鱼残余）。

3.2 猎物样本的DNA条形码鉴定

在179个接受DNA分析的样本中，有122个（68.2%）找到了数据库匹配，其中109个被鉴定到物种级别，13个被鉴定到属级别（表1和表2）。23个样本被鉴定为Alosa spp.物种（18个A. pseudoharengus和5个A. aestivalis），其中14个之前使用视觉方法被鉴定为较低分辨率的类别（Alosinae、Clupeidae或未分类的硬骨鱼类）（表2）。77个样本被鉴定为C. harengus，其中62个被视觉鉴定到科级别（表2）。8个未分类的硬骨鱼类被鉴定为鲱科物种（表2），另外两个被鉴定为非鲱科分类单元M. bilinearis和大西洋沙丁鱼Scomberesox saurus（Walbaum 1792）。基于DNA的鉴定显示，拖网捕获的A. pseudoharengus、A. aestivalis和A. sapidissima（即阳性对照样本）与其现场鉴定结果完全匹配；两个A. pseudoharengus样本和两个A. aestivalis样本都获得了完美匹配，而一个A. sapidissima样本的匹配度为99.3%（见表S1中的扩增子序列和BOLD序列匹配编号）。表1显示了2017-2022年在缅因湾近岸捕获的五种底层鱼类胃内容物中通过DNA分析成功鉴定的鲱科猎物样本数量。

3.2 猎物样本的DNA条形码鉴定

在179个接受DNA分析的样本中，有122个（68.2%）找到了数据库匹配，其中109个被鉴定到物种级别，13个被鉴定到属级别（表1和表2）。23个样本被鉴定为Alosa spp.物种（18个A. pseudoharengus和5个A. aestivalis），其中14个之前使用视觉方法被鉴定为较低分辨率的类别（Alosinae、Clupeidae或未分类的硬骨鱼类）（表2）。77个样本被鉴定为C. harengus，其中62个被视觉鉴定到科级别（表2）。8个未分类的硬骨鱼类被鉴定为鲱科物种（表2），另外两个被鉴定为非鲱科分类单元M. bilinearis和大西洋沙丁鱼Scomberesox saurus（Walbaum 1792）。基于DNA的鉴定显示，拖网捕获的A. pseudoharengus、A. aestivalis和A. sapidissima（即阳性对照样本）与其现场鉴定结果完全匹配；两个A. pseudoharengus样本和两个A. aestivalis样本都获得了完美匹配，而一个A. sapidissima样本的匹配度为99.3%（见表S1中的扩增子序列和BOLD序列匹配编号）。表1显示了2017-2022年在缅因湾近岸捕获的五种底层鱼类胃内容物中通过DNA分析成功鉴定的鲱科猎物样本数量。

3.3 饮食指标计算

通过整合基于视觉和基于DNA的猎物鉴定，改善了饮食指标的计算，减少了低分辨率类别中的频率出现次数（FO）值，增加了物种或属级别分类的值，在少数情况下将零值变为非零值或反之亦然（图4）。在所有捕食者物种的综合计算中，未分类的Clupeidae的频率出现（FO）从仅基于视觉分析的4.96%降低到使用DNA和视觉方法结合后的1.38%；未分类的Alosinae的FO也从1.10%降低到0.64%。在捕食者物种内部，基于DNA的鉴定整合提高了每种捕食者物种中C. harengus的FO（例如，在M. bilinearis中从4.03%提高到10.25%），提高了Brevoortia sp.的FO，在S. acanthias中从0.74%提高到11.11%，在L. americanus中从0.31%提高到1.26%，以及提高了A. pseudoharengus的FO，在M. bilinearis中从0.81%提高到1.84%。DNA结果的整合还将S. acanthias和U. chuss中A. pseudoharengus的FO从零转换为非零值。由于一个样本的DNA鉴定结果与视觉鉴定结果冲突，U. tenuis中A. aestivalis的FO从非零变为零。尽管有两个相似的冲突结果，但在整合DNA结果后，M. bilinearis中A. aestivalis的FO从0.58%增加到0.68%。

图4 在图查看器中打开

2017-2022年在缅因湾近岸收集的Merluccius bilinearis（n=868）、Squalus acanthias（n=135）、Lophius americanus（n=318）、Urophycis tenuis（n=487）和Urophycis chuss（n=371）胃中clupeid猎物的计算频率出现值。左列显示基于仅视觉方法的鉴定结果。右列显示基于DNA和视觉方法结合的鉴定结果。垂直虚线分隔了物种或属级别的猎物类别（虚线左侧）和较低分辨率的分类（虚线右侧）。表1提供了按捕食者物种分类的接受DNA分析的猎物样本数量。UNCL表示未分类。

4 讨论

与仅基于视觉的胃内容分析相比，基于DNA的鉴定提高了溯河性（Alosa spp.）和海洋性Clupeidae（C. harengus, Brevoortia sp.）在海洋底栖鱼类饮食中的分辨率。种间形态相似性和区分特征（腹侧鳞片、腹膜色素沉着、体型）的消化降解导致在视觉分析中Clupeidae的科级鉴定数量（183个）多于物种级鉴定数量（144个）。猎物鉴定的分类分辨率在胃内容研究中差异很大，但鱼类猎物的物种级鉴定率通常在10%到60%之间（例如Aguilar等人，2017年；Buckland等人，2017年；Smith & Link，2010年）。一般来说，胃内容分析中猎物鉴定的分辨率取决于多种因素，包括猎物状况（Buckland等人，2017年）、捕食者的进食方式以及猎物的处理方式（Scharf等人，1997年）以及涉及的猎物生命阶段（Carreon-Martinez等人，2011年）。在我们的研究中，长度约为100毫米或更短的Clupeidae通过视觉分析很少能被鉴定到物种水平，但通过DNA条形码技术可以可靠地鉴定到物种水平。总体而言，DNA条形码技术在提供Clupeid猎物的物种或属级鉴定方面表现出中等到高的成功率（68.2%），包括对于被归类为“充分消化”的样本，鉴定率超过60%。这与之前应用DNA条形码技术鉴定鱼类胃内容物的研究中的成功率相当（约60%-90%；Paine等人，2007年；Dunn等人，2010年；Valdez-Moreno等人，2012年；Paquin等人，2014年；Moran等人，2016年；Aguilar等人，2017年）。通过对179个样本进行DNA分析，物种或属级鉴定率提高了5倍（从12.3%提高到68.2%），这显著增加了关于生态多样性Clupeidae与海洋捕食者之间相互作用的食物网信息。将DNA分析提供的更高分辨率的猎物鉴定结果与视觉胃内容分析相结合，提高了我们研究中频率出现饮食指标的精确度和准确性。由于104个分类级别的改进，频率出现值从低分辨率重新分配到高分辨率的猎物分类。通过纠正三个物种鉴定错误（其中C. harengus在较小个体中因腹侧鳞片相似而被视觉鉴定为A. aestivalis），频率出现的准确性得到了提高（Able & Fahay，1998年；Fischbach等人，2023年）。虽然我们在这里仅评估了频率出现的变化（详见Falke等人，2024年的详细饮食分析），但类似的猎物鉴定改进效果预计也会体现在其他常用的饮食指标上，包括基于数值、质量和体积的估计以及结合猎物可用性的指标（Baker等人，2014年）。评估分子鉴定如何影响这些额外指标将为比较基于DNA的方法在饮食评估中的影响提供更坚实的基础。提高这些饮食指标的精确度和准确性对于参数化和验证现实的食物网和生态系统模型非常有价值（Livingston，1985年；Metcalf等人，2008年；Pethybridge等人，2018年）。结合形态学和分子方法可能是获得稳健饮食数据集和生态洞察的最有效方法，因为它可以选择性地平衡资源需求（例如时间、成本、专业知识）与不同方法提供的信息深度（Aguilar等人，2017年；Amundsen & Sánchez-Hernández，2019年；Berry等人，2015年；Casper等人，2007年；Oehm等人，2017年；Tollit等人，2009年；Traugott等人，2021年）。例如，Oehm等人（2017年）建议将颗粒分析（形态学分析）与分子猎物鉴定相结合，以研究食鱼鸟类的饮食，因为颗粒分析提供了全面的食物网信息，同时采样工作量较低，而DNA分析提供了最佳的猎物物种检测能力。如果在我们的研究之前（即2017年之前）就开始进行DNA分析，可以获得更多信息。尽管如此，由于未分类的Clupeidae（2017年至2022年所有底栖鱼类物种合计）的频率出现值减少了3倍，但在整合DNA分析后，饮食指标的质量有了显著提高。饮食信息的改进有助于澄清溯河性猎物鱼类在海洋食物网中的作用。虽然我们的DNA条形码工作主要集中在潜在的Alosa spp.猎物上，但在122个成功匹配的样本中只有23个被鉴定为Alosa spp.。大多数未分类的Clupeidae和未分类的Alosinae样本分别通过条形码技术鉴定为C. harengus和Brevoortia sp.。因此，在属级或物种级分类中，C. harengus（例如在M. bilinearis中）和Brevoortia sp.（例如在S. acanthias中）的频率出现值变化最大。然而，DNA分析提供了S. acanthias和U. chuss中Alosa spp.捕食的证据，这是视觉分析无法获得的。这些通过DNA确认的出现在Falke等人（2024年）的更大胃内容数据集中得到了评估，该数据集包括了2017年至2022年DNA条形码分析期间的2000多个胃样本。在这个更广泛的数据集中，即使结合了DNA条形码提供的改进的分类分辨率，Alosa spp.在所有捕食者物种中的频率出现仍然很低（<2%）。因此，这些结果与最近的研究一致，这些研究表明Alosa spp.在底栖鱼类饮食中的贡献较低（Falke等人，2024年；McDermott等人，2015年；Smith & Link，2010年；Willis等人，2017年）。Alosa spp.的当代饮食贡献较低可能与它们的数量下降有关，而历史上Alosa spp.的数量被认为是缅因湾底栖鱼类生产力的驱动因素（Ames，2004年；Ames & Lichter，2013年）。在美国东北大陆架的离岸区域，已经进行了数十年的鱼类胃内容采样（Link & Almeida，2000年），Alosa spp.在底栖鱼类胃中的百分比组成通常可以忽略不计（即0%-3%；Garrison & Link，2000年；Smith & Link，2010年）。然而，这些研究中鱼类猎物的分辨率往往较粗略，高达15%的饮食组成归因于未分类的Clupeidae，而更多的归因于“无法识别的鱼类”。McDermott等人（2015年）发现，在近岸水域，Alosa spp.与底栖鱼类的互动频率显著高于离岸采样区域，而Falke等人（2024年）认为，缅因湾近岸Alosa spp.在底栖鱼类饮食中的贡献较低，是因为它们相对于更丰富的鱼类猎物（主要是C. harengus和M. bilinearis）来说数量较少。尽管如此，自2012年开始近岸胃内容采样以来，Alosa spp.在底栖鱼类饮食中的频率出现值减少了3倍，这代表了在整合DNA分析后饮食指标质量的显著改进。饮食信息的改进有助于澄清溯河性猎物鱼类在海洋食物网中的作用。虽然我们的DNA条形码工作主要集中在潜在的Alosa spp.猎物上，但在122个成功匹配的样本中只有23个被鉴定为Alosa spp.。大多数未分类的Clupeidae和未分类的Alosinae样本分别通过条形码技术鉴定为C. harengus和Brevoortia sp.。因此，在属级或物种级分类中，C. harengus（例如在M. bilinearis中）和Brevoortia sp.（例如在S. acanthias中）的频率出现值变化最大。然而，DNA分析提供了S. acanthias和U. chuss中Alosa spp.捕食的证据，这是视觉分析无法获得的。这些通过DNA确认的出现情况在Falke等人（2024年）的更大胃内容数据集中得到了评估，该数据集包括了2017年至2022年DNA条形码分析期间的2000多个胃样本。在这个更广泛的数据集中，即使结合了DNA条形码提供的改进的分类分辨率，Alosa spp.在所有捕食者物种中的频率出现仍然很低（<2%）。因此，这些结果与最近的研究一致，这些研究表明Alosa spp.在底栖鱼类饮食中的当代贡献较低（Falke等人，2024年；McDermott等人，2015年；Smith & Link，2010年；Willis等人，2017年）。Alosa spp.的当代饮食贡献较低可能与它们的数量下降有关，而历史上Alosa spp.的数量被认为是缅因湾底栖鱼类生产力的驱动因素（Ames，2004年；Ames & Lichter，2013年）。在美国东北大陆架的离岸区域已经进行了数十年的鱼类胃内容采样（Link & Almeida，2000年），Alosa spp.在底栖鱼类胃中的百分比组成通常可以忽略不计（即0%-3%；Garrison & Link，2000年；Smith & Link，2010年）。然而，这些研究中鱼类猎物的分辨率往往较粗略，高达15%的饮食组成归因于未分类的Clupeidae，而更多的归因于“无法识别的鱼类”。McDermott等人（2015年）发现，在近岸水域，Alosa spp.与底栖鱼类的互动频率显著高于离岸采样区域，而Falke等人（2024年）认为，缅因湾近岸Alosa spp.在底栖鱼类饮食中的贡献较低，是因为它们相对于更丰富的鱼类猎物（主要是C. harengus和M. bilinearis）来说数量较少。因此，尽管缅因州最近的恢复工作增加了Alosa spp.的河口生物量（Stevens等人，2024年），但自2012年开始近岸胃内容采样以来，它们在底栖鱼类饮食中的持续低频率出现并不明显反映在生态系统层面的响应（Falke等人，2024年）。相比之下，最近对缅因湾大西洋蓝鳍金枪鱼Thunnus thynnus L.的胃内容分析提供了一些证据，表明与之前的研究相比，Alosa spp.在饮食中的比例有所增加（Nadeau等人，2025年）。结合针对性的DNA分析可以更精确地解决溯河性与海洋性Clupeidae的饮食贡献，从而提高饮食监测的敏感性，以检测Alosa spp.种群对未来生态系统变化的响应。能够测量消耗猎物的大小以及高分辨率的鉴定提供了额外的生态洞察，包括底栖鱼类与Alosa spp.生命阶段之间的相互作用，这是结合形态学和分子方法进行猎物鉴定的另一个主要好处（Garrido等人，2024年）。使用DNA鉴定的A. pseudoharengus和A. aestivalis的长度（TL）分别为75至116毫米和100至125毫米。根据A. pseudoharengus和A. aestivalis的耳石年龄（Stevens等人，2021年），这些大小最有可能对应于最近从淡水迁出的0龄或1龄个体，而不是返回淡水产卵的成年个体。理论上，消耗从淡水迁出的Alosa spp.表明了淡水系统和海洋系统之间的营养转移（Barber等人，2018年；Smith等人，2016年），而消耗成年Alosa spp.或海洋性Clupeidae则表明了主要在海洋生态系统内发生的营养转移。在胃内容中视觉区分溯河性和海洋性Clupeidae通常是不可能的，尤其是在样本处于幼体阶段时。在胃内容中视觉鉴定幼体或幼鱼通常仅限于消化后的前2小时（Legler等人，2010年；Schooley等人，2008年）。因此，Alosa spp.生活史中的季节性（例如幼体迁出）对近岸营养动态的影响可能在基于视觉方法的饮食信息中被掩盖。基于DNA的猎物鉴定为解决涉及幼体Clupeidae的营养相互作用提供了更精确的工具，有助于理解Alosa spp.在溯河流域到海洋连续体中形成的生态系统联系及其对生态系统变化的潜在响应（Hare等人，2021年；Ouellet等人，2022年）。最大化分子方法在猎物鉴定中的有效性（例如我们研究中的条形码成功率）是将其用于饮食研究的关键。与已知的基于DNA的饮食分析的局限性一致，我们研究中的条形码成功率反映了样本保存条件、消化状态和参考数据库质量的综合影响。我们的条形码成功率随着样本年龄的增加而显著下降，受消化状态的影响较小。观察到的条形码成功率随样本年龄增加而下降表明，样本在乙醇中的长期保存可能存在问题，以及DNA随时间的潜在降解。将样本保存在乙醇中是一种有效的DNA分析技术（Weber & Lundgren，2009年），但我们建议仔细考虑适当的乙醇质量（例如≥95%的浓度，最小程度的残留水或消化液稀释）和数量（即足够的乙醇体积以完全浸没样本，保持高乙醇与组织的比例）。为了提高条形码的成功率，建议在收集后尽快冷冻样本或提取DNA，而不是继续在乙醇中保存（Aguilar等人，2017年；Valdez-Moreno等人，2012年），但这些方法并不总是可行的。先前的研究关于消化状态对条形码成功率的影响报告了不同的结果（Aguilar等人，2017年；Berry等人，2015年；Moran等人，2016年；Paine等人，2007年；Paquin等人，2014年；Valdez-Moreno等人，2012年）。对于极度降解的样本（例如食糜、颗粒、骨头），DNA鉴定通常不太可能（Aguilar等人，2017年；Carreon-Martinez等人，2011年），但这些降解状态没有包括在我们的样本选择中。被归类为“充分消化”的样本的成功率仍然为中等到高（65%），但低于“新鲜”和“部分”样本（>83%），并且在后者类别的较大样本量下可能具有统计学意义。条形码成功率还可能取决于其他因素，如测序错误（例如错误的碱基调用）、污染（例如提取非目标DNA）、诊断基因选择或参考数据库质量（Antil等人，2023年；Berry等人，2015年；King等人，2008年；Leray等人，2013年；Sakaguchi等人，2017年）。例如，在我们的研究中无法将Brevoortia属物种进行精确鉴定，可能是由于参考数据库中的序列鉴定存在错误。在13个案例中，BOLD序列比对结果显示与两种Brevoortia物种（B. tyrannus和B. patronus）有匹配结果，而随后与史密森尼博物馆GenBank中的凭证标本（登录号：OP057013）进行的比对显示，与B. patronus的匹配度最高。然而，B. tyrannus是Brevoortia属中唯一已知分布范围与我们的研究区域重叠的物种。虽然通过引入分子证据显著增强了饮食信息，但进一步的改进将依赖于参考数据的持续完善。我们的研究强调了基于DNA的猎物鉴定方法在提高营养级信息质量方面的潜力，从而加深了对生态系统过程的理解，并指出了未来监测溯河鱼类作为海洋食物网中猎物角色的研究方向。将DNA分析与视觉猎物鉴定方法相结合，有效提高了对溯河鱼类和海洋鲱科鱼类在海洋底栖鱼类胃内容物中的分类学鉴定精度，从而更精确地量化了它们在饮食中的相对贡献。将靶向分子方法与传统的饮食评估方法（如胃内容物分析、脂肪酸分析或稳定同位素分析）相结合，可能是获得高质量食物网相互作用实证数据的最佳途径，同时平衡研究成本和项目目标。因此，基于DNA的饮食评估方法是提高支持渔业管理的生态系统模型实证可靠性的有效方法（Pethybridge等人，2018年；Traugott等人，2020年）。基于DNA的方法为饮食分析提供了更高的分类学分辨率，尤其是在需要更精细分类学分辨率的具体生态或管理问题时，与已建立的视觉方法结合使用尤为有用。基于DNA的饮食分析的资源需求因研究设计、测序方法和实验室基础设施而异；然而，随着基因组服务的不断扩展和测序成本的降低，其可用性正在提高。因此，是否采用分子工具应基于研究目标和资源限制来决定。我们的研究中显示的饮食信息改进特别有助于理解鲱科鱼类及其不同生命阶段的多样化生态角色（例如，发育过程中的栖息地利用、营养转移）。例如，基于个体的生态系统模型会结合生活史等特征来描述食物网动态，包括生态系统间的营养和能量交换（DeAngelis & Gross，1992年；Grimm & Railsback，2005年）。扩大基于DNA的溯河鱼类猎物鉴定范围将有助于更好地理解它们的营养生态学特性，包括它们作为其他海洋捕食者（如猛禽、鳍足类动物、鲸类）猎物的作用。这也有助于监测渔业对生态系统变化的响应，例如淡水恢复措施可能增加溯河鱼类的猎物基础（Hall等人，2012年），或者美国东北大陆架温度制度的快速变化可能改变物种分布（Friedland等人，2025年；Mills等人，2024年）。通过优化采样工作、保存方法、测序技术和参考数据库，改进DNA分析的资源和技术将有助于其在饮食研究中的应用。

**作者贡献**
所有作者共同构思了本文的思路。S.R.负责所有胃内容物处理和DNA提取的实验室工作，Y.L.解释了DNA测序结果，L.P.F.主导了数据分析和手稿准备，所有作者都对手稿进行了审阅和编辑。

**致谢**
我们感谢缅因州海洋资源部门的工作人员、F.V. Robert Michael号的船员、Christine Lipsky、Michael O’Malley、Mark Renkawitz、Brandon Ellingson、Graham Goulette、Ruth Haas-Castro、Julie Nieland和Justin Stevens在底栖鱼类胃内容物采样方面所做的贡献。