集成式石花菜生物精炼用于通过酮己糖偏向和工程化氧化酶选择性生产HMF和绿色酶法FDCA

《Environmental Technology & Innovation》：Integrated Gelidium amansii biorefinery for selective HMF and green enzymatic FDCA production via ketohexose bias and engineered oxidase

　　

研究人员介绍了一种集成的、全水相、无金属的生物精炼方法，该方法结合了酮己糖偏向的脱水途径与工程化的5-羟甲基糠醛（HMF）氧化酶（8BxHMFO），以实现高效HMF生成及后续2,5-呋喃二甲酸（FDCA）的生产。首先采用热酸水解将琼脂糖分离为富含半乳糖的液体，同时将纤维素保留在固体残渣中，实现了25.8%的固体回收率和97.5%的葡聚糖回收率。回收的纤维素随后被酶解为葡萄糖。通过电渗析去除抑制性离子，然后通过活性炭选择性吸附HMF。预异构化和差向异构化（通过gtAI将D-半乳糖转化为D-塔格糖；通过smXI±pcTE将D-葡萄糖转化为D-果糖/D-阿洛酮糖）是增强HMF形成的关键。响应面分析显示，HMF产率增加了50倍以上，从醛糖的<1%上升至酮己糖的高达80%。在相同的酸脱水条件下，半乳糖转化为塔格糖后，HMF滴度从0.20 mg mL^-1增加到1.15 mg mL^-1；葡萄糖转化为果糖或阿洛酮糖后，HMF滴度从0.38 mg mL^-1增加到3.80 mg mL^-1。所得HMF馏分（浓度约2 mM）在温和水相条件下经8BxHMFO氧化为FDCA，产生1.72 mM FDCA，转化率达84.9%，且中间产物积累可忽略不计。总体而言，这一集成工艺实现了从石花菜高效生成HMF和可持续生产FDCA，建立了一条完全在水相和无金属框架内、可扩展的海藻生物质路线以生产生物基PEF（聚呋喃二甲酸乙二醇酯）单体。

**论文解读文章**

**研究背景与存在问题**

当前对化石燃料的持续依赖导致了温室气体排放加剧、全球变暖和气候变化。转向可再生碳源是实现碳中和的必要途径，而基于生物质的生物精炼在可持续生产燃料、化学品和材料中发挥着核心作用。然而，绝大多数商业和研究规模的生物精炼都依赖木材和农业残余物等陆地生物质。在韩国等国家，由于多山地形、有限的耕地、强烈的季节变异性、高水分和杂质含量以及昂贵的物流，这些原料的大规模利用受到制约。在此背景下，大型藻类（海藻）成为一种有前景的非陆地替代资源。韩国三面环海，拥有发达的水产养殖基础设施和较高的海藻生产力。大型藻类生长迅速，固碳率高，且不需要农田或淡水，是极具吸引力的蓝碳资源。其中，红藻含有极少木质素，富含琼脂和纤维素，便于预处理且碳水化合物可及性高。石花菜（*Gelidium amansii*，GA）在东亚广泛养殖，含有丰富的琼脂糖，其水解可释放D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖（L-AHG），而纤维素部分则产生葡萄糖。这些己糖可通过酸催化脱水生成5-羟甲基糠醛（HMF）。HMF是一种关键的平台分子，可进一步升级为聚合物单体，如2,5-呋喃二甲酸（FDCA），后者用于合成聚呋喃二甲酸乙二醇酯（PEF），这是一种具有优异气体阻隔和热机械性能的可回收聚合物。

然而，石花菜来源的糖主要是醛糖（葡萄糖和半乳糖），其直接脱水生成HMF的选择性较低，因为存在再水合为乙酰丙酸和甲酸、腐殖质形成及热降解等竞争反应，导致产率和选择性显著降低。相比之下，酮己糖（如D-果糖和D-塔格糖）在相同条件下表现出显著更高的HMF选择性。因此，在脱水前进行醛糖到酮糖的异构化是提高HMF产率的有效策略。此外，下游HMF氧化为FDCA可通过化学或生物催化途径进行。金属催化的氧化系统（基于Au、Pt、Pd、Ru、Co、Mn等）虽然有效，但通常需要高温、高压氧气和腐蚀性助剂，产生盐废物并增加催化剂回收难度。作为一种更绿色的替代方案，基于氧化酶的生物催化剂利用分子氧作为最终氧化剂，在水相介质中温和无金属条件下操作。其中，工程化的8BxHMF氧化酶（8BxHMFO）变体表现出增强的热稳定性、改善的有机溶剂耐受性和从HMF高效生产FDCA的能力。

尽管醛糖到酮糖的转化和氧化酶介导的FDCA合成具有潜力，但在海洋生物质的整合增值中仍存在显著挑战。特别是，尚不清楚建立酮己糖偏向能否在真实、混合、富含醛糖的石花菜水解液中一致地提高HMF选择性，以及所得到的HMF流能否在存在残留基质衍生抑制剂的情况下直接与无金属酶促氧化耦合。

**研究目的与意义**

因此，本研究旨在开发一种整合的宏藻生物精炼工艺，同时利用石花菜的琼脂衍生和纤维素衍生的碳水化合物。具体目标包括：（i）定量展示通过酮己糖偏向途径相对于直接醛糖脱水提高HMF选择性；（ii）建立利用工程化8BxHMFO的全水相无金属FDCA生产路线；（iii）将这些步骤整合到一个统一的生物精炼框架中，用于将海洋生物质转化为有价值的呋喃化学品。该工作的关键科学贡献在于使用真实的石花菜衍生的混合糖流（而非模型底物）验证了酮己糖偏向策略，并展示了在完全水相和无金属系统中脱水与氧化酶基FDCA合成的整合。论文发表在《Environmental Technology》。

**主要技术方法**

研究人员采用响应面法（RSM）结合Box–Behnken设计（BBD）优化热酸水解（TAH）预处理条件，以实现石花菜中D-半乳糖的高效释放和HMF形成。通过气相色谱（GC）分析原料和预处理后固体（TAH-GA）的化学组成。使用电渗析（ED）去除水解液中的抑制性离子（H⁺和Cl^-），随后采用活性炭（AC）吸附分离HMF和半乳糖。酶解糖化采用纤维素酶（CEL）和果胶酶（PEC）单独或组合处理TAH-GA。关键酮己糖生产使用重组酶：来自*Geobacillus thermodenitrificans*的三突变L-阿拉伯糖异构酶（gtAI，F280N/C450S/N475K）用于D-半乳糖→D-塔格糖转化；来自*Streptomyces murinus*的木糖异构酶（smXI）用于D-葡萄糖→D-果糖转化；来自*Pseudomonas cichorii*的D-塔格糖3-差向异构酶（pcTE）用于D-果糖→D-阿洛酮糖转化。HMF氧化使用八突变HMF氧化酶（8BxHMFO，I73V/H74Y/G356H/V367R/T414K/A419Y/A435E/W466F）来自*Methylovorus* sp. MP688。所有重组酶在大肠杆菌Rosetta中表达并纯化。酸催化脱水优化同样使用RSM，变量包括糖浓度、硫酸浓度和反应时间。HMF和FDCA浓度通过配备紫外检测的HPLC或UV-Vis分光光度法测定。石花菜原料购自韩国Malbau市场。

**研究结果与讨论**

**3.1 石花菜的化学表征**
气相色谱分析显示，石花菜的总碳水化合物含量约为干重的50.7±1.3%，主要组分为D-葡萄糖（9.4±0.4%）、D-半乳糖（18.0±0.8%）和3,6-脱水-L-半乳糖（L-AHG）（22.8±0.0%）。高含量的L-AHG和半乳糖表明石花菜是生产塔格糖和HMF等增值化学品的优势原料，且戊糖（木糖、阿拉伯糖）含量极低简化了下游处理。

**3.2 利用BBD优化石花菜的热酸水解预处理**
通过RSM优化TAH条件，最佳条件为底物浓度5.0%（w/v）、HCl浓度0.3 N、反应时间33 min。实验验证得到D-半乳糖浓度8.82 mg mL^-1（产率98.0%），HMF浓度1.82 mg mL^-1（产率16.0%）。D-半乳糖产率与预测值吻合良好，但HMF产率低于预测，归因于高温强酸下的二次反应（腐殖质形成和热降解）。底物浓度增加提高了绝对产量，但降低了转化效率，可能由于传质限制或局部酸耗竭。

**3.3 从石花菜水解液中回收HMF和半乳糖**
电渗析有效去除了H⁺和Cl^-，半乳糖和HMF损失极小（分别从8.82和1.82 mg mL^-1降至8.58和1.74 mg mL^-1）。活性炭吸附去除了约94.8%的HMF，同时仅吸附约5.7%的半乳糖，并实现有效脱色（L^*从40.7增至54.9，a^*和b^*分别从7.9和17.7降至-0.5和0.5）。用异丙醇（IPA）从活性炭上解吸HMF，回收率为65.45%，表明部分HMF不可逆结合或降解。

**3.4 TAH-GA的酶解及酶协同作用分析**
TAH-GA的固体回收率为45.5%，葡聚糖回收率为97.5%。单独纤维素酶处理产生约20.0 mg mL^-1葡萄糖（产率86.6%），添加果胶酶后葡萄糖浓度仅略微增加至20.5 mg mL^-1（产率88.7%），协同度（DS）为1.01，表明两者为加性效应而非协同，因此单独纤维素酶即可高效水解。

**3.5 将石花菜衍生的醛己糖转化为酮己糖**
重组酶gtAI、smXI和pcTE的最适条件均为50°C、pH 8.0并需Mn²⁺辅因子，比活分别为18.7±0.4、20.1±0.7和27.2±0.9 U mg^-1。硼酸盐显著增强了酮糖形成。在富含半乳糖的水解液中，gtAI将8.6 mg mL^-1 D-半乳糖转化为4.2 mg mL^-1 D-塔格糖（转化率49.3%），比无硼酸盐时提高约54%。在富含葡萄糖的水解液中，smXI单独将37.6%的葡萄糖转化为果糖；联合pcTE后，总酮糖比例增至68.9%（28.8%果糖+40.1%阿洛酮糖），归因于pcTE将果糖转化为阿洛酮糖，推动葡萄糖-果糖平衡向酮糖方向移动。

**3.6 石花菜衍生的酮己糖与醛己糖生产HMF的比较**
在系统优化条件下，醛糖（D-葡萄糖和D-半乳糖）的HMF产率分别仅为0.87%和0.62%，而酮己糖（D-塔格糖、D-果糖、D-阿洛酮糖）的HMF产率分别达到69.3%、43.5%和79.9%。酮己糖的底物转化率（82.8%-83.7%）远高于醛糖（10.5%-11.3%）。对于石花菜衍生的糖流，直接脱水将富含半乳糖的水解液仅产生0.20 mg mL^-1 HMF（占总糖6.63%）；gtAI异构化后，在优化条件下HMF浓度升至1.15 mg mL^-1（占总糖39.78%，基于酮糖为80.69%）。类似地，富含葡萄糖的水解液直接脱水产生0.38 mg mL^-1 HMF（占总糖5.17%）；smXI处理后HMF升至1.85 mg mL^-1（占总糖24.93%，基于酮糖65.74%）；smXI+pcTE联合处理后HMF升至3.80 mg mL^-1（占总糖51.7%，基于酮糖73.16%）。酮己糖的高反应性归因于其更易形成呋喃中间体及较低的脱水活化能。

**3.7 利用工程化8BxHMFO将HMF生物催化转化为FDCA**
8BxHMFO的比活为27.1±0.3 U mg^-1。以初始HMF浓度2 mM、酶载量400 μM氧化石花菜来源HMF（来自半乳糖和葡萄糖流）时，获得1723 μM FDCA（转化率84.9%），HMF几乎完全消耗，中间产物DFF和FFCA积累可忽略不计。而活性炭/IPA解吸的HMF氧化效率显著降低，在400 μM酶载量下FDCA产量仅约956 μM，归因于残留IPA对氧化酶活性的抑制。通过蒸发去除IPA后，FDCA产量恢复至约74.8%，表明溶剂带出是整合过程中的关键限制因素。与文献中化学催化、酶和全细胞途径相比，本研究系统在温和、无金属水相条件下实现了高效FDCA生产，但指出了基于IPA的HMF回收带来的整合挑战。

**总结讨论与结论翻译**

**总结与讨论部分**：研究通过整合热酸水解、酶解、电渗析、活性炭吸附、酶促酮己糖偏向转化以及工程化氧化酶氧化，建立了石花菜的全水相无金属生物精炼平台。关键发现包括：酮己糖偏向策略将HMF产率提高了50倍以上；单独纤维素酶足以高效糖化预处理后的纤维素残渣；电渗析和活性炭处理有效纯化了水解液并分离了HMF；但活性炭/IPA解吸步骤引入的有机溶剂残留严重抑制了下游氧化酶活性，通过蒸发去除可部分恢复。氧化步骤可能在更高底物浓度下受氧气传输和过氧化物积累限制。这一概念验证系统明确了界面整合（特别是HMF回收方式）对最终FDCA产率的关键影响，为未来优化和放大提供了框架。

**结论部分翻译**：本研究为石花菜建立了一个全水相、模块化的生物精炼平台，该平台整合了酮糖偏向的糖转化与工程化氧化酶，用于生产HMF和FDCA。热酸水解选择性地将琼脂糖分配到液相，同时将纤维素保留在固体部分，使仅使用纤维素酶即可实现高效酶解糖化。预异构化和差向异构化显著提高了HMF选择性。在优化条件下，经gtAI处理后，富含半乳糖流中的HMF浓度从0.20 mg mL^-1增加到1.15 mg mL^-1；经smXI和pcTE顺序处理后，富含葡萄糖流中的HMF浓度从0.38 mg mL^-1增加到3.80 mg mL^-1。在下游过程中，8BxHMFO在温和无金属条件下高效催化HMF氧化为FDCA。在初始HMF浓度2 mM、酶载量400 μM时，获得1723 μM FDCA（转化率84.9%），中间产物积累极少。相反，使用IPA从活性炭中回收的HMF表现出较低的FDCA产率，表明残留溶剂对氧化效率产生不利影响。总体而言，这一集成工作流程为FDCA生产提供了一条可扩展且与沿海供应链兼容的路线，并支持可持续PEF单体的更广泛开发。