基于探针的qPCR方法用于边境检查与森林监测中云杉八齿小蠹（鞘翅目：象甲科，小蠹亚科）的快速检测

《Forests》：A Probe-Based qPCR Method for Rapid Detection of Ips typographus (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae) in Border Inspections and Forest Surveillance Domenico Rizzo, Claudia Gabriela Zubieta, Andrea Marrucci, Michela Moriconi, Bruno Palmigiano, Linda Bartolini, Matteo Bracalini, Antonio Pietro Garonna, Tiziana Panzavolta and Elia Russo + 1 author

　　

云杉八齿小蠹（Ips typographus）是影响欧洲针叶林最具破坏性的蛀干害虫之一。在气候干扰和受侵染木材移动的影响下，其种群可从地方性流行水平迅速转变为严重爆发。通过边境检查和森林监测进行早期检测对于防止新的引入和限制已建种种群的扩散至关重要。本研究开发并验证了一种基于探针的TaqMan实时定量PCR（qPCR）方法，以靶向线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）条形码区域，用于从昆虫材料以及从蛀屑和羽化孔木屑中回收的环境DNA（eDNA）中快速、特异性地检测云杉八齿小蠹。验证遵循欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）PM7/98(5)指南，评估了分析特异性、灵敏度、重复性、重现性以及实验室间转移性。该方法对广泛的非靶标物种表现出高分析特异性，并在不同测试基质中均获得了可靠的扩增。该方法显示出强大的分析灵敏度，对成虫来源DNA的检测限为0.32 pg/μL，对人工蛀屑的检测限为1.6 pg/μL。重复性、重现性和实验室间盲测进一步证实了该方法的诊断可靠性。这种经过验证的qPCR方法为云杉八齿小蠹的早期检测提供了一种快速、灵敏的分子工具，支持边境检查和植物检疫诊断实验室开展森林生物安全活动。

蛀干害虫（鞘翅目：象甲科，小蠹亚科）是小型韧皮部取食昆虫，通常在种群密度保持较低水平时，于衰弱或受胁迫的树木上发育。在地方性流行水平，它们有助于营养循环，并在维护森林健康方面发挥生态作用。然而，当发生密度依赖性的大规模攻击时，多个物种可能转变为针叶林中的主要害虫，使其能够克服寄主防御并杀死原本健康的树木。这种爆发潜力，加之其隐蔽的生活方式以及与木材、木制品和包装材料的频繁关联，使得蛀干害虫通过贸易无意间远距离传播，持续对森林生物安全构成威胁。因此，监测和边境检查是植物检疫防御的关键组成部分。欧洲云杉八齿小蠹（ESBB），即云杉八齿小蠹（Boerner），是欧亚针叶林中最具破坏性的小蠹虫之一。它属于Ipini族，其各属共享形态特征和对针叶寄主的适应性，这在日常监测中使物种水平的区分变得复杂。该害虫主要侵染挪威云杉（Picea abies），但在有利条件下也可能侵染其他松科树木，包括冷杉、落叶松和松属物种。通常，云杉八齿小蠹种群在受胁迫或死亡的树木提供足够繁殖基质的地方性流行水平下维持。然而，大规模非生物干扰，如风暴，可能引发破坏性爆发。例如，2018年风暴“Vaia”之后，该害虫导致意大利阿尔卑斯地区超过850万立方米的木材损失。云杉八齿小蠹在欧洲大陆分布广泛，是在边境检查站（BIPs）植物检疫检查中最常被截获的蛀木害虫之一。尽管在大多数欧盟成员国中它未被列为高关注生物，但它在爱尔兰和英国仍然是受保护的检疫性害虫。因此，进口寄主植物和木材商品受到限制并受到有针对性的边境监控。更广泛地说，云杉八齿小蠹由于其生态和经济影响，仍然是一个具有植物检疫意义的害虫。例如，在意大利，目前正在实施密集的现场监测和控制措施，以减轻受影响地区的侵染。早期检测项目的一个重要要求是能够快速准确地鉴定被截获的物种。对于通用监测，初步筛查依赖于专家分类学家的形态学鉴定，这对于保存完好的成虫可能是可靠的，但当标本受损、不完整或仅限于未成熟阶段时，就变得问题重重。例如，幼虫鉴定需要高度专业化的知识，并且可能因缺乏全面的检索表而受到限制。因此，基于形态学的诊断可能耗时，并且当仅存在微量证据时可能缺乏灵敏度。分子诊断学的最新进展为快速、灵敏的害虫检测提供了强大的互补方法，包括实时定量PCR（qPCR）方法，该方法可以利用从生物痕迹中回收的环境DNA（eDNA）。蛀屑尤其是一种丰富且易于收集的基质，用于小蠹虫的无创检测。尽管分子诊断工具已针对几种入侵和高风险检疫性甲虫进行了验证，但针对云杉八齿小蠹的专用qPCR方法尚未用于常规植物检疫用途，亟需开发以支持边境诊断和野外监测。本研究旨在填补这一空白，开发并验证一种针对云杉八齿小蠹的物种特异性TaqMan qPCR方法，用于从昆虫材料和eDNA相关基质中快速鉴定该害虫。该方法旨在适用于成虫、蛀屑和羽化孔木屑，实现直接和间接检测，并依据EPPO PM7/98(5)标准就特异性、灵敏度、重复性、重现性（包括操作条件下的评估）进行了验证。研究人员的目标是提供一个稳健的、与实地相关的分子工具，不仅能够集成到支持边境检查站的诊断工作流程中，而且能够用于森林监测，在那里及时区分云杉八齿小蠹与形态相似的蛀干害虫对于快速管理决策至关重要。

为开展研究，研究人员采用了几个主要关键的技术方法：首先，依据EPPO PM7/98(5)标准开发并验证了一种基于TaqMan探针的qPCR方法。其次，通过生物信息学分析（使用MAFFT进行序列比对，并利用NCBI BLASTn工具）在硅基层面评估了引物和探针的特异性。第三，通过构建人工蛀屑作为标准化阳性质控品，并对来自不同生物基质（成虫、自然蛀屑、人工蛀屑、羽化孔木屑）的DNA样本进行了系统的分析验证，包括灵敏度、重复性、重现性及实验室间盲测。研究样本队列来源于意大利托斯卡纳地区植物健康服务中心与佛罗伦萨大学在2021至2023年间进行的植物检疫监测中收集的云杉八齿小蠹标本（包括成虫、蛀屑），以及来自那不勒斯“费德里科二世”大学昆虫学馆藏和CREA的额外样本。

研究结果部分：首先，在DNA分离方面，研究人员从所有测试的生物基质（成虫、自然蛀屑、人工蛀屑、羽化孔木屑）中均成功分离出质量和数量合适的DNA。平均浓度范围约为成虫样本40 ng/μL，蛀屑和羽化孔木屑约60 ng/μL。光谱纯度比（A260/A280 = 1.68–2.12）表明蛋白质或其他抑制剂的污染极小。人工蛀屑产生了与自然蛀屑相当的DNA产量和纯度值，证明该人工基质能够可靠地模拟真实蛀屑的提取行为。所有提取物中保守的18S rDNA片段的成功扩增证实了扩增性DNA的存在，表明长期室温储存的未处理材料可作为eDNA的可靠来源。其次，在qPCR优化方面，研究人员确定了最佳引物浓度（每条引物0.4 μM）和最佳退火温度（55 °C）。最终的扩增方案为：95 °C初始变性2分钟；随后40个循环：95 °C变性10秒，55 °C退火40秒。该方案在所有测试的DNA提取物中产生了可重复的扩增，并且在无模板对照中未检测到信号。使用Luna? Universal Probe qPCR Master Mix试剂盒也获得了可比的扩增谱，证实了该方法在不同试剂化学体系间的可转移性。第三，在分析验证方面，该方法达到了EPPO标准规定的完全包容性和排他性。所有云杉八齿小蠹样本在所有基质和来源中均被成功检测到，而针对任何非靶标物种均未观察到扩增。在硅基分析中，对近缘Ipini族代表物种的COI序列比对显示，在引物和探针结合位点存在多个错配和插入/缺失，为观察到的分析特异性提供了机制性解释。第四，在分析灵敏度方面，研究人员使用成虫和人工蛀屑DNA进行五倍系列稀释，测定了检测限（LoD）。成虫DNA的LoD为0.32 pg/μL（3.2 × 10?? ng/μL），人工蛀屑DNA的LoD为1.6 pg/μL（1.6 × 10?3 ng/μL）。标准曲线显示出高度的线性（决定系数R2 = 0.999）。第五，在重复性和重现性评估中，使用接近LoD的成虫DNA（3.2 pg/μL），批内重复性分析的平均Cq值为34.47 ± 0.57，变异系数（CV）为1.65%；批间重现性分析（不同日期、操作人员和PCR仪）的平均Cq值为33.54 ± 0.48，CV为1.42%，表明具有高分析精度。第六，在实验室间盲测验证中，两个获得认证的植物检疫实验室（意大利的Pistoia中央植物检疫服务站和Livorno港植物检疫服务站）正确识别了所有云杉八齿小蠹样本（包括成虫来源DNA和人工蛀屑），对任何非靶标物种均未观察到扩增，确认了该方法的诊断鲁棒性和可转移性。

论文讨论部分总结：本研究开发并验证的基于探针的qPCR方法，为检测来自昆虫材料和间接生物基质的云杉八齿小蠹提供了一种灵敏且高度特异的分子工具。该方法的分析特异性与包容性得到了湿实验测试和生物信息学分析的双重证实，其检测灵敏度与其他针对小蠹属害虫的qPCR方法相当。人工蛀屑作为标准化参考基质的引入，虽然可能因基质相关化合物导致扩增效率超过理论值（>150%）及Cq值分布更分散，但这并未损害其低检测限和整体诊断性能。研究还证实了蛀屑中昆虫eDNA的稳定性，室温储存一个月的自然蛀屑仍能可靠扩增。该方法的成功开发填补了缺乏针对云杉八齿小蠹的常规植物检疫专用qPCR工具的空白，其采用的TaqMan探针技术（闭管操作）和对EPPO与MIQE指南的遵循，确保了其适用于边境检查站和植物健康服务实验室的常规诊断工作流程，为基于科学证据的植物检疫决策提供了支持。

论文结论部分翻译：本研究开发并验证的基于探针的qPCR方案，提供了一种灵敏且高度特异的分子工具，可用于从昆虫材料和间接生物基质中检测云杉八齿小蠹。其符合MIQE和EPPO标准，加之成功的实验室间验证，支持其立即应用于边境检查站和植物健康服务实验室，在这些场景中，快速可靠的鉴定对于知情的植物检疫决策至关重要。未来的研究应侧重于将此诊断工具集成到多重筛查平台中，评估其在批量环境样本中的性能，研究其在常规工作流程中的实施情况，并将验证范围扩展到地理上更广泛的云杉八齿小蠹种群，以进一步确认引物-探针靶区域在整个物种分布范围内的保守性。