基于核壳结构二氧化硅纳米粒子的比率荧光传感器用于检测H2O2 施新华（Xinhua Shi） 赵欣茹（Xinru Zhao） 安晓凡（Xiaofan An） 高萌（Meng Gao）

《Chemosensors》：Ratiometric Fluorescent Sensor Based on Core–Shell Structural Silica Nanoparticle for H2O2 Detection Xinhua Shi, Xinru Zhao, Xiaofan An and Meng Gao

　　摘要 过氧化氢（H2O2）在工业和生物过程中起着非常重要的作用，但其高浓度可能对健康造成危害。因此，准确检测H2O2对于化学和生物传感应用至关重要。在这项工作中，我们开发了一种基于核壳结构二氧化硅纳米粒子的比率荧光探针来检测H2O2。首先，通过包封Schiff碱化合物（SD）构建了一个具有红色荧光发射的二氧化硅核心结构。随后，制备了介孔二氧化硅壳层，并将具有H2O2响应特性的AIE荧光团共价连接到介孔壳层表面。作为壳层上的识别位点，蓝色荧光的TB分子通过其苯硼酸酯基团特异性地识别H2O2。在H2O2存在下，核壳结构纳米探针的蓝色荧光会被淬灭，而红色荧光保持不变，从而确保了比率传感的高灵敏度和特异性。该设计在生物和环境应用中展示了可靠的监测过氧化氢的巨大潜力。

1. 引言
过氧化氢（H2O2）是一种关键的生物信号分子，参与细胞代谢、免疫反应、信号转导和氧化应激调节[1,2]。生物体内的H2O2水平与多种病理状况有关，如神经退行性疾病、癌症和心血管疾病[3,4]。此外，H2O2还广泛应用于食品加工、生物医学和纺织等行业[5,6]。过量摄入H2O2会导致人体氧化应激反应，甚至引发肺炎、动脉粥样硬化、哮喘等疾病[7]。因此，在早期疾病诊断和安全监测领域，开发选择性和灵敏的H2O2检测策略至关重要。基于荧光的检测方法由于其速度快、方便、原位识别和高灵敏度等独特优势，已成为H2O2传感的强大方法[8,9]。在荧光方法中，比率荧光探针明显优于利用双发射信号进行自校准的强度型荧光探针[10]。这种策略大大减少了环境干扰因素，如传感器浓度、浑浊度和光源强度，从而提高了测试的准确性和可靠性。目前，已经探索了多种基于纳米材料的H2O2比率荧光探针，例如量子点[11,12]、二氧化硅纳米粒子[13]、纳米簇[14]、聚合物纳米粒子[15]和上转换纳米粒子[16]。这些纳米探针在细胞、食品和环境样品中实现了对H2O2的高灵敏度可视化监测，在各种应用中显示出广阔的前景[17,18]。二氧化硅纳米粒子因其稳定的框架、光学透明性、出色的生物相容性和易于修饰的表面而成为荧光探针的理想载体[19,20,21]。它们的二氧化硅框架或多孔结构允许有效负载功能化荧光团，材料表面还可以装饰识别基团以检测特定分析物[22]。二氧化硅纳米粒子易于进行多种修饰，这对于开发比率荧光探针具有很大优势[23,24]。然而，考虑到这种固态材料，在传统有机荧光团固定在二氧化硅框架上时，不可避免地会出现聚集诱导淬灭（ACQ）现象，这会降低荧光探针的检测效率。这一限制促使人们探索聚集诱导发射（AIE）发光体，它们在聚集状态下表现出显著的荧光增强效应[25,26,27]。AIE效应源于分子内运动受限（RIM），为ACQ问题提供了有效的解决方案[28,29,30]。在之前的研究中，我们的团队证明了二氧化硅的固态框架可以限制AIE分子的分子内旋转，从而提高其荧光效率[31,32]。此外，二氧化硅基质的保护作用可以有效提高荧光团的光稳定性并避免光漂白[33]。因此，将AIE荧光团与二氧化硅纳米粒子结合代表了先进荧光传感的有希望的平台[34,35]。在这里，我们通过将具有AIE特性的H2O2特异性识别分子（TB）和Schiff碱化合物（SD）整合到基于二氧化硅的核壳结构（SD-C@TB-S）中，开发了一种新型的比率荧光纳米探针用于H2O2检测。具体来说，通过共掺杂反应将SD分子加载到二氧化硅纳米粒子内部，得到红色荧光核心结构（SD-C）。然后，在二氧化硅纳米粒子核心上生长介孔二氧化硅壳层，并通过共价键将TB修饰到壳层表面，得到蓝色荧光壳层（TB-S）。核壳设计有效地结合了SD和TB的双重荧光，将它们固定在独立位置可以有效地减少它们之间的相互影响，确保TB的荧光响应（图1）。暴露于H2O2时，TB的蓝色荧光被选择性淬灭，而SD的红色荧光保持不变，从而实现比率量化。这种方法为未来的生物成像和环境监测应用提供了多功能平台，展示了工程化二氧化硅纳米粒子作为先进传感工具的潜力。

2. 材料与方法
2.1. 化学品和试剂
以下化学品和试剂来自商业供应商：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、氨水、N-β-(氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷（TSD）、二氨基马来腈和4-(二乙氨基)水杨醛购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。四乙基正硅酸盐（TEOS）、无水乙醇、丙酮和30%过氧化氢购自中国上海新华药业试剂有限公司。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）购自中国上海Macklin生化公司。无水乙醚、冰醋酸和甲苯购自中国天津富宇精细化工有限公司。甲醇由中国上海Aladdin化学试剂有限公司提供。作为目标识别化合物的4-[苯(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二硼杂环戊烷-2-基)苯)氨基]苯甲醛（TB）通过Science Guide Platform定制合成。

2.2. 合成
2.2.1. Schiff碱衍生物（SD）的合成
Schiff碱衍生物（SD）的合成方法如下：将二氨基马来腈（0.54 g，5.0 mmol）和4-(二乙氨基)水杨醛（2.03 g，10.5 mmol）溶解在100 mL乙醇中。逐滴加入两滴冰醋酸，然后在80 °C下回流12小时。反应完成后，通过真空过滤收集固体产物，并用乙醇彻底洗涤，得到深紫色的SD固体。值得注意的是，含有马来腈C=C双键的SD可能存在顺式和反式异构体[36,37]。根据先前的报告，这些异构体具有相似的光物理特性，并可能在紫外光或可见光照射下发生互变。根据1H NMR数据，合成的SD被推测为顺式结构[36]。SD的1H NMR谱图如下（400 MHz，CDCl3，δ）：12.85 (s, 2H)，8.49 (s, 2H)，7.20 (d, 2H)，6.34 (m, 4H)，3.43 (m, 8H)，1.23 (t, 12H)。13C NMR（101 MHz，CDCl3，δ）：164.49，161.92，153.67，135.59，121.80，112.63，109.75，98.01，45.03，12.70（图S2）。MS（ESI）计算SD [M + H]+的分子量为459.24；实际测得为459.3（图S3）。

2.2.2. 氨基功能化二氧化硅纳米粒子核心（SD-C）的合成
溶液A通过将100 mg SD溶解在2 mL TEOS和18 mL无水乙醇的混合物中制备。溶液B通过将10 mL氨水（25–28 wt%）和30 mL无水乙醇混合制备。溶液C通过将0.3 mL TSD和4 mL无水乙醇混合制备。在室温下将2.5 mL溶液A逐滴加入溶液B中，然后剧烈搅拌10分钟。之后，将溶液C和2 mL TEOS逐滴加入反应混合物中，继续搅拌2小时。最后，通过离心分离反应产物，用乙醇反复洗涤以去除残留反应物，并干燥得到固体产物SD-C。

2.2.3. 二氧化硅核壳结构（SD-C@S）的构建
二氧化硅核壳结构的制备方法如下：将30 mg SD-C分散在1 mL无水乙醇中，并超声处理15分钟以获得均匀分散液。此外，将0.1 g CTAB溶解在0.2 mL氨水和18 mL去离子水的混合物中，并搅拌至获得澄清溶液。随后，依次加入4 mL乙醇、3.5 mL乙醚、预先分散的SD-C和0.5 mL TEOS，每次加入后搅拌15分钟。最终混合物搅拌2小时。反应完成后，通过离心分离产物，用乙醇彻底洗涤，并在室温下干燥24小时，得到二氧化硅核壳结构（SD-C@S）。

2.2.4. SD-C@TB-S比率荧光探针的构建
为了制备具有AIE活性的二氧化硅核壳材料（SD-C@TB-S），将0.2 g TB和0.13 mL APTES混合在10 mL无水乙醇中，并在室温下搅拌4小时。将所得混合物通过旋转蒸发浓缩至最终体积约5 mL，备用。接下来，将100 mg SD-C@S和0.3 mL上述溶液分散在6 mL无水乙醇中，并在室温下搅拌3小时。然后将所得悬浮液通过旋转蒸发得到固体残留物，用乙醇彻底洗涤并干燥，得到具有AIE特性的二氧化硅核壳材料SD-C@TB-S。

2.3. H2O2响应测量
对于不同H2O2浓度的SD-C@TB-S进行荧光测试，将其分散在THF/水（9:1，v/v）混合物中，并与不同浓度的H2O2反应30分钟。然后收集荧光光谱。对于荧光选择性实验，准备了各种干扰物质的相同浓度（0.25 mM）溶液。孵育30分钟后，依次测量每个样品的荧光比率变化（ΔFt/Fs）。ΔFt是Ft的初始发射强度减去与H2O2反应后的强度。

3. 结果与讨论
3.1. 结构特性
在这项研究中，逐步构建了核壳结构的二氧化硅纳米粒子，在不同的结构层上修饰了两种不同的荧光基团。首先，通过共掺杂方法将SD基团嵌入二氧化硅基质中，合成具有红色荧光发射特性的SD-C核心（SD-C）。测量了SD的FT-IR谱图（图S4）。SD分子的特征吸收峰分别位于3414 cm?1、2209 cm?1和1633 cm?1，对应于υ-OH、υC≡N和υC=N。芳香环的骨架振动也出现在1450–1560 cm?1范围内。然后，基于SD-C构建了介孔二氧化硅壳层，并通过共价键在壳层表面修饰了具有AIE特性的TB分子，得到SD-C@TB-S。TB分子由于其苯硼酸酯基团而具有优异的H2O2传感性能，这一点已在先前的报告中得到证实[38]。使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）表征了SD-C和SD-C@TB-S的结构和形态特征。如图2a所示，SD-C呈现球形，大小均匀，表面光滑。SD-C的大小约为500–600 nm。同样，SD-C在TEM图像中也显示出均匀的形态（图2b）。生长壳层后，SEM测量显示SD-C@TB-S粒子的大小显著增加，表面可以观察到由TB-S壳层的多孔结构引起的间隙（图2c）。通过TEM图像可以更深入地观察核壳结构的特征。如图2d所示，SD-C@TB-S的核壳结构可以清晰识别，由一个固体SD-C核心包裹着一个具有径向排列介孔的介孔二氧化硅壳层。结果证实了二氧化硅核壳结构的成功合成。

3.2. 荧光特性
在合成的SD-C@TB-S中，红色荧光的SD荧光团嵌入二氧化硅核心作为参考荧光单元；同时，发出蓝色荧光的TB功能团锚定在外壳结构上作为荧光识别单元。首先研究了SD和TB的光学特性。作为H2O2响应部分，TB分子表现出明显的AIE特性，有效减轻了固态传感器中的ACQ效应。如图3所示，在不同水含量的H2O/乙醇混合物中研究了TB分子的AIE行为。图3a展示了这些混合物在不同水分数下的荧光光谱。在低水分数时，TB分子几乎不显示荧光。然而，随着不良溶剂（水）的比例增加，TB分子开始聚集，当水体积分数超过60%时，荧光强度显著增强。TB最强的发射出现在80%的水含量时。荧光强度与水含量之间的对应关系也证实了这一趋势（图3b）。此外，TB溶液的照片显示，当水含量达到60%时，出现了明显的聚集现象，并伴随着强烈的蓝光荧光发射。上述结果表明TB具有典型的AIE（聚集诱导发光）特性。然而，SD的光学特性与TB相反。如图S5所示，SD的最大荧光强度出现在良好溶剂（乙醇）中。随着水含量的增加，SD的荧光强度逐渐减弱。如图S5b所示，SD溶液在40%的水含量下显示出显著的荧光强度下降。图3显示了H2O/乙醇混合物中TB分子的荧光光谱（a）和相对荧光强度（b），以及紫外光照下的照片。本研究采用了一种巧妙的核心-壳层结构设计，将TB和SD分别固定在二氧化硅颗粒的壳层和核心上。如图4所示，TB的荧光光谱在473纳米处有一个发射峰，而SD在604纳米处有一个红色荧光发射峰。在合成SD-C@TB-S核心-壳层纳米颗粒后，TB和SD在这种结构中仍保持其特征发射峰，从而实现了比率荧光。TB在二氧化硅颗粒表面修饰后表现出蓝移现象，这可能是由于TB周围环境的变化所致[31,39]。值得注意的是，TB和SD之间的荧光共振能量转移（FRET）会导致TB的荧光淬灭。核心-壳层结构有效地将两种荧光团空间分离，从而防止了FRET的发生，确保了探针比率荧光响应的可靠性。图4显示了SD-C@TB-S、TB和SD的荧光发射光谱。

3.3. 传感性能
SD-C@TB-S的比率传感策略是通过使用TB作为识别单元和SD作为参考单元来实现的。作为SD-C@TB-S探针的荧光响应剂，TB的分子结构结合了三苯胺基团的AIE活性和硼基团的H2O2选择性反应性[38,40]。在H2O2存在下，SD-C@TB-S壳层上的TB分子经历了过氧化物介导的芳基-硼化基团断裂反应，产生酚基团，从而淬灭了蓝光荧光（图5a）。在此过程中，参考用的SD的红色荧光未受影响，实现了H2O2的比率传感。H2O2浓度变化对荧光强度的影响结果如图5b所示。即使在0.05 mM的低H2O2浓度下，TB的蓝光荧光强度（Ft）也明显下降。随着H2O2浓度的增加，Ft持续下降，当H2O2浓度超过0.4 mM时，下降速率减缓。相比之下，作为比率参考的SD的红色荧光强度（Fs）在整个实验过程中几乎保持不变。这些结果表明SD-C@TB-S可以用作H2O2的比率荧光探针，用于准确检测H2O2。

图5. (a) SD-C@TB-S对H2O2的比率荧光传感原理。(b) 不同H2O2浓度下SD-C@TB-S的荧光光谱。(c) SD-C@TB-S的荧光比率Ft/Fs与H2O2浓度（0–0.5 mM）之间的线性关系。(d) 不同物质作用下SD-C@TB-S的荧光比率变化。如图5c所示，随着H2O2浓度从0增加到0.5 mM，SD-C@TB-S的荧光比率（Ft/Fs）呈线性下降。SD-C@TB-S的荧光比率与H2O2浓度呈线性关系。检测限（LOD）使用公式3σ/s计算（其中σ表示空白测量的标准偏差，s表示校准曲线的斜率）。结果显示SD-C@TB-S对H2O2的LOD为8 μM，表明二氧化硅纳米颗粒对H2O2的检测具有高灵敏度。此外，还研究了SD-C@TB-S与H2O2反应后的时间依赖性荧光比率变化。如图S6所示，在0.5 mM的H2O2浓度下，SD-C@TB-S的荧光比率（Ft/Fs）在最初的20分钟内逐渐下降。20分钟后，SD-C@TB-S的比率下降缓慢，并在30分钟时趋于稳定。基于这种时间依赖性的荧光响应特性，确定了H2O2的最佳检测时间为30分钟。

此外，还测试了SD-C@TB-S纳米传感器的选择性传感能力。通过向探针溶液中添加各种干扰物质（0.25 mM），测量了SD-C@TB-S探针的荧光比率变化。如图5d所示，在丙酮、甲苯、甲醇、乙醇、ROO’、?OH、CO32?、NO3?和SO42?存在下，荧光比率变化（ΔFt/Fs）与空白对照组相似。然而，在添加H2O2后，荧光比率出现了明显的变化。上述结果表明，这种核心-壳层二氧化硅纳米探针在检测H2O2方面表现出出色的灵敏度和选择性，使其成为化学和生物传感应用的有希望的候选者。此外，H2O2在食品安全领域是一个重要的指标。因此，通过使用牛奶进行了SD-C@TB-S在实际样品分析中的实用性研究。准备了含有不同浓度H2O2的牛奶样品，以评估SD-C@TB-S的检测能力和准确性。通过添加H2O2引起的牛奶中SD-C@TB-S的荧光比率变化来估计H2O2的浓度，并将结果与已知值进行比较。如表1所示，不同浓度牛奶的回收率在101.7%到112.4%之间，大多数相对标准偏差小于10%。这些结果验证了SD-C@TB-S传感器对H2O2的高实用性。

4. 结论
总之，成功制备了一种使用二氧化硅纳米颗粒的核心-壳层结构的比率荧光传感器。在材料构建过程中，具有红色发射的Schiff碱化合物被封装在二氧化硅核心中作为参考单元，而具有H2O2响应功能的蓝光发射AIE分子被修饰在中孔壳层表面作为识别单元。核心-壳层结构有效地减少了两种荧光团之间的干扰，使得它们能够独立响应荧光。该探针在H2O2传感方面表现出优异的性能，蓝光荧光随着H2O2浓度的增加而淬灭，而红色荧光保持不变，检测限（LOD）达到8 μM。这些比率荧光纳米颗粒为实时H2O2检测提供了强大的工具，并且是非常有前途的候选者，适用于实际应用中的化学和生物传感器。

补充材料
以下支持信息可以在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/chemosensors14040081/s1：
- 图S1：SD的1H NMR光谱；
- 图S2：SD的13C NMR光谱；
- 图S3：SD的MS光谱；
- 图S4：SD的FT-IR光谱；
- 图S5：不同组成下H2O/乙醇混合物中SD分子的荧光光谱（a）和相对荧光强度（b），以及紫外光照下的照片；
- 图S6：(a) 添加H2O2（0.5 mM）后SD-C@TB-S的荧光发射光谱；(b) SD-C@TB-S薄膜对H2O2的时间依赖性荧光比率。