《Environment & Health》：A NANOG-EGFP iPSC-Based Reporter Platform for High-Throughput Screening of Environmental Pollutant Effects on Pluripotency
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人类频繁暴露于多种环境污染物中，这些污染物可能对早期胚胎发育构成潜在风险。干细胞毒理学的发展使得基于人诱导多能干细胞(hiPSC)的生理相关模型成为可能，但现有体系受限于低通量及无法实时监测。本研究利用CRISPR/Cas9技术将T2A-EGFP(增强型绿色荧
人类频繁暴露于多种环境污染物中，这些污染物可能对早期胚胎发育构成潜在风险。干细胞毒理学的发展使得基于人诱导多能干细胞(hiPSC)的生理相关模型成为可能，但现有体系受限于低通量及无法实时监测。本研究利用CRISPR/Cas9技术将T2A-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)盒精确插入内源性NANOG基因位点，建立了NANOG-EGFP hiPSC报告细胞系，可动态、定量可视化多能性状态。研究人员利用该平台系统评估了38种代表性环境污染物(涵盖双酚类、全氟/多氟烷基物质(PFAS)、卤代阻燃剂、有机磷酸酯、新烟碱类杀虫剂及酚类化合物)的影响。大多数污染物引起NANOG-EGFP表达不同程度降低，提示其干扰多能性维持的核心转录网络而非仅产生非特异性细胞毒性。值得注意的是，双酚B(BPB)、双酚Z(BPZ)、全氟丁烷磺酸(PFBS)、磷酸三丁酯(TnBP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)及3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸(BHT-COOH)表现出显著的低剂量活性，即使在10 nmol/L浓度下也能显著抑制NANOG-EGFP信号。此外，在神经外胚层分化过程中，数种双酚类和PFAS延迟了NANOG的正常下调，表明其干扰早期发育进程中多能性退出及谱系转变的精密时序调控。综上，NANOG-EGFP hiPSC报告模型为环境毒物的高通量筛选提供了灵敏、稳定且实用的平台，并为污染物暴露如何干扰早期人类发育调控程序提供了机制层面的见解。
论文解读：基于NANOG-EGFP 人iPSC报告系统的环境污染物多能性干扰高通量筛选平台研究
研究背景与立项依据
早期胚胎发育对环境化学物高度敏感，双酚类、全氟/多氟烷基物质（Per- and polyfluoroalkyl substances, PFAS）、卤代阻燃剂、新烟碱类杀虫剂、有机磷酸酯及酚类化合物等广泛存在于环境与生物样本中，具有潜在内分泌干扰与发育毒性。传统动物实验周期长、成本高，而基于人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells, hESCs）或人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）的毒学评价虽能模拟早期发育，但现有方法存在通量低、难以实时监测多能性（Pluripotency）状态变化等局限。NANOG与OCT4、SOX2共同构成核心多能性转录网络，是维持未分化状态的关键标志分子。因此，建立可实时、定量监测内源性NANOG表达变动的hiPSC报告系统，对于高效筛查环境污染物对早期发育调控的干扰具有重要意义。该论文发表于《Environment & Health》。
主要关键技术方法
研究人员采用中国科学院干细胞库提供的DYR0100人iPSC系，利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（Homology-directed repair, HDR），将T2A-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）报告盒敲入NANOG基因终止密码子前的内源位点，经嘌呤霉素筛选及PCR鉴定获得纯合/杂合敲入克隆。将报告细胞接种于96孔板进行单细胞培养，以含0.1% DMSO的溶剂为对照，设置0.01、0.1、1、10 μmol/L四个浓度梯度，连续7天暴露于38种环境污染物并每日换液。使用多功能酶标仪检测488 nm激发/520 nm发射的EGFP荧光强度，以Day 1溶剂对照均值为基准进行相对荧光单位（Relative Fluorescence Units, RFU）归一化处理。为验证分化过程中的监测能力，研究人员还对报告细胞施加神经外胚层诱导（添加SB431542与LDN-193189的双SMAD抑制法），并在诱导期间同步加药观察NANOG-EGFP的下调动力学。数据统计采用GraphPad Prism 7.0进行均值±标准误（SEM）分析，n=3次独立生物学重复。
研究结果
3.1. Generation of NANOG-EGFP iPSCs（NANOG-EGFP iPSCs的构建）
研究人员设计靶向NANOG基因3'端外显子及3'UTR的sgRNA与含左右同源臂及T2A-EGFP-polyA的供体质粒，共电转hiPSCs后经嘌呤霉素筛选及单克隆挑取，获得EGFP阳性克隆。基因组PCR证实T2A-EGFP序列正确敲入NANOG等位基因，荧光显微镜显示未分化状态下克隆具清晰绿色荧光，证明内源性NANOG位点成功编辑且报告基因可反映NANOG表达。
3.2. Functional Characterization of NANOG-EGFP iPSCs（NANOG-EGFP iPSCs的功能表征）
研究人员将四个阳性克隆分别接种于24、48、96孔板，Clone 1显示最高信噪比与EGFP强度被选作后续实验株。在拟中胚层与神经外胚层定向分化中，EGFP荧光分别于诱导后Day 1急剧下降（中胚层）及Day 2开始下降并于Day 6–8达最低（神经外胚层），且荧光下降早于形态学改变，证实报告系统能灵敏捕捉多能性丢失早期的转录水平波动，适合高通量监测。
3.3. Fast-Screening of Environmental Pollutants' Adverse Effects on Self-Renewing NANOG-EGFP iPSCs（环境污染物对自我更新状态下NANOG-EGFP iPSCs不良影响的快速筛选）
研究人员以96孔板format对报告细胞连续7天暴露于38种化合物。结果显示多数污染物引起NANOG-EGFP信号下调：双酚类中BPB与BPZ低浓度即强抑制，BPA、BPS、BPF呈典型剂量依赖抑制；PFAS中PFBS在所有测试浓度均抑制表达，PFOA与PFOS呈梯度响应；新烟碱类中的啶虫脒（Acetamiprid, ACE）、有机磷酸酯中的TnBP与TCEP及酚类抗氧剂BHT-COOH亦显著抑制。结果表明该平台可高灵敏度检测化学品对多能性转录网络的干扰。
3.4. Bisphenols and PFAS Delay Pluripotency Exit during Neuroectoderm Differentiation（双酚类与PFAS在神经外胚层分化过程中延迟多能性退出）
选取7种双酚类与6种PFAS于神经外胚层诱导期同步处理。对照组NANOG-EGFP随分化推进逐渐下调，而BPA、BPS、BPB、BPZ、BPAF及PFOA、PFHxA、PFBA、PFBS等处理组明显延缓该下调过程，且在10 nmol/L至10 μmol/L范围内呈浓度依赖性。这说明部分环境污染物不仅破坏多能性维持，还干扰谱系特化过程中多能性退出的正常时序调控。
讨论与结论总结
讨论指出，该NANOG-EGFP hiPSC平台通过耦合内源性启动子驱动荧光蛋白，实现了对多能性状态快速、低耗、定量的高通量筛查，所需细胞量少、操作简便。筛查发现BPB、BPZ、PFBS等具显著低剂量（10 nmol/L）抑制活性，短链PFAS（如PFBS）在本报告系统中较传统认为毒性更强的长链PFAS显现更强早期转录扰动信号，归因于该系统捕捉的是干细胞身份调控网络的早期扰动而非生物富集或慢性代谢毒性。部分双酚与PFAS延迟NANOG下调，提示污染物可致发育时序紊乱，关联胚胎发育异常与神经疾患风险，此效应传统细胞活力检测难以发现。作者也阐明局限性：单一hiPSC系未涵盖个体遗传差异；仅反映多能性转录扰动而非整体细胞死亡或体内终点；统一浓度梯度便于横向比较但不等同真实暴露场景；荧光读数需结合多组学进一步解析机制。该平台定位于整合测试策略中的早期危害识别与优先级排序工具。
结论（翻译）
研究人员成功建立了基于NANOG-EGFP人iPSCs的环境污染物毒性检测模型。该NANOG-EGFP平台可用于环境污染物高通量筛选，并可评价其对多能性及早期发育的潜在影响。
