普通亚硝化硫杆菌（Nitratidesulfovibrio vulgaris Hildenborough）对磺胺甲噁唑进行厌氧分解代谢转化的生理学特征研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Physiological characterization of anaerobic cometabolic transformation of sulfamethoxazole by Nitratidesulfovibrio vulgaris Hildenborough

　　摘要
磺胺类抗生素在医学和农业中得到广泛应用，其残留物会进入废水排放物以及作为肥料施用于农业中的固体中。这些残留物可能促进抗生素耐药性的传播，尤其是在活性污泥处理过程中。我们之前已经报道过一个概念验证实验，证明Nitratidesulfovibrio vulgaris Hildenborough（NvH）（以前称为Desulfovibrio vulgaris Hildenborough）能够在厌氧条件下转化磺胺类抗生素磺胺甲噁唑（SMX）。在此研究中，我们详细探讨了SMX对NvH生理的影响、不同电子供体对SMX转化的作用，以及转化产物（TPs）在厌氧和有氧条件下的稳定性。SMX的转化由静止细胞催化，且驯化细胞与未驯化细胞之间没有差异。较高的初始SMX浓度以及处于指数生长阶段的年轻菌株表现出更强的转化活性。在乳酸存在的情况下，SMX的转化得到促进；而当乳酸耗尽时，转化速率会减慢。当乳酸被H2和乙酸替代时，硫酸盐还原、细胞生长以及SMX转化仍能继续进行。SMX的存在并未改变关键分解代谢蛋白的表达模式。NvH将SMX转化为两种主要转化产物TP253和TP255，其中TP255被鉴定为SMX的还原形式，并在有氧条件下非生物降解为TP187，后者已失去完整的磺胺结构。我们的结果表明，SMX可以通过一系列厌氧微生物还原和有氧非生物降解过程进行转化，从而降低其持久性和耐药性传播潜力。

**关键点**
• Nitratidesulfovibrio vulgaris的细胞成分能够共代谢转化SMX
• 乳酸和H2作为电子供体可促进SMX的转化
• SMX不会导致NvH蛋白质组的显著变化

**引言**
全球对抗生素的高消耗量（Carvalho和Santos 2016；Klein等人2018；Van Boeckel等人2014）以及抗生素在污水处理厂（WWTPs）中的持久性，导致大量抗生素排放到环境中。污水处理厂的排放物中抗生素浓度范围从高ng L?1到中等μg L?1（Ben等人2018；Chenxi等人2008；Fal?s等人2016；Homem和Santos 2011；Kümmerer 2009a；Onesios等人2009；Verlicchi等人2012b）。这些浓度虽然低于抑制浓度，但仍有助于耐药细菌和耐药基因的传播（Banin等人2017；Kümmerer 2009a, 2009b；Rizzo等人2013；van Hoek等人2011；Zaman等人2017）。在畜牧业中，抗生素作为生长促进剂的使用占全球处方量的35–70%（Adler等人2018；Rosenblatt-Farrell 2009；Zhang等人2015）。这被认为极大地促进了耐药细菌和基因的扩散，预示着后有效抗生素时代的到来（Kraemer等人2019；Kümmerer 2009b；O’Neill 2014；Rosenblatt-Farrell 2009；WHO 2017；Zaman等人2017）。

磺胺甲噁唑（SMX）由一个氨基取代的苯环通过磺胺键连接到一个甲基化的异噁唑环上。SMX是畜牧业中最常用的抗生素之一，在制药工业废水（最高达1.3 mg L?1）、医院废水（最高达28 μg L?1）和市政废水（最高达0.9 μg L?1）中频繁检测到（García Galán等人2012；Huber等人2005；Verlicchi等人2012a；Xu等人2007）。此外，SMX还在饮用水（最高达12 ng L?1）（Al Aukidy等人2012；Kolpin等人2002；Morasch等人2010；Padhye等人2014）、河流和地下水（最高达11 μg L?1）（Cabeza等人2012；Dinh等人2011；García Galán等人2012；Gros等人2012；Kibuye等人2019）、牲畜粪便（最高达18 mg L?1）（An等人2015；Ghirardini等人2020；Hu等人2010）以及土壤（最高达400 μg kg?1干物质）（Grossberger等人2014；Hu等人2010）中被检测到。SMX甚至可以在作物中检测到（最高达100 μg kg?1湿重）（Christou等人2017；Franklin等人2016；Goldstein等人2014；Malchi等人2014）。

传统的活性污泥处理方法无法有效去除废水中的SMX（Kümmerer 2009a；Verlicchi等人2012a, b），实验室实验也证实了这一点（Benotti和Brownawell 2009；Cetecioglu等人2016；Gartiser等人2007；Joss等人2006；Li和Zhang 2010；Radke等人2009；Yang等人2011；Yu等人2011）。相比之下，厌氧处理在实验室实验中能够一致地去除80–100%的SMX（Alvarino等人2014；Aydin等人2015；Azimir等人2017；Carneiro等人2019；Chatila等人2016；Fan等人2019；Feng等人2017；Mohring等人2009）。不同的电子受体如硫酸盐（Jia等人2017；Mohatt等人2011；Ouyang等人2021）、硝酸盐（N?dler等人2012）、三价铁（Mohatt等人2011）或碳酸盐（Cetecioglu等人2013；Fal?s等人2016）可以在转化SMX的同时被微生物还原，但去除效率各不相同（Wang和Wang 2018）。

在硫酸盐还原条件下，已报道了较高的SMX生物转化率：在一个反应器中60%的SMX和60%的人类代谢物N4-乙酰-SMX被去除（Fal?s等人2016）；在土壤微宇宙中5天内超过95%的SMX被转化（Mohatt等人2011）；在实验室规模的红树林沉积物实验中100%的SMX被转化（Yang等人2018）；在发酵批次中100%的SMX被转化（Cetecioglu等人2013）。Jia等人（2017）报道了硫酸盐还原细菌在上升流污泥床反应器中对SMX的生物转化。他们提出了几种转化途径，其中大多数转化产物（TPs）的异噁唑环发生了改变或断裂。在我们之前的两项研究中，在富集的养猪场受污染土壤微宇宙（Ouyang等人2019）和富集的消化池污泥（Akay等人2024）中也发现了类似的SMX转化产物。在这两项研究中，我们发现TPs在SMX的苯胺和异噁唑部分发生了改变。此外，使用纯培养的Nitratidesulfovibrio vulgaris Hildenborough（NvH）进行的初步概念验证实验证明了SMX的转化，并提出了一条导致异噁唑部分还原的转化途径（TP255；中性质量255）和另一条导致噁唑环异构化的途径（TP253）（Ouyang等人2021；图1）。

**图1**
SMX、TP253（SMX异构体，异噁唑环重排）和TP255（二氢化异噁唑环）的化学结构、分子式和分子量（Ouyang等人2021）

N. vulgaris的特征已经非常明确（Heidelberg等人2004；Keller和Wall 2011；Pereira等人2011, 2008；Pieulle等人2005；Vita等人2015；Walker等人2009），NvH菌株的完整基因组也已测序（Heidelberg等人2004）。NvH利用细胞质底物氧化（乳酸、H2）和异化硫酸盐还原来产生质子动力，同时伴随着质子跨膜转运。文献中讨论了多种能量保存机制，包括基于H2的电子转移（Odom和Peck, 1981）、醌或甲基萘醌与膜结合的氧化还原酶复合物（Haveman等人2004；Pires等人2003, 2006）。此外，还讨论了一类I型四氢叶酸细胞色素c3酶（Typ I-c3）和基于富马酸的电子转移（Heidelberg等人2004；Huang等人2021；Tang等人2007；Voordouw 2002）。除了硫酸盐，NvH还能以硝酸盐、Fe(III)、U(VI)或Cr(VI)作为最终电子受体进行呼吸作用（Lovley和Phillips 1994；Lovley等人1993a, b）。NvH的基因组编码了叶酸生物合成途径中的蛋白质，包括二氢蝶呤酸合成酶，这是SMX抑菌作用的目标酶。

在这项研究中，我们使用NvH作为模型硫酸盐还原菌来研究SMX的厌氧转化，此前这种转化仅在富集的微生物群落中在硫酸盐还原条件下进行过研究。具体来说，我们探讨了SMX转化是否由细胞成分催化、是否支持微生物生长或属于共代谢过程，以及SMX和硫酸盐是否作为最终电子受体相互竞争。我们进一步评估了电子供体（乳酸、H2）对SMX转化的影响，并评估了NvH在含有SMX和H2加乙酸的培养基中与仅含乳酸的培养基相比蛋白质表达谱的变化。通过这些研究，我们旨在表征参与SMX转化的蛋白质，并理解这一过程的分子基础。此外，我们还研究了主要SMX转化产物（TP253、TP255）在厌氧-有氧条件下的稳定性，并探讨了次级非生物转化产物的形成和动力学。我们的目标是确定厌氧处理步骤是否能够增强水处理过程中SMX的降解效果。

**材料与方法**
**Nitratidesulfovibrio vulgaris Hildenborough（NvH）的培养**
Nitratidesulfovibrio vulgaris Hildenborough（以前称为Desulfovibrio vulgaris Hildenborough；DSM 644）从德国微生物和细胞培养物收藏中心（DSMZ）获得，为冻干培养物。该菌株在厌氧条件下转移并在无氧培养基中培养（Adrian等人1998），使用18 mM乳酸作为电子供体、21 mM硫酸钾作为电子受体，温度为30°C，黑暗环境中不进行摇动（文本S1）。培养基的组成见表S1–S4。10 mM NaHCO3缓冲的无氧培养基在培养前后的pH值分别为7.0和7.2，因此不应影响SMX的稳定性（SMX pKa1 = 1.6, pKa2 = 5.7）。每2–3周将培养物转移到新的无氧培养基中以维持活性菌株。除非另有说明，实验均使用3天龄的菌株作为起始接种物。通过600 nm处的光密度测量和荧光显微镜计数来评估生长情况（文本S2）。通过量化硫化物来评估分解代谢活性。

**转化实验设计**
研究NvH菌株厌氧条件下SMX转化的详细过程如下：向NvH细胞提供电子供体和电子受体，并使其暴露于SMX。为了更好地控制电子从供体到受体的流动并研究厌氧SMX转化的作用，我们分别使用人工和生理电子供体（甲基紫罗兰素、乳酸、H2）以及生理或潜在的电子受体（硫酸盐、SMX），并在不同浓度下进行实验。所有转化实验均在30°C、黑暗条件下重复三次进行，并监测表1中总结的参数。表1概述了包括实验设置、初始条件和监测参数在内的批次实验。

**数据统计**
所有监测参数的报告均采用三次测量的平均值和标准差。非生物对照组的显著变化通过重复测量双因素方差分析（无重复的两因素ANOVA）进行检验。使用混合效应模型（含和不含重复次数的斜率）来测试不同SMX或乳酸浓度对硫化物产生、细胞生长或SMX转化率的影响。所有统计分析的显著性标准设定为0.05（p值）。分析使用R（版本4.4.2）软件中的lme4和lmerTest包进行。

**SMX及其转化产物的定量**
SMX及其转化产物的浓度通过超高效液相色谱（UPLC）结合光电二极管阵列检测器（DAD）（Thermo Fischer UltiMate 3000 RS Diode Array Detector）和C18柱（LiChrospher 100，RP-18，末端封端，5 μM；Merck）进行测定（Ouyang等人2021）。SMX直接从经过无菌过滤的培养基（0.2-μm醋酸纤维素滤膜）中提取，样品体积为200-μL，置于1.5-mL玻璃小瓶中。每次测量注入10-μL样品，在269.5–270.5 nm波长下进行吸收测定。色谱分析的流速为0.6 mL min?1，梯度方法基于流动相（0.1%体积分数的甲酸，溶剂A）和甲醇（溶剂B）。梯度设置如下：0–2.0 min（5%溶剂B），1.25–8.0 min（5–98% B），8.0–10.0 min（98% B），10.0–17.0 min（98–5% B）。SMX的定量采用基于外部SMX校准标准的线性回归模型（R2 = 0.996）。由于鉴定出的转化产物中的UV活性氨基苯部分仍然完整，因此假设这些转化产物的吸收系数与SMX相同，从而采用相同的线性回归模型进行定量。检测限和定量限分别为100 nM和0.5 μM的SMX（或TPs）。通过Agilent 1260 Infinity II系列液相色谱系统（LC）与AB SCIEX QTRAP? 6500+串联质谱仪（MS/MS）联用，配备Turbo V离子源，对SMX厌氧微生物转化产生的TPs的转化产物进行了鉴定。该系统采用正极性的电喷雾离子化（ESI）模式进行操作。化合物分离使用Zorbax Eclipse Plus Rapid Resolution HT-C18柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm），并连接Phenomenex安全保护柱系统（C18；ODS，十八烷基）。进样体积为50 μL，柱温设定为30°C，流速为0.4 mL min?1。二元流动相由0.2%（v/v）甲酸的LC-MS级水和LC-MS级甲醇（溶剂B）组成。LC梯度程序如下：0–2 min（10%的B），2–3 min（10–60%的B），3–8 min（60–90%的B），8–11 min（90%的B），11.1–16 min（10%的B）。SMX和已知TPs的鉴定和结构验证的离子源依赖性MS参数在补充信息的文本S3中有描述。为了研究SMX TP的稳定性，将NvH培养实验结束时的样品和初始100 μM SMX通过0.2-μm孔径过滤器过滤以去除颗粒。滤液在200 rpm下进行30分钟的好氧振荡。将300 μL的氧化无细胞滤液在室温下分三次注入封闭的1.5-mL琥珀色玻璃小瓶中，并置于黑暗环境中。每个小瓶每天打开一次，持续30秒以进行气体交换。每个采样点都重复三次实验。

通过前体离子扫描来筛选未知TPs，该扫描产生典型的磺胺类碎片离子m/z 156。前体离子扫描与信息依赖性采集（IDA）标准结合使用，设定强度阈值为每秒50,000次计数，随后进行增强产物离子（EPI）扫描作为依赖性扫描。当检测到超过指定强度阈值的前体离子时，会触发EPI扫描以获取完整的MS/MS谱图。在MS2中获得的碎片用于结构解析。所有采集的数据均使用Analyst 1.7.1软件进行处理。

硫酸盐、硫化物、乳酸、乙酸和H2的测定使用Dionex DX-120离子色谱仪进行，配备Dionex RIFC IonPac AS4A-SC（4 × 250 mm）分析柱和Dionex RFIC IonPac AG4A-SC（4 × 50 mm）保护柱。流动相为4.5 mM Na2CO3和1.4 mM NaHCO3，流速为1 mL min?1，等度梯度时间为10分钟，硫酸盐的保留时间为4.60分钟。硫化物的定量通过在5 mM CuSO4和50 mM HCl中，样品与缓冲液的比例为1:5（v/v）下，使硫化物与铜反应生成胶体CuS后，使用Thermo光谱光度计UV-Vis（Evolution 160）在480 nm处测量吸光度进行。乳酸和乙酸的浓度通过UPLC-DAD（Thermo Fischer UltiMate 3000 RS二极管阵列检测器）测定，使用Rezex ROA-有机酸柱（H+ (8%); 150 × 7.8 mm; Phenomenex）和Rezex ROA-有机酸LC保护柱（H+ (8%), 流速为2.5 mM H2SO4，进样体积为10 μL，等度洗脱。吸收在210 nm处监测。所有化合物的校准均使用无氧水中的外部标准品进行，相关系数R2高于0.98。乳酸和乙酸的检测限分别为0.5和0.2 mM。

H2的消耗通过模拟压力传感器（MPX5100DP，NXP Semiconductors，荷兰埃因霍温）监测，在用纯H2气体过度加压后培养瓶内的顶空压力。模拟信号通过模数转换器（T7Pro，LabJack，美国）转换为数字信号。通过比较培养瓶内的顶空压力（以mV为单位）与加入相同顶空和液体体积的已知H2体积来量化H2（以mL为单位）。每次采样事件期间的空气压力和采样过程中顶空压力的损失都是预先确定的，并使用校正因子来计算量化的H2体积（以mL为单位）。水相中H2的名义浓度（mM）通过将H2量（以mmol为单位）除以液体体积来计算。

全细胞体外活性测定的生化基础如下：还原剂Ti(III)柠檬酸提供的电子按化学计量比传递给甲基viologen，形成自由基。这些自由基可作为NvH细胞的人工电子供体，用于还原性转化SMX。因此，全细胞体外活性测定是通过预先混合甲基viologen和Ti(III)柠檬酸至各1 mM来进行的，其中Ti(III)柠檬酸首先非生物地还原甲基viologen。最后，在2-mL玻璃小瓶中加入100 μM的SMX，以避免Ti(III)柠檬酸的非生物转化（表S4）。从指数生长阶段（3天龄）或稳定阶段（11天龄）培养物中通过三轮6000 × g离心和用200 mM磷酸钾缓冲液洗涤，收集浓缩的全细胞（1.5 × 10^9细胞/mL）。全细胞在无氧条件下加入反应混合物中，封闭的小瓶在30°C下黑暗中静态孵育。

使用鸟枪法蛋白质组学分析NvH菌株的粗提物。在培养第31天，从NvH细胞中收集细胞，进行色氨酸消化、衍生化、纯化，并在nanoHPLC系统（Dionex Ultimate 3000RSLC，Thermo Fisher Scientific，美国）上与Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）联用进行分析。该方法之前由Ding和Adrian（2020）描述过，但已在文本S4中进行了详细修改。6-μL注射样品中的肽在35°C下使用15-cm分析柱（Acclaim PepMap RSLC，3 μm × 250 mm，C18颗粒，Thermo Scientific）分离，流动相从4%的溶剂A（0.1%甲酸）到80%的溶剂B（80%乙腈，0.08%甲酸）的120分钟梯度下进行，流速为300-nL min?1。肽使用TriVersa NanoMate和Advion电喷雾离子源在正模式下离子化。前体离子在Orbitrap分析仪中以120,000的分辨率测量；碎片化在30%碰撞诱导解离下进行，碎片在离子阱中以30,000的分辨率测量。仅选择电荷状态在2到4之间的前体进行碎片化。蛋白质鉴定和统计分析使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Fisher Scientific，美国）进行，片段质谱（MS2）使用SequestHT搜索引擎与NvH的基因组编码蛋白质（NCBI访问号GCA_000195755.1）进行比较。蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库存放在ProteomeXchange Consortium中，数据集标识符为PXD068774，网址为https://doi.org/10.6019/PXD068774。比较蛋白质组学在两种不同生长的培养物上进行。蛋白质丰度比率基于每种培养物三次重复实验之间的成对比较计算。允许的最大蛋白质倍数变化设置为100，某些重复实验中缺失的肽信号通过基于重复实验的重新采样（从检测值的中位数周围抽取的随机值）进行插补。统计显著性使用基于背景的t检验和Benjamini-Hochberg校正（Benjamini和Hochberg 1995）计算，调整后的显著性阈值设置为0.05。

SMX的转化由NvH细胞的组分催化。使用指数生长阶段（3天龄细胞）或稳定阶段（11天龄细胞）的细胞进行了全细胞活性测试，其中还原型甲基viologen作为非生物电子供体，SMX作为电子受体（图2）。所有培养物都含有乳酸和硫酸盐。单独的还原型甲基viologen（无细胞对照，NCC）没有显著转化SMX。在全细胞存在还原型甲基viologen和SMX的情况下孵育产生了两种TPs（TP255，TP253），其m/z值分别为255和253。SMX向TP255（5.8 × 10^4 μAu × min）和TP253（4.3 × 10^3 μAu × min）的转化在30分钟采样点就已经明显，显示出生物转化的快速开始。到第4天，TP255和TP253的水平分别增加到2.2 × 10^5和4.5 × 10^4 μAu × min。SMX向TP255和TP253的转化依赖于NvH细胞的存在和生长阶段，指数生长阶段的细胞（3天龄细胞）显示出更快的SMX转化（图2）。在含有100 μM SMX的细胞和不含SMX的细胞之间，SMX转化速率没有显著差异。这些结果表明活性不是由SMX特异性诱导的（图2）。

全细胞体外活性测定的生化基础如下：来自还原剂Ti(III)柠檬酸的电子按化学计量比传递给甲基viologen，形成自由基。这些自由基可作为NvH细胞的人工电子供体，用于还原性转化SMX。因此，全细胞体外活性测定是通过预先混合甲基viologen和Ti(III)柠檬酸至各1 mM来进行的，其中Ti(III)柠檬酸首先非生物地还原甲基viologen。最后，在2-mL玻璃小瓶中加入100 μM的SMX，以避免Ti(III)柠檬酸的非生物转化（表S4）。从指数生长阶段（3天龄）或稳定阶段（11天龄）培养物中通过三轮6000 × g离心和用200 mM磷酸钾缓冲液洗涤收集浓缩的全细胞。全细胞在无氧条件下加入反应混合物中，封闭的小瓶在30°C下黑暗中静态孵育。

NvH菌株的粗提物使用鸟枪法蛋白质组学进行分析。在培养第31天，从NvH细胞中收集细胞，进行色氨酸消化、衍生化、纯化，并在nanoHPLC系统（Dionex Ultimate 3000RSLC，Thermo Fisher Scientific，美国）上与Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）联用进行分析。该方法之前由Ding和Adrian（2020）描述过，但已在文本S4中进行了详细修改。6-μL注射样品中的肽在35°C下使用15-cm分析柱（Acclaim PepMap RSLC，3 μm × 250 mm，C18颗粒，Thermo Scientific）分离，流动相从4%的溶剂A（0.1%甲酸）到80%的溶剂B（80%乙腈，0.08%甲酸）的120分钟梯度下进行，流速为300-nL min?1。肽使用TriVersa NanoMate和Advion电喷雾离子源在正模式下离子化。前体离子在Orbitrap分析仪中以120,000的分辨率测量；碎片化在30%碰撞诱导解离下进行，碎片在离子阱中以30,000的分辨率测量。仅选择电荷状态在2到4之间的前体进行碎片化。蛋白质鉴定和统计分析使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Fisher Scientific，美国）进行，片段质谱（MS2）使用SequestHT搜索引擎与NvH的基因组编码蛋白质（NCBI访问号GCA_000195755.1）进行比较。蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库存放在ProteomeXchange Consortium中，数据集标识符为PXD068774，网址为https://doi.org/10.6019/PXD068774。比较蛋白质组学在两种不同生长的培养物上进行。蛋白质丰度比率基于每种培养物三次重复实验之间的成对比较计算。允许的最大蛋白质倍数变化设置为100，某些重复实验中缺失的肽信号通过基于重复实验的重新采样（从检测值的中位数周围的分布中抽取的随机值）进行插补。统计显著性使用基于背景的t检验和Benjamini-Hochberg校正（Benjamini和Hochberg 1995）计算，调整后的显著性阈值设置为0.05。

SMX的转化由NvH细胞的组分催化。使用指数生长阶段（3天龄细胞）或稳定阶段（11天龄细胞）的细胞进行了全细胞活性测试，其中还原型甲基viologen作为非生物电子供体，SMX作为电子受体（图2）。所有培养物都含有乳酸和硫酸盐。单独的还原型甲基viologen（无细胞对照，NCC）没有显著转化SMX。在全细胞存在还原型甲基viologen和SMX的情况下孵育产生了两种TPs（TP255，TP253），其m/z值分别为255和253。SMX向TP255（5.8 × 10^4 μAu × min）和TP253（4.3 × 10^3 μAu × min）的转化在30分钟采样点就已经明显，显示出生物转化的快速开始。到第4天，TP255和TP253的水平分别增加到2.2 × 10^5和4.5 × 10^4 μAu × min。SMX向TP255和TP253的转化依赖于NvH细胞的存在和生长阶段，指数生长阶段的细胞（3天龄细胞）显示出更快的SMX转化（图2）。在含有100 μM SMX的细胞和不含SMX的细胞之间，SMX转化速率没有显著差异。这些结果表明活性不是由SMX特异性诱导的（图2）。

图2：使用还原型甲基viologen作为电子供体的全细胞体外活性测定中NvH细胞对SMX的转化及TP255和TP253的产生。初始SMX浓度为100 μM，测试中的细胞密度为1.5 × 10^9细胞/mL。图中显示了无细胞对照（NCC）（不含NvH细胞）以及接种了不同生长阶段培养物的小瓶：含有100 μM SMX的11天生长（适应），不含SMX的11天生长（未适应），不含SMX的3天生长（未适应）。

SMX浓度和培养阶段对SMX转化的影响。使用来自稳定阶段（14天龄培养物）的NvH细胞的初步实验表明，含有100 μM SMX、18 mM乳酸和20 mM硫酸盐的培养物能够将硫酸盐按化学计量比还原为硫化物。SMX减缓了细胞的生长，但并未完全抑制它（图S1）。因此，我们更详细地研究了不同浓度的SMX（从50到650 μM）对添加了18 mM乳酸和20 mM硫酸盐的稳定阶段培养物的影响。我们选择了一个高于大多数报道的环境浓度的浓度范围，以便更好地识别SMX TPs并诱导更大的蛋白质表达谱差异。蛋白质表达谱被用来识别NvH细胞内的SMX转化蛋白。在所有测试的SMX浓度下，硫酸盐和SMX都发生了转化。根据SMX浓度，在28天的孵育时间内，有50%到82%的初始SMX发生了转化（图3a）。在无接种物的对照瓶（NCC）中，SMX没有发生转化。在所有瓶子中，绝对转化率随时间减少，且在22天的孵育后几乎没有进一步的SMX转化（图3a；图S2）。对于初始转化的350到650 μM SMX，应用了一阶反应动力学（表S5）。然而，SMX的转化依赖于硫酸盐的还原，并在12天后停滞。此外，对于350到650 μM SMX的培养物，标准化的SMX转化率显示出与初始SMX浓度无关的相似相对转化率（图S3）。无论是硫酸盐还原为硫化物还是SMX的转化，都没有被高达650 μM的SMX浓度完全抑制。然而，SMX减缓了NvH的生长，这从不含SMX的对照瓶（无SMX对照，NSC；图3c）中更强的细胞生长可以看出。总体而言，SMX对生长有强烈的抑制作用，但对硫酸盐还原为硫化物的影响不显著（p = 1.00）（图3b）。含有100 μM SMX的培养物在细胞密度上没有显著差异（p = 0.96）。对于含有100 μM SMX、18 mM乳酸、20 mM硫酸盐以及来自指数生长阶段的接种物的培养物（3天龄培养物），生长和硫酸盐还原都更快，硫化物水平在4天后达到最大值（图4）。在稳定阶段缓慢下降的硫化物水平可以通过频繁采样期间的硫化物损失来解释。SMX的转化在最初的4天内产生了几乎等量的TP255和TP253。之后，SMX向TP255的转化持续进行，而TP253的形成几乎停滞。生长与硫化物的产生相关，但即使在硫化物浓度达到最大值后，生长仍然缓慢。在含有100 μM SMX和8 mM硫化物的硫化物对照中，没有观察到SMX转化，用于测试潜在的由硫化物催化的非生物SMX转化。鉴于生长阶段影响SMX转化，除非另有说明，本研究中描述的所有后续培养物都使用了来自指数生长阶段的细胞进行接种。

图3：不同SMX浓度对NvH生理的影响。NvH培养物接种了含有18 mM乳酸、20 mM硫酸盐和不同初始浓度SMX的细胞。图中显示了随时间变化的SMX浓度，b为硫化物浓度，c为细胞密度。实验中包括了没有细胞但含有SMX的对照组（NCC，呈蓝绿色）以及有细胞但不含SMX的对照组（NSC，呈绿色）。初始细胞密度为1.1×10^6个细胞/毫升，除了NCC组未观察到细胞（线条重叠）。图4为全尺寸图像，展示了NvH培养过程中TPs的形成过程，以及作为硫酸盐还原指标的SMX转化和硫化物生成情况。培养基中含有18毫摩尔乳酸、20毫摩尔硫酸盐，以及处于指数生长阶段的细胞（培养3天后）。图中显示了a) SMX和TPs的浓度，b) 硫化物的浓度，以及c) 细胞密度。所有培养物的初始细胞密度均为1.8×10^6个细胞/毫升。

接下来，在底物限制条件下确定了乳酸消耗、硫酸盐还原和SMX转化之间的化学计量关系。所有培养物中都添加了100微摩尔的SMX，这不应抑制处于指数生长状态的接种培养物。为了避免积累的硫化物产生毒性作用，我们选择了8毫摩尔的硫酸盐进行长期培养。根据乳酸与硫酸盐的化学计量比2:1，我们调整了培养物中的乳酸浓度在8至40毫摩尔之间，以使乳酸或硫酸盐其中一种过量。

在培养6天后，观察到了两种TPs（TP255和TP253）（见图5）。首先在8毫摩尔乳酸的培养物中SMX转化速度减慢（第21天），随后在16毫摩尔乳酸的培养物中也出现了这一现象（第32天）。同时，两种培养物中的乳酸都变得有限（第4天时乳酸浓度为0；数据未显示）。每个细胞的SMX转化率与初始添加的乳酸浓度无关（p=1），但在第7至13天之间转化率最高，之后再次下降（见图S4）。由于最低细胞密度的标准偏差最大（p=1），因此认为第0至1天的高初始SMX转化率不具有统计学意义，故未进一步分析（见图S4）。到第149天时，8毫摩尔乳酸培养物中的SMX浓度下降了21%，16毫摩尔乳酸培养物下降了72%，24毫摩尔乳酸培养物下降了87%，32毫摩尔乳酸培养物下降了88%，40毫摩尔乳酸培养物下降了89%。在培养初期，TP255和TP253的生成量大致相等。然而，在培养约15天后，TP255的生成量占主导地位，而TP253的生成几乎停止。这导致培养结束时TP255与TP253的比约为4.3。由于储存样本中TP255信号减弱，因此第40至83天以及第98至149天的数据点未被纳入分析（见图5）。不过，整个实验过程中TP255的生成趋势得到了确认。

图5为全尺寸图像，显示了在8至40毫摩尔乳酸浓度下，NvH将SMX（红色）转化为TP255（绿色）和TP253（黄色）的过程。所有培养物中都含有8毫摩尔硫酸盐和100微摩尔SMX。对照组包括NCC（蓝色）和硫化物对照组（紫色）。在第149天（垂直黑色虚线），8毫摩尔乳酸培养物中额外添加了16毫摩尔乳酸，16毫摩尔乳酸培养物中添加了0.3巴H2（名义浓度32毫摩尔），40毫摩尔乳酸培养物中添加了8毫摩尔K2SO4。第40-78天和第98-179天的样本分别在4°C和-20°C下有氧储存最多4周后进行分析，而其他样本则在取样后立即进行测量。

在所有培养物中，监测了细胞生长、乳酸、乙酸和硫化物的含量，结果显示SMX培养物与NSC培养物之间没有差异（见图S5）。到第149天时，8毫摩尔或16毫摩尔初始乳酸的培养物中未检测到乳酸，但仍然存在硫酸盐。为了确定额外电子供体的影响，我们在8毫摩尔乳酸培养物中额外添加了16毫摩尔乳酸，并在初始乳酸浓度为16毫摩尔的培养物中加入了0.3巴H2（名义浓度32毫摩尔）。在初始乳酸浓度为40毫摩尔且硫酸盐已被消耗的培养物中（见图S5C），第149天额外添加了8毫摩尔硫酸盐。随后75天的分析表明，向8毫摩尔乳酸培养物中添加乳酸促进了SMX转化和硫酸盐还原（见图S5G）。相反，向16毫摩尔乳酸培养物中添加H2没有明显效果。向40毫摩尔乳酸培养物中添加硫酸盐进一步促进了SMX转化和硫酸盐还原，相比16至32毫摩尔乳酸培养物效果更明显。总之，以乳酸作为电子供体的硫酸盐还原促进了SMX转化。对于质量平衡的计算，假设SMX和两种TPs具有相同的紫外吸收系数，因此采用了相同的线性回归模型进行定量分析。在40毫摩尔乳酸培养物中，初始100微摩尔SMX中有99%发生了转化；然而，仅检测到约54微摩尔TP255和14微摩尔TP253，占转化SMX的65%。在229天的培养时间内，对照组中未观察到显著的SMX转化或TPs生成。NCC和硫化物对照组中观察到的SMX浓度统计学上显著但总体较小的下降（p<0.05）可以忽略不计，因为其对应于初始SMX浓度的减少不到5%。相比之下，生物培养物中的SMX转化率在40%到99%之间。此外，对照组中未检测到TPs（数据未显示）。

据报道，NvH能够利用H2作为电子供体，乙酸作为碳源，以4:1的化学计量比进行硫酸盐的代谢还原（Keller和Wall 2011；Pereira等人2011；Vita等人2015）。在实验前，我们用32毫摩尔H2（名义浓度）、2毫摩尔乙酸和8毫摩尔硫酸盐培养了NvH多个周期。通过将预培养的H2细胞接种到含有100微摩尔SMX、8毫摩尔硫酸盐、32毫摩尔H2以及16毫摩尔乳酸（SMX-Sul-H2-La）或4毫摩尔乙酸（SMX-Sul-H2-Ac）的培养基中，测试了NvH在H2存在下的SMX转化能力。实验中还包括了NCC（无NvH细胞）和NSC（无SMX）对照组（见图6）。

图6为全尺寸图像，展示了从指数生长阶段接种并在乙酸、H2和硫酸盐条件下生长的NvH培养物。图中显示了a) SMX转化为TP255和TP253的情况，b) 作为硫酸盐还原活性指标的硫化物生成，c) 以OD600表示的细胞生长，以及d) 基于顶空压力的H2消耗情况。包括NCC、NSC以及进一步用8毫摩尔硫酸盐、32毫摩尔H2和4毫摩尔乙酸（SMX-Sul-H2-Ac）或16毫摩尔乳酸（SMX-Sul-H2-La）培养的两种SMX培养物。起始细胞密度为1.2×10^6个细胞/毫升。“之前”和“之后”指的是在第21天额外添加了8毫摩尔硫酸盐、32毫摩尔H2和4毫摩尔乙酸的情况。

SMX在SMX-Sul-H2-La和SMX-Sul-H2-Ac培养物中都转化为具有还原异噁唑环的TP255和作为SMX异构体的TP253，但在无细胞对照组（NCC）中则没有转化。然而，SMX-Sul-H2-La培养物的SMX转化速度更快，转化量也更多（初始100微摩尔SMX的34%），而SMX-Sul-H2-Ac培养物中则没有额外添加乳酸（转化量为14%）（见图6a）。我们使用相同的回归模型对SMX和两种TPs进行了质量平衡计算。对于SMX-Sul-H2-La培养物和转化了34毫摩尔SMX的情况，我们检测到16毫摩尔TP255和3毫摩尔TP253，总计18毫摩尔（占转化SMX的55%）。对于SMX-Sul-H2-Ac和转化了14毫摩尔SMX的情况，我们仅检测到3.9毫摩尔TP255，未检测到TP253。SMX-Sul-H2-La培养物中的硫化物生成、细胞生长和H2消耗量均低于SMX-Sul-H2-Ac培养物和无SMX对照组（NSC）（见图6d）。这可能是由于接种物在H2和乙酸上培养了多代所致。计算出的H2消耗量在NSC和SMX-Sul-H2-Ac培养物中相当高（约29毫摩尔H2），但在添加了16毫摩尔乳酸作为额外电子供体的SMX-Sul-H2-La培养物中较低（约19毫摩尔H2）。图S6显示了用于计算NvH H2消耗量的顶空压力。第21天添加32毫摩尔H2、4毫摩尔乙酸和8毫摩尔硫酸盐进一步促进了两种电子供体培养物中的硫化物生成，但并未促进细胞生长或进一步的SMX转化。

通过鸟枪蛋白组学技术，我们检测到了参与乳酸或H2氧化、电子传导和异化硫酸盐还原的关键分解代谢蛋白（见表S5）。在乳酸氧化途径中，我们检测到了L-乳酸脱氢酶（LdH）、L-乳酸渗透酶（LtP）、乙酸激酶（AckA）、甲酸脱氢酶（FdhB/D/E）和丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PorA/B）。在H2氧化途径中，我们检测到了膜结合的细胞质定向能量转化氢化酶（EchA/C/D/E/F）、高分子量细胞色素（HmcA/B/C/F）、氢化酶成熟蛋白（HypA1/A2/D/E）、胞质[Fe]氢化酶（HydA/B）、胞质[NiFe]氢化酶（HynA-1/2）和胞质[NiFeSe]氢化酶（HysA/B）。参与异化硫酸盐还原的蛋白包括腺苷硫酸盐还原酶（AprA/B）、硫酸腺苷转移酶（Sat）、硫酸渗透酶（SulP）和异化亚硫酸盐还原酶（DsrA/B/C/D/J/K/O/P）。参与电子传递的蛋白包括细胞色素c、电子传输复合体（RnfB/C/E/G）、甲基醌还原酶（QrcB/C/D）以及一些铁硫簇结合蛋白和铁氧还蛋白（见表S5）。在以乳酸而非H2作为电子供体的培养物中，乳酸渗透酶（LtP, dvu3026）的表达显著增加，这是预期之中的。

我们对添加了SMX的NvH与未添加SMX的NvH进行了比较蛋白组学分析，以确定特定诱导的蛋白。为此，我们设置了在乙酸和H2上培养的NvH培养物，并添加了100微摩尔SMX，然后比较了蛋白丰度（SMX-Sul-H2-Ac vs. NSC；见图7）。这里，我们将蛋白丰度增加定义为SMX培养物中的蛋白丰度高于对照组，反之则为降低。大多数蛋白的丰度变化不超过2倍（p≥0.05）。丰度变化超过1倍的蛋白大多不参与关键的分解代谢过程，而是涉及不同的细胞机制。例外的是腺苷硫酸盐还原酶亚基β（AprB，由dvu0846编码）、胞质[Fe]氢化酶的小亚基（HydB，由dvu1770编码）和铁硫簇结合蛋白，这些蛋白的丰度变化和显著性最高（见图7）。无论是否添加SMX，两种培养物产生的硫化物量相似，表明AprB的降低并未显著影响硫酸盐向硫化物的分解代谢（p>0.05）。同样，胞质[Fe]氢化酶HydB（由dvu1770编码）也是如此，据报道它在H2吸收过程中参与电子传递链，细胞色素c3可能是生理上的电子载体（Keller和Wall 2011；Pereira等人2011，2008；Pieulle等人2005；Vita等人2015；Walker等人2009）。尽管SMX降低了HydB的丰度，但两种培养物的H2消耗量相似。相比之下，铁硫簇结合蛋白（由dvu0908编码）的丰度显著降低，但其潜在的电子传递作用尚不清楚。

图7为火山图，显示了在添加了或未添加100微摩尔SMX的乙酸和H2培养物中NvH的蛋白丰度差异（SMX-Sul-H2-Ac vs. NSC）。x轴表示蛋白丰度比（SMX-Sul-H2-Ac/NSC）的对数2（倍数变化）。突出显示了丰度降低（绿色）或增加（红色）的蛋白，其log2（倍数变化）低于或高于-1或1，符合设定的显著性标准（p值≤0.05）。进一步讨论的候选蛋白也用绿色或红色标出。

同样，在添加了SMX的培养物中，大多数蛋白的丰度增加不超过2倍，尽管差异具有统计学意义（p≤0.05）。一种铁硫簇结合蛋白（由dvu3350编码）显著增加，但仅在另一种Nitratidesulfovibrio vulgaris菌株中被注释。因此，它被标注为2-氧戊二酸铁氧还蛋白。然而，该蛋白在NvH代谢中的确切电子传递作用仍不清楚。其他一些显著增加或降低的蛋白，如超氧化物歧化酶（由dvu2410编码）（Dos Santos等人2000）或硫氧还蛋白（由dvu1839编码）（Valette等人2017），可能与NvH细胞的普遍应激反应有关。

在厌氧NvH培养物中，TP255和TP253在数月的培养过程中保持稳定。然而，当这些培养物在+4°C或-20°C的氧化条件下储存时，观察到TP255随时间缓慢减少（数据未显示）。我们在之前的研究中证明，厌氧条件下形成的SMX TPs（包括TP255和TP253）会在有氧微生物或氧化非生物条件下进一步转化（Akay等人2024）。在这里，我们希望更详细地评估TP255和TP253在经过过滤灭菌的样品中的氧化稳定性。我们进行了每小时一次的采样，这有助于描述非生物转化的动力学过程，并且还评估了这些化合物是否可能自发地重新转化为SMX。在35天的氧化条件下培养过程中，SMX和TP253的信号几乎保持不变（图8），而TP255的信号随时间逐渐减弱，在非生物培养4小时后就已经明显可以看出。35天后，97%的TP255信号消失了。同时，在UPLC-DAD检测中观察到了几个强度低于SMX、TP255和TP253的峰（图S7），其中最大的峰（m/z = 188，TP 187）的保留时间（Rt）为4.44分钟。使用前体离子扫描和IDA触发的增强产物离子（EPI）扫描在LC-QTRAP-MS/MS上对TP187进行碎片分析（保留时间 = 2.0分钟；m/z = 188），得到了几个主要碎片，其m/z值分别为156、108、93和80（图S8、S9）。这些碎片以及270纳米处的紫外吸收（图S7B）表明TP187含有SMX的苯磺酸芳香环结构，但不含异噁唑环。UPLC-DAD信号强度的差异表明，要么TP255没有按化学计量比转化为TP187，要么TP187的吸收系数较低。此外，在培养开始时样品中就已经存在少量的TP187。TP255的非生物转化遵循一级动力学（R2 = 0.985；图S10），一级反应常数kTP255和环境半衰期（pH 8.0，室温）分别为0.107天^-1和6.5天。

图8：SMX、TP255和TP253在氧化条件下的非生物培养。50 μM SMX（代表培养后剩余的未转化SMX）以及从最初含有100 μM SMX的NvH厌氧培养物中获得的300 μL无细胞培养滤液中的TP255/TP253在270纳米处的光度吸收。图中还显示了在氧化条件下形成的主要峰TP187的数值。所示的化学结构是根据它们的质量和母体化合物推断出来的，蓝色部分表示结构变化区域。

讨论：
**共代谢SMX转化**
对照组（NCC，硫化物对照组）中缺乏显著活性，这表明观察到的SMX转化来源于厌氧批次培养期间细胞的活性（图4）。因此，我们得出结论，NvH对SMX的转化是一个生物介导的还原过程，遵循一级反应动力学，且硫酸盐不是限制因素（图3a；表S5）。这一过程导致SMX转化为两种主要产物TP255和TP253（图5）。TP255是SMX的还原形式，而TP253是SMX的异构体产物，其异噁唑环被转化为噁唑环。对于相似的细胞密度（图5；图S4）和每个细胞相似的SMX转化活性（图S3），增加电子供体浓度促进了SMX的转化。我们认为SMX在NvH细胞上的吸附可以忽略不计（Ouyang等人，2021年）。SMX的log Kow值低于1，培养期间的pH值在7.0到7.2之间，因此SMX处于阴离子状态（pKa2 = 5.7），导致其不易吸附到带负电的NvH细胞上。先前的实验也表明，SMX在富集的细菌培养物（来自沉积物或污泥）中的吸附可以忽略不计（Ouyang等人，2021年）。此外，SMX的消耗与产物的形成同时发生（例如，图5），因此SMX的减少主要是由于生物转化。
SMX的转化没有明显的滞后阶段，无论是使用经过SMX驯化的3天旧菌种还是使用在乳酸和硫酸盐上生长的未驯化细胞（图2）。因此，SMX的存在似乎不会诱导特定催化SMX转化的酶的表达。我们的霰弹枪蛋白质组学分析比较了在含有和不含SMX的H2-乙酸-硫酸盐培养物中的细胞（图7），结果表明SMX没有显著上调关键分解代谢蛋白的表达。虽然有几个蛋白质候选物上调或下调，但这些蛋白质并不被认为是NvH中的关键能量转化酶（Heidelberg等人，2004年；Keller和Wall，2011年；Venceslau等人，2014年）。值得注意的是，一旦硫酸盐耗尽，SMX的转化就会停止或显著减缓，这支持了SMX可能是通过硫酸盐还原机制的还原中间体进行共代谢转化的假设。这些中间体可能是蛋白质，如异化亚硫酸盐还原酶、二硫化物蛋白DsrC（Barbosa等人，2024年；Venceslau等人，2014年）或还原型铁氧还蛋白或其辅因子。然而，蛋白质组学数据没有提供关于这些蛋白质或化合物的具体信息（图7）。此外，我们的实验也不能排除SMX的代谢转化，因为在相对较低的SMX浓度下，细胞的轻微生长或蛋白质表达可能逃过了我们的检测。关于硫酸盐还原的生物能量学仍有许多未解之谜（Barbosa等人，2024年），而SMX的还原可能是一种有趣的生化转化活动。
SMX的厌氧转化具有生物技术意义，因为SMX在氧化条件下通常是稳定的，因此在污水处理厂的出水中经常被检测到（Kümmerer，2009a；Verlicchi等人，2012a，b）。此外，在暴露于硫酸盐还原和产甲烷条件下的污水处理厂污泥中，也可以检测到并部分转化SMX（Akay等人，2024年；Fal?s等人，2016年；Jia等人，2017年；Mohatt等人，2011年；Ouyang等人，2021年；Yang等人，2018年；Zhang等人，2013年）。为了减少污水处理厂出水中SMX的负荷，对废水进行厌氧处理不仅可以回收甲烷作为能源（McCarty等人，2011年），还可以转化SMX和其他适合初级厌氧转化的化合物（Akay等人，2024年）。SMX转化为TP255和TP253的毒理学意义需要进一步研究，但初步结果表明抗生素效应有所减弱（Ouyang等人，2021年）。

**SMX转化与乳酸或H2氧化的耦合**
培养中的主要反应是两摩尔乳酸氧化为大约两摩尔乙酸，或者四摩尔H2与乙酸作为碳源氧化，同时一摩尔硫酸盐还原为硫化物。因此，可以通过控制电子供体、电子受体或碳的添加量，使培养物中乳酸/H2或硫酸盐过量。我们假设乳酸和H2的氧化与SMX转化直接相关，并且通过增加乳酸浓度可以增强这一过程。即使在培养物进入并大部分时间处于稳态阶段（第4-149天）（图5和图6），这种关系仍然存在。因此，当乳酸限量但硫酸盐仍然过量时（见8 mM乳酸培养物），SMX转化在硫化物生成后停止（图5和图S4G）。在乳酸过量（24-40 mM）而硫酸盐限量时，即使硫酸盐耗尽后，SMX仍会继续转化，但速率大大减慢。
SMX转化仅发生在有电子供体存在并且某个时刻发生了活跃的硫酸盐还原的培养物中。因此，可以推断负责乳酸氧化或硫酸盐还原的酶在硫酸盐耗尽后仍然对SMX起作用（图5）。尽管在SMX-Sul-H2-Ac培养物中细胞密度更高且硫化物产量更高，但在SMX-Sul-La培养物中转化的SMX更多（图6）。这表明乳酸不仅是首选的生理电子供体（Vita等人，2015年），而且乳酸比H2更能促进SMX的还原。此外，使用乳酸作为电子供体和碳源时，转化为TP255和TP253的SMX比例更高（55-65%），而使用氢-乙酸时这一比例为27%。估计的质量平衡表明可能存在未知的转化产物，或者现有的回归模型不适用于SMX和TP255/TP253。

**厌氧形成的TP255在氧化条件下的不稳定性**
NvH从SMX形成的主要厌氧产物TP255在氧化条件下不稳定，在30°C和pH 8.0的条件下培养35天内几乎完全在水中分解（图8）。这表明在SMX的厌氧预处理转化为TP255后，随后在活性污泥处理过程中TP255会在氧化条件下分解（Akay等人，2024年）。与TP255不同，SMX和TP253在氧化条件下是稳定的。这可能是因为它们的氧化状态更高，且含有稳定的异噁唑/噁唑环（Zhang等人，2023年）。TP255在氧化条件下的半衰期为6.5天（kTP255 = 0.107天^-1，图8），比本研究中NvH生物转化100 μM SMX的50%所需的时间（约40天，图5）快六倍以上。TP255在（脱）质子化基团上没有发生化学变化；因此，只要pH值远高于SMX的pKa2（5.7），我们就不会怀疑其在氧化条件下的稳定性会改变。文献中报道了不同的SMX半衰期：适应有氧细菌培养物的半衰期为9-99天（Baumgarten等人，2011年；Gauthier等人，2010年；Reis等人，2014年），地表水的半衰期为52天（Prasannamedha和Kumar，2020年），厌氧条件下的土壤样品为15-18天（Lin和Gan，2011年），以及大规模地表水微宇宙研究的半衰期为19天（Lam等人，2004年）。相比之下，本研究中TP255的半衰期明显短于上述研究。因此，NvH将SMX转化为TP255导致其在环境中的持久性降低，自然衰减效果更好（Akay等人，2024年；Zhang等人，2023年）。LC-QTRAP-MS/MS质谱显示TP187（TP255的非生物分解产物）包含高强度碎片m/z 92、108和156（图S10），表明其苯磺酸结构保持完整（Akay等人，2024年）。尽管如此，作为SMX生物活性中心的磺酰胺键被断裂，可能导致生物活性降低（Ouyang等人，2021年；Zhang等人，2023年），并且与母体化合物SMX相比，抗生素抗性的传播能力减弱（Zhang等人，2023年）。

**总结**
总体而言，NvH的整个细胞通过共代谢和还原作用将SMX转化为硫酸盐，同时结合了乳酸或H2-乙酸代谢与硫酸盐还原。年轻细胞中的SMX转化速率更高，并受初始SMX浓度的影响；然而，这一过程与是否预先适应SMX无关。生物形成的TP255在氧化气氛中不稳定。这强调了厌氧预处理（此处为硫酸盐还原条件）对受微污染物污染的水体的适用性，以便使这些顽固的水成分更容易接受后续的有氧处理（例如，传统的活性污泥处理）。厌氧预处理和随后的氧化条件增加了SMX的自然衰减潜力，还有助于避免TPs重新转化为母体化合物（如文献中所报道的）。因此，SMX对抗生素抗性传播的贡献可能会减少。总的来说，我们的发现突显了氧化还原差异在促进其他水污染物自然衰减方面的潜力。进一步的研究应探讨参与SMX转化的蛋白质、其他硫酸盐还原细菌转化SMX的能力，以及NvH转化其他含有异噁唑环的磺胺类抗生素的能力，从而降低它们的环境持久性。