《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Effects of exogenous N-acyl-homoserine lactones on biofilm formation by denitrifying bacteria and denitrification start-up in sequencing batch biofilm reactors
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外源AHLs通过激活生物膜相关基因（lasI/rhlI）和反硝化基因（nirB/narG）协同促进生物膜形成与SBBR启动，100ng/L长链AHLs（C14-HSL/3-oxo-C12-HSL）使反硝化效率提升47%-49.65%，生物膜厚度增加1.9-2.1倍。
李志飞|余梦圆|李俊林|谢俊|程向军|龚旺宝|张凯|王广军|夏云|谢文平|钟全发|李红艳|田静静
中国水产科学院珠江渔业研究所热带与亚热带渔业资源应用与养殖重点实验室，广州510380
摘要
外源N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）能够有效促进生物膜的形成和反硝化作用。然而，以往的研究主要集中在单一类型的AHL上，对于多种类型AHL之间的差异调控机制研究严重不足。本研究系统地使用了结晶紫染色方法来筛选九种AHL对反硝化细菌生物膜形成的调控作用。通过序贯批式生物膜反应器（SBBR）实验，验证了所选AHL对生物膜反应器启动和反硝化效果的提升作用。结果表明，在反硝化细菌的生物膜形成实验中，与短链AHL相比，长链、低浓度的AHL（50-200 ng/L）具有更强的促进效果。在SBBR实验中，100 ng/L的3-氧代-C12-HSL和C14-HSL分别使NO??去除率提高了47.42%和49.65%，同时使生物膜厚度增加了1.9倍和2.1倍。长链AHL通过增加多种AHL合成基因（如lasI、rhlI）和反硝化基因（如nirB、narG）的表达，并增强EPS的分泌，从而促进生物膜的形成和反应器的启动。本研究证实，AHL对生物膜的调控作用受到其浓度和类型的共同影响，其中长链AHL表现出更强的优势，为水产养殖废水中氮去除的调控提供了新的策略。
引言
水产养殖提供了大量的高质量动物蛋白。然而，高密度和高营养输入的集约化养殖导致了水产养殖废水中严重的氮污染，这对自然淡水环境构成了巨大的污染压力，因此亟需解决这一问题[1]、[2]。生物膜能有效促进水中污染物的氮循环，是水处理系统的核心组成部分[3]、[4]。因此，生物膜技术已被广泛应用于生活污水以及工业和农业废水的处理。常用的生物膜工艺包括移动床生物膜反应器和序贯批式生物膜反应器（SBBR）[5]、[6]、[7]。反应器的效率在很大程度上取决于生物膜的形成，尤其是在初始附着阶段[8]。在此阶段，细菌经历一个持续的动态附着与脱离过程，这一现象被称为“可逆附着”阶段。这一过程一直持续到细菌进入最终的“不可逆附着”阶段，此时生物膜会稳定附着在载体上。在可逆附着阶段，细菌与载体之间的附着是不稳定且随机的，但它是生物膜形成的关键步骤[9]。因此，在处理水产养殖废水时，促进细菌的初始附着对于提高生物膜反应器的启动效率、加速生物膜形成和增强反硝化性能至关重要[10]。
生物膜的形成和反硝化受多种因素影响，其中包括N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）介导的群体感应（QS），它调控着生物膜的整个生命周期并起着核心调控作用[11]。在生物膜形成的初始附着阶段，AHL的浓度相对较低。当AHL浓度达到一定阈值时，可以调控QS相关基因的表达，从而促进生物膜的形成和结构稳定[12]、[13]。添加适量的外源AHL可以促使生物膜QS达到该阈值，激活并增强其调控功能，促进初始附着过程，影响胞外聚合物物质（EPS）的产量和组成，增强细菌与载体之间的附着[14]，从而促进生物膜的快速形成和结构稳定。然而，过高浓度的AHL会破坏QS系统的平衡，对细菌的代谢活性及其对AHL的响应产生不利影响，并抑制生物膜的形成[15]、[16]。先前的研究也证实了这一点。例如，Chen等人（2025年）[17]发现1000 ng/L的3-氧代-C14-HSL会降低膜生物反应器中的生物膜生长速率和EPS含量，Tang等人（2018年）[18]进一步验证了浓度超过500 ng/L的C12-HSL会抑制厌氧氨氧化菌的QS代谢。此外，不同类型AHL对生物膜系统的调控效果存在显著差异。Wang等人（2018年）[19]发现，JQ1004菌株在C8-HSL处理下会促进EPS的释放，而外源添加3-氧代-C10-HSL则会抑制EPS的产生。Hu等人（2022年）[20]发现，外源添加C12-HSL比C8-HSL更能提高异养硝化过程中不动杆菌属的生物膜活性和氨氮去除效率（提高了1.8倍）。因此，选择合适的AHL类型和浓度对生物膜的形成和反硝化至关重要。
尽管在水处理领域已经研究了外源AHL通过激活QS来增强生物膜反硝化的作用。Li等人（2024年）[21]发现3-氧代-C14-HSL通过调控胞外多糖的合成，使MBBR的总氮去除率提高了53.14%。Chen等人（2024年）[22]证实外源C14-HSL和C4-HSL增加了信号转导的丰度（分别提高了0.250% - 0.375%），增强了细胞运动性（分别提高了0.24%和0.21%）和生物附着（分别提高了0.044%和0.020%）。Zhang等人（2025年）[23]进一步拓展了亚硝酸盐介导的QS调控的新途径，实现了氮和磷的协同去除。然而，关于外源AHL促进生物膜形成的研究尚未形成系统的认识。当前研究体系中仍存在三个瓶颈：首先，现有研究主要集中在单一类型的AHL或间接QS激活剂上，缺乏对多种类型AHL的系统研究；其次，AHL的QS激活阈值存在争议，其浓度和功能的调控机制尚不清楚；第三，AHL调控生物膜群落结构演变和反硝化代谢功能的机制尚未明确。因此，本研究通过系统筛选多种类型和浓度的AHL，阐明了不同AHL对生物膜初始附着、结构和反硝化性能的差异调控机制，这对于克服现有单变量研究的知识局限具有重要意义。
本研究的目的是通过添加不同类型的AHL来加速生物膜的形成，缩短水产养殖废水处理生物膜反应器的启动时间，并提高氮去除效率。首先分析了生物膜形成指数（BFI），探讨了四种反硝化菌株在不同外源AHL调控下的初始阶段生物膜形成差异，从而填补了现有研究中关于单一类型AHL的系统性空白。通过分析每种菌株在不同浓度下的剂量-反应曲线，明确了AHL的“低促进高抑制”浓度效应规律和最佳调控阈值范围。在此基础上，选择了代表性的AHL和反硝化菌株进行SBBR实验；从生物膜微观特征、水处理效率以及宏基因组水平出发，分析了AHL对生物膜微生态结构及相关QS和氮代谢基因表达的调控机制，系统解释了AHL在生物膜形成和反硝化过程中的作用机制，为加速SBBR的启动和提高水产养殖废水处理效率提供了理论依据和技术手段。
部分摘录
微生物菌株和信号分子
本研究重点研究了四种常见的氮去除模式细菌，它们的QS机制受AHL调控，包括Pseudomonas stutzeri [24]、Paracoccus denitrificans [25]、Halomonas sp. [26]和Sphingomonas sp. [27]。这四种菌株是常见的好氧/兼性厌氧反硝化细菌，具有优异的反硝化性能和对水产养殖废水水质环境的良好适应性，是构建反硝化模型的经典菌株
通过细胞培养方法分析生物膜附着
采用结晶紫染色方法评估了九种AHL对四种反硝化功能细菌生物膜形成能力的影响。本研究旨在确定不同AHL对各种反硝化功能细菌的浓度效应，并为SBBR中的反硝化提供浓度参数。如图S1所示，在没有外源AHL的情况下，四种反硝化细菌的BFI存在显著差异，其中P. stutzeri
讨论
本研究系统探讨了多种类型和浓度的AHL对反硝化细菌生物膜形成及SBBR反硝化效率的调控机制，揭示了短链和长链AHL在定向促进生物膜形成和反硝化过程中的独特优势。为水产养殖废水中的生物膜调控提供了新的理论基础和技术指导。
结论
本文系统研究了不同类型/浓度的AHL对四种反硝化细菌生物膜形成的影响，旨在揭示优选AHL对生物膜形成和SBBR中氮去除的增强机制。研究表明，反硝化细菌对AHL的结构类型和浓度具有独特的选择性，其中长链分子（C14-HSL和3-氧代-C12-HSL）在100 ng/L浓度下最为有效
CRediT作者贡献声明
钟全发：方法学研究。李红艳：数据管理。李志飞：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目规划、方法学研究、资金获取、概念构建。夏云：验证、方法学研究。谢文平：可视化分析。王广军：验证、资源管理。龚旺宝：方法学研究。张凯：方法学研究。谢俊：验证、资源管理、概念构建。程向军：方法学研究。田静静：方法学研究。余梦圆：撰写 –
致谢
本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金（项目编号2023A1515012748、2021A1515011116）、国家自然科学基金（项目编号32473218）、集约化水产养殖池塘废水处理关键技术研究与应用项目（项目编号502022017）以及中央公益性科研机构基础研究基金（项目编号2022XT0503、2020TD58）的支持。我们感谢匿名
