野生地-城市交界处的火灾：排放颗粒物的有毒物理化学性质及其对肺巨噬细胞的影响

《Environmental Science & Technology》：Wildland-Urban Interface Fires: Toxic Physicochemical Properties of Emitted Particulate Matter and Impacts on Lung Macrophages

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由于城市区域与野生地区的临近发展，野火越来越多地烧毁生物量和人造材料。这种“野生-城市交界（WUI）”火灾产生的颗粒物（PM）的物理化学性质可能与野生火灾和其他环境PM来源的颗粒物有很大不同。然而，WUI火灾颗粒物的性质与其危害之间的关联尚未被研究。在这里，我们使用了一个野火模拟器（WiFS）通过燃烧松木和一个简化的WUI火灾模型（松木和聚乙烯的1:1混合物）来再现这两种火灾。WUI火灾颗粒物中含有高浓度的有毒且致癌的PAH苯并[c]荧蒽，以及大量的高生物活性的烷基和氧合PAH，而这些在生物量火灾颗粒物中是不存在的，并且其致癌潜力（以苯并[a]芘当量BaPEq计算）是生物量火灾颗粒物的20倍。此外，THP-1巨噬细胞暴露于WUI火灾颗粒物后，其存活能力和线粒体潜力显著下降，吞噬1微米珠子的能力显著减弱，基因表达也出现严重紊乱。这些发现表明，WUI火灾颗粒物的暴露可能比野生火灾颗粒物的暴露更加危险，这可能是由于它们的化学成分不同。

引言
四十年来，野火的频率、范围和强度一直在增加，并预计会继续加剧。(1?3) 在美国，每年有超过63,000起野火，平均烧毁700万英亩的土地。(4) 2020年，大约70%的加利福尼亚州（CA）人口经历了超过100天的空气质量不佳，空气中PM2.5浓度很高。(5) 2020年加利福尼亚州的野火期间，每日PM2.5浓度达到了350–500 μg/m3，远高于美国环保署设定的24小时限值35 μg/m3。(6) 2023年6月，加拿大野火的烟雾飘到了纽约市（NYC）及其周边地区，导致多天的空气质量恶化，PM2.5浓度超过700 μg/m3。(7) 2025年1月，洛杉矶的火灾烧毁了38,000英亩的野生和城市区域，这是美国最大的野生-城市交界（WUI）火灾之一。(8) 我们实验室和其他机构的研究表明，野火烟雾是一种复杂的颗粒物和气体混合物，其中包含细颗粒（0.1–2.5 μm）和超细或纳米级（<0.1 μm）颗粒，(9,10) 其成分复杂，主要由有机碳（OC，>97%）组成，可能含有高浓度的多环芳烃（PAHs），以及增塑剂、阻燃剂、工业溶剂和重金属。(10?16) 在相似的环境背景PM暴露水平下，WUI火灾颗粒物与更高的呼吸系统、(17?20) 心血管、(20?22) 神经精神疾病(23) 以及全因死亡率(24,25)风险相关。我们团队和其他机构的研究还表明，WUI火灾颗粒物由于含有高氧化性的有机化合物，会导致肺部氧化应激和炎症水平更高。(12,16) 由于WUI火灾同时燃烧生物量和人造结构及材料，因此其产生的颗粒物可能比纯野生（生物量）火灾产生的颗粒物更具毒性。由于全球快速的城市化进程，WUI火灾颗粒物可能带来的更大健康风险日益受到关注。目前美国约有5000万户家庭位于WUI区域内，每三年就有100万户新家庭在WUI区域内建成。(26)

美国国家科学院、工程院和医学院最近回顾了我们对WUI火灾化学性质及其环境命运/传输和暴露潜在健康影响的理解，(27) 发现WUI社区的面积和数量正在迅速增加。报告强调了家庭和城市燃料来源在WUI火灾中的多样性和贡献，以及由此产生的WUI火灾排放物的复杂组成。尽管越来越多的证据表明WUI火灾颗粒物暴露与不良健康结果有关，(28) 但WUI火灾颗粒物暴露的具体影响尚未被研究。最近的一项比较人造材料和生物量燃烧的研究发现，包括高分子量PAHs、苯和甲醛在内的几种有毒化学物质的排放量，来自建筑和车辆材料的燃烧远高于生物量燃烧。(29) 因此，WUI火灾颗粒物在化学上可能更为复杂，潜在毒性也更高。因此，了解野生火灾颗粒物和WUI火灾颗粒物在化学组成、性质和毒性方面的差异至关重要。一个关键问题是这些差异如何反映在它们对肺巨噬细胞健康和先天免疫功能的影响上。由于这些细胞是抵御吸入病原体和颗粒物的主要防御机制，它们结合、吞噬和消除这些威胁的能力下降可能会增加呼吸道感染的风险或严重程度。

在本研究中，我们调查了单独燃烧松木（PW）或松木与高密度聚乙烯（HDPE）50:50混合物产生的颗粒物对人类THP-1巨噬细胞健康和先天免疫功能的影响。虽然现实世界中的WUI火灾颗粒物可能来源于多种生物量和人造燃料，在复杂的燃烧条件下产生，但相对简单的实验室燃烧过程使用了常见的野生生物量燃料（松木）和最丰富的塑料之一（PE），从而产生了代表这两种最可能燃料燃烧的颗粒物。

材料与方法
研究概述见图1。使用我们的WildFire Simulator (WiFS) (10,30?33) 燃烧松木碎片或松木与高密度聚乙烯（HDPE）颗粒的1:1混合物，分别生成模拟纯生物量野火和WUI火灾产生的颗粒物。使用Harvard Compact Cascade Impactor (CCI) (34) 对生成的颗粒物进行粒度分级，收集PM0.1粒径部分，分别称为PMB（模拟生物量野火的PM0.1部分）和PMW（模拟WUI火灾的PM0.1部分）。在整个燃烧过程中实时监测颗粒物大小、浓度和气体排放，并使用我们先前出版物中描述的最先进分析方法对颗粒物进行离线物理化学表征。(10,30?33)

图1. 研究设计概述。

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使用多路径颗粒剂量学（MPPD）模型计算在375 μg/m3的环境浓度下，PMB和PMW在人类肺部区域的沉积速率（μg/cm2/min），这一浓度与之前的野火事件测量值一致。(9,35,36) 根据沉积速率确定0.5天、5天和50天暴露期间的总沉积量。然后使用我们实验室先前开发的扭曲网格（DG）体外剂量学模型(37) 计算在细胞培养基中施加的PMB和PMW浓度，以实现24小时内的质量沉积（μg/cm2），即相当于0.5天、5天和50天肺部沉积的剂量。

THP-1巨噬细胞在这些浓度下暴露于PMB和PMW悬浮液24小时，进行毒理学评估，包括对细胞存活能力、细胞毒性、线粒体膜电位、氧化应激、细胞因子/趋化因子释放和基因表达的影响。最后，通过量化未调理的1微米荧光聚苯乙烯珠子的结合和吞噬作用来评估PMB和PMW暴露对THP-1巨噬细胞先天免疫功能的影响。

**模拟纯生物量野火PM0.1 (PMB) 和WUI火灾PM0.1 (PMW) 的生成、收集、粒度分级和提取**
使用我们的WildFire Simulator (WiFS) (10,30?33) 合成了模拟纯生物量野火PM (PMB) 和WUI火灾PM (PMW) 的PM0.1（≤0.1 μm）粒径部分。(10,30?33) 详细信息见补充方法。

**WiFS排放气体的实时监测**
在燃烧松木或松木+HDPE过程中，连续监测一氧化碳（CO）和总挥发性有机化合物（TVOCs）的浓度，并记录下来。详细信息见补充方法。

**排放颗粒物的实时监测和物理化学表征**
排放颗粒物的实时监测和物理化学表征的详细信息见补充方法。

**PMB和PMW中的有机碳和元素碳分析**
在燃烧高峰期收集的PMB和PMW上进行了有机碳和元素碳（EC-OC）的分析。详细信息见补充方法。

**PMB和PMW中的PAH和OPAH分析**
使用Tsiodra等人(38)描述的方案对燃烧高峰期PMB和PMW中的多环芳烃（PAHs）和氧合PAHs（OPAHs）进行了定量分析。方法细节见补充方法。

**根据PMB、PMW和PMH的PAH组成计算致癌潜力**
PAH混合物的致癌潜力以苯并[a]芘（BaP）当量表示，该当量是每种PAH浓度与其相应毒性当量因子（TEF）的乘积之和，后者表示其相对于BaP的致癌效力。

**PMB和PMW样品的内毒素和微生物无菌测试**
按照先前描述的方法评估了PMB和PMW中的内毒素水平。(20) 详细信息见补充方法。

**PMB和PMW悬浮液的制备和胶体表征**
按照作者先前描述的方法制备和表征PMB和PMW悬浮液。(39?41) 详细信息见补充方法。

**使用多路径颗粒剂量学（MPPD）模型进行PMB和PMW的肺部沉积建模**
使用多路径颗粒剂量学（MPPD）模型（v3.04）估计在375 μm3的环境浓度下，单位肺表面积的PMB和PMW质量沉积速率（μg/cm2/min）。然后使用MPPD结果（μg/cm2）确定在体外研究中施加的浓度（μg/cm3），以实现与MPPD模型预测的0.5天、5天和50天肺部沉积相对应的细胞剂量（μg/cm2）。MPPD建模方法的额外细节见补充方法。

**使用扭曲网格（DG）剂量学模型计算体外施加的PMB和PMW剂量**
使用扭曲网格（DG）体外剂量学模型(37) 确定施加的PMB和PMW浓度，以实现与MPPD模型预测的0.5天、5天和50天暴露相对应的细胞剂量（μg/cm2）。详细信息见补充方法。

**THP-1巨噬细胞的培养和制备**
THP-1巨噬细胞的培养和制备方法见补充方法。

**THP-1巨噬细胞暴露于PMB和PMW**
在RPMI培养基中制备了PMB和PMW悬浮液，浓度使得24小时内的质量沉积（μg/cm2）相当于在375 μm3的PMB和PMW环境下0.5天、5天和50天暴露后人类肺部发生的沉积量。培养基从96孔板中的成熟THP-1巨噬细胞中吸取；细胞用200 μL PBS洗涤一次，然后在每个孔中加入200 μL相应浓度的PMB或PMW悬浮液、溶剂对照或新鲜培养基。培养板在37°C下孵育4小时（用于氧化应激评估，见下文）或24小时（用于其他评估），同时通入5% CO2。

**细胞膜完整性评估（LDH释放）**
细胞膜完整性的评估方法见补充方法。

**细胞活力评估**
细胞活力评估方法见补充方法。

**氧化应激评估（活性氧生成）**
细胞活力评估方法见补充方法。线粒体膜电位的评估
线粒体膜电位的评估方法见补充方法。

细胞因子/趋化因子释放的评估
细胞因子/趋化因子释放的评估方法见补充方法。

THP-1巨噬细胞中先天免疫功能的评估
先天免疫功能采用作者先前开发的方法进行评估，该方法用于量化1 μm珠子的结合和吞噬作用（42,43）。该方法的具体细节见补充方法。

RNA-seq分析
RNA-seq分析的方法见补充方法。

统计分析
每种处理的毒性研究均重复三次。统计分析使用Prism 10软件（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）生成图表。毒性结果通过配对t检验比较溶剂组和阳性对照组与未处理组，并通过单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验比较溶剂组与PMB和PMW暴露组。

结果与讨论
PMB和PMW及其他气态污染物的物理化学特性
PMB和PMW的元素组成存在显著差异（图S1）。虽然硫是PMB和PMW中的主要成分，但在PMW中的占比（75.52%）远高于PMB（43.14%）。除硫外，PMB中其他主要成分依次为钙（17.52%）、钠（11.67%）和铝（8.74%），而PMW中其他主要元素为钙（4.55%）、铝（4.47%）、钾（3.96%）和铁（3.88%）。

多环芳烃（PAHs）的分析显示PMB和PMW之间存在显著差异（图2）。PMB中的PAHs以Retene为主（78.01%），其中还包括芘（7.59%）、荧蒽（5.95%）、菲（3.24%）和 Chrysene（1.17%）（图2A,B）；而PMW中Retene仅占38.57%，其PAHs成分中芘（9.43%）、菲（9.40%）和荧蒽（9.14%）的浓度较高，且含有Benz(o,c)fluorene（PMB中不存在该成分，图2A,C）。Benz(o,c)fluorene的存在表明PMW具有更高的毒性和致癌性，因为7H-benzo(c)fluorene具有高度毒性和致癌性（44,45）。然而，由于7H-benzo(c)fluorene和11H-benzo(b)fluorene在单一光谱峰中混合释放，无法分别确定它们的贡献。基于单独焚烧HDPE产生的PM0.1的PAH分析（图2A,D），PMW的PAH组成并非PMB和PMHDPE的简单混合，而是含有较高比例的Retene，并且其他PAHs的含量远低于PMHDPE。这表明松木（生物质）成分在PMW中的PAH贡献更大。此外，PMW和PMHDPE中含有大量氧化PAHs，而PMB中未检测到OPAHs（图3）。

图2
图2. PMB、PMW和PMHDPE的PAH浓度及百分比组成。A. PMB、PMW和PMHDPE中的PAH浓度。B. PMB中的PAH饼图。C. PMW中的PAH饼图。D. PMHDPE中的PAH饼图。

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图3
图3. PMB、PMW和PMHDPE的氧化PAH浓度及百分比组成。A. PMB、PMW和PMHDPE中的氧化PAH浓度。B. PMW中的氧化PAH饼图。C. PMHDPE中的氧化PAH饼图。

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按PAH类别分析（传统PAHs——EPA列出的16种PAHs；新兴PAHs——最近发现的、烷基化的和氧化的PAHs）显示，PMB中新兴PAHs的含量（860 ng/m3）远高于PMW（579 ng/m3）或PMHDPE（260 ng/m3），而PMW和PMHDPE均含有大量烷基化和氧化PAHs，PMB中则不含这两种PAHs（图S2）。具体而言，PMW中含有246 ng/m3的烷基PAHs和96 ng/m3的氧化PAHs，PMHDPE中含有132 ng/m3的烷基PAHs和274 ng/m3的氧化PAHs。由于氧化PAHs通常具有高毒性，这表明WUI火灾产生的PM（PMW）的潜在毒性可能高于纯生物质野火产生的PM（PMB）。

PMW的PAH和OPAH组成中包含多种PMB中不存在的物种，包括荧蒽、C1-烷基化菲和蒽类、Benz(o,c)fluorene、Benz(ghi)fluoranthene、Coronene、11H-benzo[a]fluorenone、6H-benzo[de]anthracene-6-one、11H-benzo[b]fluoren-11-one、7H-benzo[de]anthracen-7-one和6H-benzo[cd]pyren-6-one（图2和图3）。除Coronene外，这些物种也存在于单独焚烧HDPE产生的PM（PMHDPE）中。因此，PMW中Coronene的存在可能代表了松木和HDPE共燃过程中产生的独特化学产物。需要进一步研究不同种类和混合燃料燃烧产生的PM，以确定Coronene或其他化学特征是否可作为WUI火灾PM的特异性标志物。

实时监测松木（PW）和PW+HDPE焚烧过程中排放物的结果见图S3和图S4，分别显示了燃烧过程中不同时间和温度下的颗粒数浓度（通过SMPS和APS测量）。燃烧约22分钟后（温度约为500°C），SMPS测得的最大颗粒浓度为PW约为1 × 10?颗粒/cm3，PW+HDPE约为2 × 10?颗粒/cm3；APS测得的较大直径颗粒（>523 nm）的最大浓度同样出现在燃烧约20分钟后，PW约为6 × 10?颗粒/cm3，PW+HDPE约为6.1 × 10?颗粒/cm3。

图S5显示了PW和PW+HDPE焚烧过程中各粒径分数的气溶胶质量分布和浓度。如预期，PM0.1的质量浓度在PW和PW+HDPE中均最高，分别为PW PM约21 mg/m3和PW+HDPE PM约15 mg/m3。PM0.1–2.5的质量浓度略高，分别为PW PM约31 mg/m3和PW+HDPE PM约16 mg/m3，这符合此类燃烧过程的特性。

还测定了HDPE燃烧过程中气体挥发性有机化合物（VOCs）和一氧化碳的排放量（图S6和图S7），结果显示燃烧约25分钟后（温度约为600°C），两种材料的VOC排放量约为1.5 × 10? ppb，一氧化碳排放量分别为PW约为700 ppm和PW+HDPE约为900 ppm。

本研究选择1:1的松木:HDPE燃料混合物作为初步研究纯生物质和WUI火灾PM之间物理化学和毒理学差异的简单起点。实际WUI火灾的燃料组成可能更为复杂，包括多种木材以及各种人造材料（如建筑材料、储存的石油产品、工业和家用化学品、塑料聚合物等）。此外，虽然本研究中的松木/HDPE混合物是在火焰条件下焚烧的，但WUI火灾中野生动植物和人造燃料的燃烧往往在闷烧条件下进行，这会产生化学成分和毒理学性质截然不同的颗粒物。闷烧燃烧的特点是在低温（450–700°C）下燃烧速率较慢（46,47）。固体燃料燃烧释放的热量（6–12 kJ/g）远低于火焰燃烧（16–30 kJ/g）（48）。户外大型火灾中常见闷烧现象，例如泥炭和煤炭的燃烧（49）。相比之下，火焰燃烧初期会产生大量热量，随后逐渐减弱并趋于稳定（50）。研究表明，闷烧产生的颗粒物比高效生物质燃烧产生的颗粒物更具毒性（51,52），并且与不良心血管效应有关（53）。未来的研究将使用更多种类的WUI燃料混合物及火焰和闷烧条件，以涵盖实际WUI火灾中可能存在的各种燃料和燃烧情况。

内毒素和无菌性分析
经过14天的培养后，在接种了PMB、PMW或溶剂对照的琼脂平板上未检测到微生物。PMB、PMW样品及溶剂对照中均未检测到内毒素，所有结果均低于检测限（LOD）。

PMB和PMW在水及细胞培养基（RPMI1640 + 10% FBS）中的胶体特性
PMB和PMW在水及RPMI1640 + 10% FBS中的胶体特性分析结果见表S1。临界分散超声能量（DSEcr）是指实现颗粒稳定水悬浮液所需的超声能量，该悬浮液具有最低程度的聚集和最小的颗粒水动力直径（dH），其值为1087.8 J/mL（PMB和PMW均如此）。PMB在水中的水动力直径（dH）为421.9 ± 30.5 nm，多分散指数（PdI）为0.199 ± 0.020，ζ电位值为?34.30 ± 0.95 mV，表明颗粒具有有效的静电稳定性和良好的胶体分散性。PMW在水中的dH为238.5 ± 1.2 nm，PdI为0.318 ± 0.029，ζ电位值为?27.40 ± 11.80 mV。这两种颗粒悬浮液在水中均稳定24小时。相比之下，PMB和PMW在细胞培养基中的悬浮液尺寸更大，多分散性更高，ζ电位更负。PMB在培养基中的dH为59.0 ± 50.5 nm，PdI为0.358 ± 0.002，ζ电位值为?9.86 ± 0.71 mV；PMW在培养基中的dH为31.6 ± 12.4 nm，PdI为0.561 ± 0.233，ζ电位值为?10.00 ± 0.96 mV。ζ电位的增加可能是由于负电荷血清蛋白的吸附和蛋白质冠层的形成。

目标暴露下PMB和PMW在人体肺部的沉积
使用MPPD模型评估了在375 μg/m3环境浓度下暴露0.5天、5天和50天后PMB和PMW在肺部区域的沉积情况，这代表了频繁发生野火或WUI火灾地区的实际暴露情景。PMB和PMW在肺部区域的沉积速率（μg/cm2/min）见表S2。根据MPPD计算，PMB和PMW在肺部区域的沉积速率为3.26 × 10?? μg/cm2/min。目标暴露剂量（0.5天、5天和50天）分别为1.98 × 10?3 μg/cm2、1.98 × 10?2 μg/cm2和0.198 μg/cm2。

体外细胞培养中所需的PMB和PMW浓度
使用DG体外剂量模型（37）确定培养基中PMB和PMW的给药浓度，以模拟在375 μg/m3环境浓度下暴露0.5天、5天和50天后肺部质量沉积（μg/cm2）。根据MPPD模型计算，这些给药剂量分别为1.98 × 10?3 μg/mL、1.98 × 10?2 μg/mL和1.98 μg/mL。

PMB和PMW的致癌潜力
PMB和PMHDPE的致癌潜力以Benzo[a]pyrene当量（BaPEq）表示，结果显著高于PMB（图S8）。具体而言，PMB、PMW和PMHDPE的BaPEq值分别为24、483和799 ng/m3。假设Benz(o,c)fluorene峰的一半由7H-benzo(c)fluorene组成（PMB中不含该成分），则PMB和PMHDPE的BaPEq主要来源于7H-benzo(c)fluorene（分别为92%和75%）。PMB和PMW对肺巨噬细胞毒性的影响评估
PMB和PMW在PMA分化THP-1巨噬细胞中的体外毒性评估结果总结在图4中。

图4. PMB和PMW对THP-1巨噬细胞的毒性效应。
A. 暴露于PMB、PMW、溶剂对照或裂解缓冲液24小时后的细胞毒性（% LDH释放）。
B. 暴露于PMB、PMW或溶剂对照24小时后，使用PrestoBlue检测法评估的细胞活力。
C. 暴露于PMB、PMW、溶剂对照或甲基多酚（阳性对照）4小时后的细胞内活性氧（ROS）水平。
D. 暴露于PMB、PMW、溶剂对照或CCCP（阳性对照）24小时后，使用JC-1线粒体膜电位试剂盒评估的巨噬细胞线粒体电位。
（N = 3。** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）

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在所有三种剂量下，PMB和PMW暴露24小时均导致显著的细胞毒性，表现为LDH释放（图4A）。PMB在低剂量和中剂量下导致约25%的细胞毒性（p < 0.001），在高剂量下导致约30%的细胞毒性（p < 0.0001）；而PMW在低剂量下导致约37%的细胞毒性（p < 0.0001），在中剂量和高剂量下的细胞毒性略低（但无显著差异，p < 0.0001）。这些观察结果表明，即使以低至1.98 × 10–3 μg/cm2的细胞剂量，PMB和PMW也能破坏PMA分化THP-1巨噬细胞的细胞膜。

通过测量线粒体酶活性来评估PMA分化巨噬细胞在PMB和PMW暴露后的细胞活力（图4B）。仅PMB的中剂量和高剂量导致细胞活力显著下降，中剂量（1.98 × 10–2 μg/cm2）下的细胞活力降至约85%（p < 0.01），高剂量（1.98 × 10–1 μg/cm2）下的细胞活力降至约80%。PMW在所有三种剂量下均导致细胞活力显著下降，低剂量（1.98 × 10–3 μg/cm2）和中剂量（1.98 × 10–2 μg/cm2）下的细胞活力降至约73%（p < 0.0001），高剂量（1.98 × 10–1 μg/cm2）下的细胞活力降至约75%（p < 0.0001）。PMW相比PMB导致更大的细胞活力下降可能归因于PMB和PMW中多环芳烃（PAH）组成的差异，特别是PMW中存在的烷基和氧化PAH（OPAHs）以及新兴PAHs，而这些在PMB中不存在。OPAHs，尤其是6H-苯并[cd]芘-6-酮等物质具有致突变性，并与肿瘤促进有关。（55）PMW中存在的7H-苯并[c]荧光烯是一种新兴PAH，其毒性当量因子（TEF）是苯并[a]芘（BaP）的20倍（56），并且被认为是一种强效的肺肿瘤诱因（57），这也可能解释了其比PMB更高的毒性。即使少量这种化合物也会显著影响PAH混合物的估计致癌性（BaPEq）（38），如图S8所示并已在上文讨论。在PMW样本中检测到的无机元素（例如Fe、S，见图S1）也可能导致细胞活力下降，PMW中较高的硫含量可能是其更大影响的部分原因。先前的研究发现，来自环境和职业暴露的含PAH和金属的PM具有遗传毒性，可能导致DNA损伤，从而引起细胞周期停滞、凋亡和细胞活力降低。（58,59）

与未经处理和溶剂对照相比，暴露于任何剂量的PMB或PMW后均未观察到氧化应激（ROS产生）的统计学显著增加（图4C）。

使用JC-1试剂盒在暴露于PMB和PMW 24小时后评估线粒体膜电位（图4D）。PMB在任何剂量下均对线粒体膜电位没有显著影响。相比之下，所有剂量的PMW均导致线粒体膜电位显著下降，表现为JC-1检测中红色与绿色荧光比值的降低。在低剂量（1.98 × 10–3 μg/cm2）和中剂量（1.98 × 10–2 μg/cm2）下，PMW导致红色/绿色荧光比值下降约15%（p < 0.01）；在高剂量（1.98 × 10–1 μg/cm2）下，PMW暴露使红色/绿色荧光比值下降约50%（p < 0.0001），与溶剂对照相比。使用CCCP（阳性对照）处理后，红色/绿色荧光比值下降约30%（p < 0.0001），这与预期一致。

我们之前发现，THP-1巨噬细胞暴露于仅由HDPE焚烧产生的PM0.1同样会导致细胞毒性增加、活力降低和线粒体膜电位受损，但ROS产生没有显著增加。（60）这表明用于生产PMW的松木+HDPE燃料中的HDPE成分的燃烧产物可能是观察到的大多数毒性效应的原因。

值得注意的是，PMW导致线粒体膜电位显著下降，而未检测到ROS产生。通常，线粒体膜电位的下降与ROS产生增加密切相关。由于ROS种类不稳定，这可能是由于暴露时间（本研究中为4小时）所致。尽管我们的阳性对照（甲基多酚）在4小时时产生了强烈的ROS信号，但PMW暴露产生的ROS可能更早或更晚产生，或者以缓慢稳定的速率产生，并被细胞内抗氧化酶和分子（谷胱甘肽）中和，因此从未积累到可检测的水平。在未来的研究中，将使用特定的线粒体-ROS探针（如线粒体超氧化物检测方法），并评估还原型谷胱甘肽的消耗或其他氧化应激标志物（脂质过氧化和蛋白质羰基化）以进一步阐明ROS产生的问题。

**PMB和PMW对巨噬细胞细胞因子和趋化因子释放的影响**
通过定量分析细胞上清液中的48种细胞因子和趋化因子，评估了PMA分化THP-1巨噬细胞在暴露于最高剂量（1.98 × 10–1 μg/cm2）的PMB和PMW 24小时后的炎症反应。结果表明，与未经处理或溶剂对照相比，PMB和PMW均未显著改变任何一种细胞因子的释放（图S9）。如预期，LPS（阳性对照）处理导致多种细胞因子和趋化因子显著增加。缺乏细胞因子/趋化因子反应表明PMB和PMW均未引发显著的炎症反应。

**PMB和PMW对巨噬细胞吞噬作用的影响**
如补充方法所述，评估了PMB和PMW暴露对未调理的绿色荧光1.0 μm聚苯乙烯珠子吞噬作用的影响。图5显示了未经处理、阳性对照（细胞松弛素D）以及PMB或PMW处理的THP-1巨噬细胞与珠子孵育并染色后的代表性图像，以及吞噬作用的定量分析结果。内化的珠子呈现绿色，而外部的珠子呈现橙黄色（由于红色荧光AlexaFluor568-链霉亲和素与绿色荧光生物素化珠子结合）。在未经处理的细胞中（图5A），大多数珠子似乎已被内化（仅呈绿色）。在用细胞松弛素D处理的细胞中（阳性对照，肌动蛋白聚合抑制剂；图5B），很少有内化的（绿色）珠子，外部（橙黄色）珠子似乎结合并积聚在细胞膜上，表明内化过程存在缺陷。

图5. 暴露于PMB或PMW后荧光标记聚苯乙烯珠子的吞噬作用评估。
A. 未经处理（仅培养基）。
B. 细胞松弛素D（阳性对照）。
C. PMB暴露5天等效剂量（给药剂量：1.98 × 10–2 μg/cm2）。
D. PMB暴露50天等效剂量（给药剂量：1.98 × 10–1 μg/cm2）。
E. PMW暴露5天等效剂量（给药剂量：1.98 × 10–2 μg/cm2）。
F. PMW暴露50天等效剂量（给药剂量：1.98 × 10–1 μg/cm2）。
G. 每个细胞的平均珠子总数（内化+外部/结合）。
H. 每个细胞的内化珠子平均数。
I. 内化珠子的平均百分比。细胞松弛素D。（N = 3。* p < 0.05）

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在用中等或高剂量PMB处理的THP-1巨噬细胞中，大多数珠子似乎已被内化，与未经处理的对照组相似（图5C,D）。同样，在中等剂量PMW处理的细胞中，珠子的摄取似乎未受影响（图5E）。然而，在高剂量下，暴露于PMW的THP-1巨噬细胞中内化的珠子较少（仅呈绿色）（图5F），表明内化或结合过程存在缺陷。

与共聚焦图像的结果一致，中等和高剂量的PMB暴露以及中等剂量的PMW暴露对每个细胞的珠子总数（图5G）、每个细胞的内化珠子数（图5H）或内化珠子的百分比（图5I）均无影响。然而，在高剂量下，PMW暴露导致每个细胞的珠子总数和内化珠子数均显著下降约50%（p < 0.05）。由于总珠子数（结合+内化）和内化珠子数均下降，因此内化珠子的百分比没有变化。这些发现表明，PMW主要影响了吞噬作用的结合步骤，而不是内化过程。这可能是由于吞噬受体（如清道夫受体MARCO）的表达减少，或者这些受体被PMW颗粒阻断所致。由于肺泡巨噬细胞结合、吞噬和中和病原体及颗粒的能力对先天免疫防御至关重要，WUI PM对这些功能的损害可能比纯生物质野火引起的损害更为严重。

有趣的是，在我们之前的研究中，当THP-1巨噬细胞暴露于仅由HDPE焚烧产生的PM0.1时（PMHDPE），（60）虽然吞噬作用也显著降低，但内化也显著减少，表明吞噬作用受损而非结合过程受损。（60）这种差异可能是由于PMHDPE中存在更多的有毒化学物质，特别是PAHs。如上所述，PMW的PAH组成中高分子量和有毒PAH及OPAHs的含量高于PMB，其整体组成更接近PMW与PMHDPE的50/50混合物。需要进一步研究使用不同野生和人造燃料生成的PMW，以评估不同燃料对巨噬细胞结合和内化功能的影响。

**PMB和PMW对巨噬细胞基因表达的影响**
通过RNA-seq评估了PMB和PMW暴露对基因表达的影响。图6总结了THP-1巨噬细胞暴露于最高剂量PMB和PMW（相当于375 μg/m3吸入暴露50天）后的基因差异表达情况。共有421个蛋白质编码基因（PCGs）仅在PMB处理的THP-1巨噬细胞中表达，451个PCGs仅在对照组中表达，12,017个PCGs在PMB处理的细胞和对照组细胞中均表达（图6A）。暴露于PMW的THP-1巨噬细胞独特表达了577个PCGs，未经处理的对照组独特表达了621个基因，而PMB暴露和对照组细胞均表达了11,850个PCGs（图6B）。这些发现表明，PMB或PMW的暴露会激活数百个PCGs的表达，同时抑制数百个其他PCGs的表达。值得注意的是，PMW处理（模拟WUI火灾PM）激活或抑制的PCGs表达比PMB处理（模拟纯野生/生物质火灾）多约25%，这进一步证明了WUI火灾PM可能比纯野生火灾PM具有更大的危害性。

图6. 表达/RNA-seq。
A. 文氏图显示仅在未经处理的细胞和PMB处理的细胞中独特表达的蛋白质编码基因数量。
B. 文氏图显示仅在未经处理的细胞和PMB处理的细胞中独特表达的蛋白质编码基因数量。
C. 火山图显示PMB处理的巨噬细胞中相对于未经处理的巨噬细胞显著下调（p < 0.05，?log10p > 1.3）和上调的蛋白质编码基因数量。
D.火山图显示了在PMW处理的巨噬细胞中显著下调（p < 0.05，?log10p > 1.3）和上调的蛋白质编码基因，与未处理巨噬细胞中的表达相比。热图展示了在未处理和PMW处理的巨噬细胞单个重复样本中显著下调和上调的基因（p < 0.05，?log10p > 1.3），其倍数变化大于2（log2倍数变化大于1）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片。火山图（log2倍数变化与?log10p）显示了表达显著失调的PCGs（p < 0.05，?log10p > 1.3），揭示了暴露于PMB和PMW之间的显著差异，PMW显著改变了更多PCGs的表达（图6C,D）。PMB仅显著上调了一个PCG的表达并下调了两个PCG的表达，而PMW显著上调了444个PCG的表达并下调了359个PCG的表达。在表达热图中展示了倍数变化大于2（log2倍数变化大于1）的显著下调或上调的PCGs（图6E）。没有基因在暴露于PMB后其倍数变化超过2。

多个参与免疫反应、解毒和细胞死亡的基因在暴露于PMW后显著上调（?log10p > 1.3，log2倍数变化 >1）（但在PMB中未上调）。促炎趋化因子白细胞介素8（CXCL8, IL-8）显著上调。在完整的肺中，IL-8表达的增加会诱导或加剧细胞浸润和炎症。另一种关键的促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL1B）也在PMW作用下显著上调（但在PMB中未上调）。尽管IL1B表达的增加可能导致肺部炎症的诱导或加剧，但其转录本以前体蛋白的形式产生，需要由炎性小体（例如NALP3）激活才能切割前体蛋白以产生活性IL-1β细胞因子。虽然可以预期PMW也会通过类似机制激活炎性小体，但并未观察到IL-1β分泌的增加（图S9）。这表明，尽管IL1B在PMW作用下上调，但这种反应本身不一定会导致肺部炎症。

细胞色素P450家族1亚家族A多肽1（CYP1A1），也称为芳烃羟化酶（AHH），作为细胞色素P450酶家族的成员，在PMW作用下也上调（但在PMB中未上调），这表明外源性物质代谢途径被激活，可能将PAHs解毒或转化为更具生物活性的形式。（61,62）观察到的CYP1A1上调可能是由于芳烃受体（AhR）对PAH暴露的反应。（63）先前的研究表明，PAHs的疏水性和低溶解度影响了参与AhR信号通路的基因表达。（63）然而，芳烃受体抑制剂（AHRR）的表达并未在PMW暴露下显著失调，这表明PMW PAHs对AhR的激活并未受到抑制，从而允许CYP1A1持续上调。其他显著上调的基因包括核受体4A3（NR4A3），它编码一种激活凋亡的p53受体；以及触发受体4（TREML4），它编码一种参与先天免疫反应调节的巨噬细胞受体。（66）最后，暴露于PMW（但在PMB中未上调）导致编码C型凝集素结构域家族成员（CLEC10A、CLEC12A、CLEC12B、CLEC12A和CLEC7A）的基因下调，这些基因作为模式识别受体在先天免疫反应中起作用。（67）同样，PMW暴露还导致CX3C基序趋化因子受体1（CX3CR1）下调，该受体在病原体刺激下可刺激免疫细胞的募集；以及主要组织相容性复合体（MHC）蛋白HLA-DPA1（MHC II类，DP alpha 1）和HLA-DRA（HLA II类组织相容性抗原）下调，这些蛋白参与抗原呈递。PMW暴露（但在PMB中未上调）还导致白细胞介素33（IL33）下调，IL33被归类为“警报”细胞因子，可激活免疫和过敏反应；以及Toll样受体7（TLR7）和Toll样受体8（TLR8）下调，这些受体在抗病毒免疫反应中起关键作用。（69）这些细胞因子和C型凝集素的下调可能会损害肺部的先天免疫反应。

PMW暴露并未显著影响编码吞噬受体的基因表达，包括Fcγ受体（FCGR1A、FCGR2A和FCGR3A）以及清道夫受体CD36和MARCO。由于PMW暴露似乎主要通过损害结合能力来减少PS珠子的吞噬作用（图5G–I），这表明其效应可能是由于PMW与吞噬受体的相互作用，导致结合位点被阻断或构象变化，从而影响结合。需要进一步研究来评估和表征模型PMW颗粒与吞噬受体的相互作用。

结合生存率下降（图4B）和线粒体膜电位降低（图4D）以及吞噬功能受损（图5），这些现象在PMW暴露后比PMB暴露后更为明显，本研究的结果强烈表明，WUI火灾PM0.1对肺巨噬细胞的健康和功能有更大的负面影响，因此造成的不良健康效应更为显著。WUI火灾PM的更高毒性很可能与其化学成分有关，特别是其中含有高毒性的烷基和氧化PAHs。此外，PMW的致癌潜力（BaPEq）远高于PMB（483 ng/m3 vs 24 ng/m3）（图S6），表明PMW可能比PMB构成更严重的公共卫生危害。鉴于城市发展迅速侵入野生地区，加上全球气温升高和干旱条件的加剧，WUI火灾PM的化学复杂性和毒性更高的公共卫生影响令人担忧。迫切需要全面评估WUI火灾PM的物理化学性质及其潜在的健康影响，以便为风险评估人员和监管机构提供评估WUI火灾相关健康风险所需的数据。