《硫磺与水银的交汇：从葡萄园到湿地的农业硫肥施用与甲基汞生成的相互作用》

《Environmental Science & Technology》：Where Brimstone Meets Quicksilver: Interactions between Agricultural Sulfur Applications and Methylmercury Production along a Vineyard to Wetland Gradient

　　高分辨率图像 下载 MS PowerPoint 幻灯片

汞（Hg），尤其是甲基汞（MeHg），是一种强效的神经毒素，对人类和野生动物有严重影响。本研究探讨了美国加利福尼亚州葡萄园中用作杀菌剂的硫与汞甲基化之间的相互作用。我们在纳帕谷葡萄酒种植区的末端，沿着从葡萄园到湿地的梯度收集了表层土壤和土壤孔隙水，以分析硫酸盐、总汞和甲基汞的含量。我们发现，来自葡萄园的硫酸盐通过排水沟和草地过渡带被输送到相邻的湿地中。此外，湿地和排水沟中的甲基汞浓度以及以甲基汞形式存在的汞的比例大约是葡萄园和草地过渡带土壤的三到八倍，而在48小时时间内的潜在净汞甲基化速率（kmeth）在湿地中大约是葡萄园的十倍。湿地和排水沟中汞甲基化的促进可能是由于土壤湿润且还原条件较好所致。

引言
由于《清洁空气法》及其修正案等国家政策减少了人为硫排放，美国及其他地区的空气中的硫沉积量一直在下降。（1?4）然而，与空气硫沉积量减少的同时，全球许多农作物系统的农业硫输入量却有所增加，这主要是由于农业集约化以及作物病害风险的提高。（5?8）目前农业中的硫使用量远远超过了酸性沉积物带来的硫负荷峰值，因为硫被用作多种作物的杀菌剂、肥料和土壤pH调节剂；可以说，硫在农业中无处不在。（9?11）例如，在美国中西部，从1985年到2015年，硫肥的使用量增加了一倍多，导致平均每年每公顷农业土壤中的硫添加量增加了0.10千克，而同期空气中的硫沉积量减少了0.12千克/公顷。（12）在农业系统中，硫以多种形式施用，从元素硫（S0）到硫酸盐（SO42?）和有机硫。当以S0形式施用时，它通常会迅速氧化为SO42?。（13）进入环境后，SO42?可以从农业土壤中渗入附近的生态系统，包括湿地，在那里它会被还原为硫化物（S2?）（图1）。（14,15）虽然硫化物的产生本身就令人担忧，因为它对许多水生生物具有毒性（15?18），但SO42?的微生物还原过程也影响汞（Hg）的生物地球化学循环。（9,19）甲基汞是一种强效的神经毒素，对人类和野生动物有严重影响。（20,22）在厌氧条件下，硫酸盐还原细菌是将无机汞转化为甲基汞（MeHg）的主要微生物类群之一。（23,24）

图1
图1. 从葡萄园通过草地过渡带到湿地的硫（S）和汞（Hg）的输入、输送及转化的过程示意图，包括甲基汞（MeHg）的产生过程。

因此，更高的人为硫输入量可能会增加甲基汞的产生，实验室和实地研究已经证明了这一点。（25–27）在之前的埃弗格莱兹水资源保护区生态系统水平的研究中，这种硫与甲基汞之间的联系尤为明显，上游农业区的硫输入与甲基汞的高产生量直接相关。（28）Orem及其同事（2020）发现，径流中适量的SO42?浓度能刺激高甲基汞的产生，而低水平的SO42?浓度则与较低的甲基汞产生量相关。（28）然而，尽管SO42?浓度与甲基汞产生量通常存在相关性，但高水平的硫化物产生也可能抑制汞的甲基化（31?34），这可能是由于形成了相对不活跃的HgS、与溶解有机物的结合（35?38）以及/或微生物甲基化能力的降低（39）。这种关系被称为“金发姑娘曲线”，即非常低和非常高的SO42?浓度都会抑制甲基汞的产生，而适中的SO42?浓度则会促进其产生。（40）大多数描述SO42?可用性与甲基汞产生量之间关系的研究发生在低地湿地（例如参考文献25,27,29,30）；很少有研究考察在高地农业土壤及其下游湿地中的这种相互作用。需要注意的是，并非所有研究都报告了这种抑制关系，例如关于季节性草原湿地池塘的研究。（41）

美国加利福尼亚州纳帕谷葡萄园中将硫用作杀菌剂为我们提供了研究硫输入及其与汞相互作用的环境影响的机会。在这些葡萄园中，农民单独施用硫，而不与其他营养物质（如氮、磷）同时施用，从而可以单独研究硫输入的效果，而不受其他变量的干扰。此外，该地区的湿地和海湾（旧金山湾和圣巴勃罗湾）沉积物、鱼类和鸟类体内的汞含量较高。（42,43,44）这些高汞含量是由于内华达山脉的历史金矿开采使用了汞来提取黄金、含汞的朱砂矿开采（46?48）以及大气中的汞沉积所致。这种环境背景使我们能够研究从高地土壤到邻近湿地的农业硫添加和土壤汞处理的相互作用——这种环境情况在全球其他地区也很常见。

在这项研究中，我们提出了以下问题：（1）农业中的硫输入是否会从葡萄园土壤传输到附近的湿地？（2）耕地土壤与相邻湿地之间的汞甲基化速率有何差异？（3）不同季节的汞甲基化模式有何变化？我们在位于纳帕谷葡萄酒种植区末端和纳帕河流域的研究区域内，沿着从葡萄园到湿地的梯度探讨了这些问题。在葡萄园和湿地之间，我们考虑了排水沟和介于两者之间的草地过渡带。我们预计硫酸盐会通过排水沟或草地过渡带从葡萄园传输到附近的湿地，尤其是在雨季初期降雨时。由于排水沟和湿地中的厌氧条件以及硫酸盐可能从葡萄园传输到这些地点，我们预计湿地的汞甲基化速率会最高。随着汞甲基化速率的提高，我们也预计会测量到高于葡萄园土壤中的甲基汞浓度和潜在的甲基汞产生量。另一方面，如果我们考虑到湿地可能从海洋来源获得大量硫，根据“金发姑娘曲线”，汞甲基化可能会受到抑制。我们还假设，在雨季中期，由于土壤较湿润且还原条件较好，甲基化速率会比季节初期更高。

材料与方法
研究区域
我们在美国加利福尼亚州纳帕河流域的卡内罗斯地区（38.21°N, 122.35°W；图2）沿着从葡萄园通过草地过渡带到湿地的梯度采集了样本。该葡萄园种植了101-14种砧木的霞多丽葡萄，种植行垂直于海湾边缘。根据干季的测量结果，葡萄园位于距离海湾边缘约310米处，毗邻其他葡萄园区块和通路。截至2021年，这些葡萄园采用无耕作制度，行间种植覆盖作物并施用有机肥。在生长季节，葡萄种植者使用储水池中的水进行灌溉。在之前的雨季，储水池通过溪流径流得到补充，并加入来自索诺玛和纳帕的再生废水。纳帕河流域面积为1103平方公里，主要由森林（占流域的36%）、草地/灌木丛（占流域的30%）和葡萄园（占流域的13%）组成，其余的土地用途包括农业、牧场和城乡住宅区（图2）。（49）本研究地点的湿地属于圣巴勃罗湾的一部分，该湾与旧金山湾河口相连。

图2
图2. 研究地点位于加利福尼亚州纳帕谷的位置。颜色代表土地用途/覆盖类型。插图显示了采样示意图，每个点代表一个采样位置。

该地区具有地中海气候。降雨通常发生在10月至3月（即“湿润”或“休眠”季节），而葡萄酒葡萄的种植期为4月至9月（即“干燥”或“生长”季节）。年降水量在107至792毫米之间，平均为482毫米。（50）有时，葡萄园土壤的饱和度超过0.5米深。（51）在生长季节，每周或每两周会喷洒一次元素硫作为杀菌剂，以防止白粉病。

样品采集
我们在研究区域内设置了24个采样点，覆盖了三种土地用途/覆盖类型的梯度（图2）。在三条样带中，每条样带上有两个位于葡萄园的采样点，每个草地过渡带和湿地各有两个采样点。在其中一条样带上，三个草地过渡带的采样点位于排水沟内（以下简称“排水沟”站点）。需要注意的是，在干季和雨季的部分时期，湿地和排水沟的采样点较为干燥，而在雨季的部分时期，草地过渡带的采样点完全被水淹没（水深达几厘米）。2022年12月，在季节首次降雨后，我们在葡萄园、草地过渡带和湿地的每个采样点安装了张力式蒸渗仪（SoilMoisture, Inc.），深度为土壤/沉积物表面以下30厘米。

我们在2022年12月至2023年2月的每次降雨后及随后的湿润期间采集了孔隙水样本（共10次采样事件；图3），当时有孔隙水存在。2023年3月、4月和5月以及次年的12月和2月，我们也每月采集了一次孔隙水样本。孔隙水样本是通过0.45微米过滤器（Thermo Scientific，无菌聚醚砜[PES]）在现场过滤后收集到经过酸处理的HDPE瓶中，用于分析硫酸盐含量。2022年12月和2023年1月的几个时间点，我们在之前观察到大量孔隙水的采样点采集了未过滤的孔隙水样本以进行汞分析。所有样本均按照EPA方法1669使用“清洁手-脏手”程序采集到新的PETG瓶中，并用痕量金属级盐酸（HCl浓度为0.4%）保存。我们还采集了HDPE和PETG瓶的空白对照样本。所有HDPE瓶都在冰上运输并在-20°C下冷冻保存，直到分析为止。所有PETG瓶也在冰上运输并在4°C下保存，直到分析。

图3
图3. 采样期间的降水量记录。降水量数据来自参考文献（66）。虚线红色线条表示土壤芯和孔隙水样本的采集日期，每年有两个采样事件。阴影蓝色区域表示每次降雨后进行额外孔隙水采集的时间段。虚线蓝色线条表示额外每月孔隙水样本的采集日期。

2022年10月（干季）、2022年12月（雨季开始）、2023年3月（雨季中期）和2024年2月（雨季中期），我们从每个采样点采集了0-10厘米深的土壤/沉积物样本（图3）。在采集土壤样本之前，我们移除了地面上的活植物物质。土壤样本采用“干净手-脏手”协议（EPA方法1669）使用球形钻芯器（Berry and Bird, Inc.）收集，并分别放入三个Ziplock袋中，用于实验室培养、汞（Hg）分析和其他化学分析。用于汞分析的土壤芯样本经过了双层包装。所有样本都被放入装有氧气净化装置的聚酯薄膜袋中并密封，直到进一步处理。样本在冰块上运送至科罗拉多大学博尔德分校。实验室培养和化学分析样本在4°C下保存，直到处理完毕。汞分析样本在-20°C下冷冻保存，直到进行分析。

在雨季开始（2022年12月）和雨季中期（2023年3月、2024年2月）的48小时内，我们在科罗拉多大学博尔德分校开始了培养实验。所有样本的处理都是在用氮气净化过的聚乙烯手套袋中进行的。我们将野外湿润的土壤加入玻璃血清罐中（每罐10–20克）。每个样本被分装到三个罐中，分别进行0小时（添加刺激剂后30分钟内放入冷冻室）、24小时和48小时的培养。我们还为两个土壤样本各准备了三个时间点的重复样本。

我们根据Rodríguez Martín-Doimeadios等人（2002年）的方法，从橡树岭国家实验室获得的Hg198O和Hg199O制备了MeHg198和MeHg199。我们还从橡树岭国家实验室获得的Hg200Cl2制备了Hg(II)200。我们准备了含有无机Hg(II)200的溶液以测量潜在的甲基化速率，并准备了MeHg198以测量潜在的脱甲基化速率；我们将Hg同位素加入超纯水中（18.3 MΩ），并让它们至少平衡1小时。然后我们以2:1的土壤:刺激剂溶液比例向培养罐中添加这些同位素溶液，并拧紧罐盖。我们添加的无机Hg(II)200浓度与环境中的浓度相等，MeHg198的添加浓度为环境浓度的10%。在0小时、24小时和48小时后，我们将培养罐放入冷冻室（-20°C）以结束实验，并将其冷冻保存，直到处理。

从风干土壤样本中提取SO42–是通过使用磷酸二氢钙来实现的。在这种方法中，将10克风干土壤与100毫升0.15%的磷酸二氢钙摇匀24小时，以1900 rpm的速度离心10分钟，使用Whatman 42滤纸过滤，然后冷冻（-20°C）直到分析。此方法仅能提取无机SO42–。这些过滤后的提取物以及孔隙水和表面水样本根据EPA方法300.1使用离子色谱仪（IC；Metrohm）在科罗拉多大学博尔德分校进行了SO42–、硝酸盐和氯化物浓度的分析。所有标准物的回收率都在接受值的10%范围内，所有空白值的浓度低于检测限（BDL；0.1 mg L–1 SO42–）。

我们选取了2022年12月和2023年3月的部分孔隙水样本（所有节点的月度样本）和土壤样本进行δ34S-SO42–分析。我们按照上述协议用水（而不是磷酸二氢钙）提取野外湿润的土壤样本。然后我们使用微量金属级盐酸将水提取物和孔隙水样本的pH值降至2–4，将溶液在热板上煮沸，并加入过量的氯化钡结晶以沉淀硫酸钡（SO42–）。接下来，我们将硫酸钡沉淀物收集到预先称重过的0.45 μm Whatman硝酸纤维素滤纸上。我们用超纯水洗涤滤纸，并在60°C下过夜干燥。我们在加州大学伯克利分校使用Flash IRMS元素分析仪与Delta V Plus同位素质谱仪（Thermo Fisher Scientific EA IsoLink）一起分析了硫酸钡沉淀物中的δ34S-SO42–含量。文中报告的所有数值均使用传统的‰表示法（即每千分之一的部分）。我们还在科罗拉多大学博尔德分校使用IC（Metrohm）分析了过滤后的水提取物中的SO42–浓度。所有标准物的回收率都在接受值的10%范围内，所有空白值的浓度低于检测限。

我们通过将样本在105°C下过夜干燥来确定土壤的含水量（田间湿润状态）。我们通过在马弗炉中将其燃烧4小时在550°C下测定灼烧损失（LOI）。我们在科罗拉多大学博尔德分校使用1:4的空气干燥土壤:水浆液或1:4的空气干燥土壤:氯化钙溶液测定pH值。土壤的pH值仅在第一个采样季节进行测量。文中报告的统计分析使用了水浆液测定的pH值。我们通过将第一个采样季节的土壤样本在研磨机中粉碎48小时后，在康奈尔大学Isotope Laboratory（COIL）使用的Thermo Delta Q同位素质谱仪（IRMS）上测定了土壤中的碳（C）、氮（N）和总硫（S）含量。我们使用EPA方法1631在康奈尔大学的Tekran 2600自动总汞分析仪上通过氧化、净化和捕获以及冷蒸气原子荧光光谱法分析了孔隙水和表面水样本中的总汞含量。我们冻干了所有土壤和培养样本。随后使用球磨机对土壤样本进行筛分和均质化。我们在密歇根州立大学或康奈尔大学使用Direct Mercury Analyzer（Milestone DMA-80）分析了所有土壤样本中的总汞含量。所有土壤、水和培养样本都进行了蒸馏，然后使用MeHg199进行同位素稀释，在密歇根州立大学的Tekran 2700自动MeHg分析仪上与ThermoFisher iCAP电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）或康奈尔大学的Agilent 7800 ICP-MS（修改后的EPA方法1630）一起分析了MeHg含量。我们还在Tekran 2600上分析了每个实验日期的刺激剂溶液中的总汞浓度，以及在Tekran 2700上与ICP-MS连接的Tekran 2700上分析了MeHg198浓度。这些值用于确定培养样本的速率常数。所有土壤和培养样本的浓度均以干质量单位报告。所有汞分析的质量控制信息可以在支持信息中找到。

我们根据同一样本中MeHg200的产生和MeHg198的损失确定了这些时间段（0–24小时、0–48小时）的伪一级潜在汞甲基化（Kmeth）和脱甲基化（Kdemeth）速率常数。我们通过使用t = 0的样本控制了由于培养设置而发生的任何非生物甲基化或脱甲基化现象。为了计算k meth和k demeth，我们假设了48小时培养实验的一级动力学（根据方程1和2）。

我们使用RStudio版本2023.06.2 + 561和R版本4.2.2进行了所有统计分析。所有统计图表都使用了ggplot2和ggpubr包制作。地图图示是在ArcGIS中制作的，概念图示是在BioRender中制作的。由于数据不是正态分布的，所有组间的比较（例如，土地利用/土地覆盖类型、月份）都使用了非参数Kruskal–Wallis检验，随后使用Dunn检验进行了事后分析，并应用了Bonferroni校正。我们使用非参数Kendall’s tau方法确定了两个变量之间的相关性。我们使用vegan包进行了非度量多维缩放（NMDS）以确定样本之间的关系。我们使用了所有进行的化学分析作为输入变量进行了NMDS：氯化物、灼烧损失（LOI）、MeHg、硝酸盐、水分百分比、pH值、SO42–、总碳百分比、总氮百分比、总汞和总硫百分比。此外，我们还使用simmr包进行了三源混合模型分析。SO42–的来源被确定为葡萄园（使用本研究中的δ34S-SO42–值）、海洋（使用参考文献中的δ34S-SO42–值）和降水（使用参考文献中的δ34S-SO42–值），并且分别对孔隙水样本和土壤提取物样本进行了模型分析。使用R中的EnvStats包通过Rosner’s Test确定了异常值。所有统计分析的显著性水平为α = 0.05。文中报告的数值表示平均值±1标准差（SD）。

结果与讨论

尽管葡萄园中施用了大量的硫酸盐，但葡萄园土壤的总硫（以下简称S）和SO42–浓度较低（0.03 ± 0.02% S，0.32 ± 0.66 mg g–1 SO42–）。相比之下，湿地的土壤S和SO42–浓度较高（1.07 ± 0.68% S，16 ± 13 mg g–1 SO42–），与其他地点相比具有显著差异（p < 0.0001；图4A,B）。湿地土壤的S平均含量是排水沟、葡萄园和草地过渡区的20倍、34倍和45倍，而湿地土壤的SO42–浓度分别是其17倍、49倍和490倍。排水沟土壤的S和SO42–含量也高于草地过渡区土壤（0.057 ± 0.010% S，0.94 ± 1.8 mg g–1 SO42–；p = 0.014，p = 0.031）。同样，湿地中的孔隙水SO42–浓度（7500 ± 33,000 mg L–1）和排水沟中的孔隙水SO42–浓度（8400 ± 26,000 mg L–1）也高于葡萄园（990 ± 2800 mg L–1；p = 0.018）和草地过渡区（46 ± 47 mg L–1；p < 0.0001；图4C）。葡萄园的孔隙水SO42–浓度也高于草地过渡区的孔隙水（p < 0.0001）。总体而言，我们的研究结果与之前的研究一致，表明葡萄园土壤中的SO42–结合较为松散，在降雨事件中容易被 transport，从而导致葡萄园土壤中的SO42–减少。我们的研究还支持SO42–在葡萄园土壤中积累随后被冲刷到相邻水体中。这一结果之前已在纳帕葡萄园土壤中通过暴雨事件后的地下侧向流动（51）及其随后进入纳帕河主干道的运输过程得到证实（52）。我们的研究是首次追踪葡萄园来源的SO42–沿梯度从源头到终点的运输和累积过程。

图4显示了不同样本类型中的化学分析物浓度：（A）土壤中的硫酸盐浓度（葡萄园：n = 86，排水沟：n = 38，草地过渡区：n = 84，湿地：n = 83）；（B）土壤中的硫百分比（葡萄园：n = 30，排水沟：n = 15，草地过渡区：n = 15，湿地：n = 45）；（C）孔隙水中的硫酸盐浓度（葡萄园：n = 30，排水沟：n = 15，草地过渡区：n = 15，湿地：n = 45）；（D）土壤中的总汞浓度（葡萄园：n = 30，排水沟：n = 15，草地过渡区：n = 15，湿地：n = 45）；（E）土壤中的甲基汞浓度（葡萄园：n = 30，排水沟：n = 15，草地过渡区：n = 15，湿地：n = 45）；（F）土壤中以甲基汞（MeHg）形式存在的汞（Hg）百分比（葡萄园：n = 30，排水沟：n = 15，草地过渡区：n = 15，湿地：n = 45）。箱形图显示了中位数，箱体代表数据的第一和第三四分位数。箱形图上方的字母表示统计上的显著差异。注意图A和B中的轴线是断裂的。

进一步支持葡萄园施用的硫酸盐运输的是孔隙水中的SO42–浓度随季节变化的差异（p < 0.0001）。葡萄园（月平均范围：11–1400 mg L–1）、排水沟（月平均范围：57–17,000 mg L–1）和湿地（月平均范围：21–13,000 mg L–1）在12月至3月期间的孔隙水中SO42–浓度是4月和5月的17至240倍，而草地过渡区的孔隙水SO42–浓度在所有月份都保持较低水平（月平均范围：19–54 mg L–1）。根据设计，我们今年的初次采样是在第一次大降雨事件之后进行的（2022年为6.6厘米，2023年为9.9厘米），以确保土壤完全饱和。在这次大降雨之前还发生了几次较小的降雨事件（2022年有4次降雨，总量为7.4厘米；2023年也有4次降雨，总量为9.1厘米），这些降雨代表了上一个雨季以来的首次降水。早期的降雨事件可能为将大部分SO42–从葡萄园中输送到其他区域提供了水文条件，而更多的SO42–则在雨季后期释放，这与我们研究小组之前的研究结果一致。(51,52) 硫的同位素可以用来辨别研究区域内SO42–的来源，例如区分农业来源的硫与大气和海洋来源的硫。(52,64,67) 土壤中的δ34S-SO42–值在不同土地利用/土地覆盖类型之间没有显著差异；所有样本的δ34S-SO42–值范围都在8.8至33‰之间（p = 0.47；图5）。相比之下，湿地中的孔隙水δ34S-SO42–值（22 ± 10‰）高于排水沟（14 ± 4‰；p = 0.0098）和草地过渡区（13 ± 3‰；p < 0.0001），而葡萄园中的孔隙水δ34S-SO42–值（17 ± 2‰；p = 0.0042）也高于草地过渡区。本研究中测得的葡萄园土壤和孔隙水中的δ34S-SO42–值与文献中报道的值（3.5–17.2‰;(51,52) 以及杀菌剂中的δ34S-SO42–值（3.1 ± 1.8‰;(52) 一致。草地过渡区较低的δ34S-SO42–值可能表明大部分硫以稳定的、矿化的有机形式存在，因为有机硫矿化或地质来源的硫酸盐具有较低的δ34S-SO42–值。此外，土壤（p = 0.61）和孔隙水（p = 0.78）中的δ34S-SO42–值在不同采样日期之间没有变化，这表明SO42–的来源和转化过程在不同季节是一致的。

图5. 比较了（A）孔隙水和（B）土壤中的硫酸盐（SO42–）浓度与δ34S值。阴影区域表示海洋环境、(64,65) 本葡萄园以及降雨情况报告的δ34S-SO42–范围。(51) 高分辨率图像

我们使用δ34S-SO42–值和一个包括葡萄园、海洋和大气（即降雨）来源的三源混合模型来确定研究区域内土壤和孔隙水中SO42–的来源。草地过渡区和排水沟中的土壤和孔隙水SO42–大约 equally 来自海洋、降雨和葡萄园来源（SI 图1和SI 表2），而湿地中的SO42–主要来自海洋（土壤中51 ± 23%，孔隙水中57 ± 20%）和葡萄园（土壤中36 ± 24%，孔隙水中33 ± 23%），降雨的贡献很小（土壤中13 ± 8%，孔隙水中10 ± 5%）。然而，如果将异常样本纳入孔隙水混合模型，湿地中超过75%的SO42–来源于海洋，这表明这些少数样本地区主要受海洋影响。

**总汞和甲基汞浓度的空间变化**
土壤中的总汞浓度在湿地中最高（84 ± 13 ng g–1；p < 0.03），其次是草地过渡区（68 ± 30 ng g–1；p < 0.02），最低的是葡萄园（29 ± 10 ng g–1）和排水沟（38 ± 13 ng g–1；p > 0.05；图4D）。即使考虑到土地利用/土地覆盖类型的差异，并将土壤总汞浓度标准化为LOI（有机物含量的代理指标），这些模式仍然一致，唯一的例外是湿地土壤的总汞:LOI比葡萄园土壤（p = 0.019）和草地过渡区土壤（p < 0.0001）更低。然而，当土壤总汞浓度标准化为总碳含量百分比时，葡萄园和草地过渡区土壤的总汞:总碳含量百分比最高，而排水沟和湿地土壤最低（p < 0.0001）。与土壤总汞浓度类似，孔隙水中的总汞浓度在湿地和草地过渡区也最高，相比之下葡萄园和排水沟更低（p < 0.0001）。正如预期的那样，土壤总汞浓度在不同采样日期之间没有变化（p = 0.25）。

土壤中的甲基汞（MeHg）浓度在湿地（0.60 ± 0.70 ng g–1）和排水沟（0.48 ± 0.37 ng g–1）中高于葡萄园（0.074 ± 0.036 ng g–1；p < 0.0001）和草地过渡区（0.14 ± 0.11 ng g–1；p < 0.008；图4E）。土壤中以甲基汞形式存在的汞百分比在湿地（0.70 ± 0.76%）和排水沟（1.4 ± 1.1%）中高于草地过渡区（0.24 ± 0.21%；p < 0.002），并且排水沟中的甲基汞百分比也高于葡萄园（0.27 ± 0.13%；p = 0.0011；图4F）。同样，孔隙水中的甲基汞浓度在湿地和排水沟中最高，在草地过渡区和葡萄园中最低（接近检测限：1.25 pg；p < 0.02）。以甲基汞形式存在的汞百分比代表了甲基汞的长期生成。(62,68?70) 我们还发现，在雨季中期，土壤中以甲基汞形式存在的汞百分比是雨季开始时的1.4至2.5倍（p = 0.019）。这些结果表明，在雨季期间，净土壤汞甲基化作用增强，可能是由于土壤条件变得更不利于厌氧细菌的活动。(23,24) 需要注意的是，这些土壤中以甲基汞形式存在的汞百分比都很低（范围：0.03–3.8%），这与之前报道的山区土壤的值一致(71,72)，也处于湿地研究报告中较低的范围内。(60,68,73)

**甲基汞变化的环境因素**
排水沟和湿地土壤中较高的甲基汞积累可能是由多种因素共同作用的结果。排水沟和湿地的土壤含水量变化频繁（排水沟为28 ± 10%，湿地为54 ± 10%，而草地过渡区为20 ± 6%，葡萄园为17 ± 3%），这会导致更不利于甲基化的土壤条件，从而增加汞的甲基化。(27,41,68,74) 在氧化干燥过程中，如SO42–等末端电子受体和溶解的有机物质变得可利用，随后在缺氧湿润条件下微生物可以产生甲基汞。(37,75) 我们研究地点土壤中汞甲基化的驱动因素包括含水量和还原条件，这一点通过土壤含水量与土壤甲基汞浓度（p < 0.0001，τ = 0.37）和以甲基汞形式存在的汞百分比（p = 0.0007，τ = 0.21）之间的相关性得到了支持。我们的NMDS结果显示，一些湿地和排水沟样本在有序空间中有重叠，进一步证实了水分是土壤汞甲基化模式的主要驱动因素。相比之下，葡萄园和草地过渡区的土壤主要是氧化环境的（即未饱和状态），因此促进了好氧微生物的脱甲基化途径而非厌氧微生物的甲基化途径。(37)

**其他驱动因素**
除了水分外，土壤中较高的SO42–浓度——尤其是在湿地中——也很可能是导致土壤甲基汞浓度观察到的模式的原因。我们发现土壤中的硫（S）和SO42–浓度与甲基汞浓度之间存在相关性（p < 0.0001，S为p < 0.0001，SO42–为p < 0.0001）。同样，我们也发现土壤中的硫和SO42–浓度与以甲基汞形式存在的汞百分比之间存在相关性（尽管较弱）（p = 0.0049，S为p = 0.0049，SO42–为p = 0.0084，τ = 0.18）。多项先前的研究已经报告了SO42–浓度增加与甲基汞生成之间的关联（Gilmour等人1992年，Harmon等人2004年，Mitchell等人2008b年），包括在Everglades农业区进行的研究，该地区农业用地下游也有湿地。(28) 之前的研究还指出，当S2–(31?34)或溶解的有机物质(35?38)含量高时，会抑制甲基汞的形成，形成所谓的“适居曲线”。我们的结果表明，所有地点的SO42–浓度都会导致土壤和孔隙水中甲基汞浓度的增加，尽管存在“适居曲线”，但高浓度的SO42–（即范围：0.92–64.1 mg L–1），包括海洋来源的SO42–以及可能的高S2–浓度，并不会抑制我们地点的甲基汞生成。然而，单凭SO42–浓度不足以解释观察到的甲基汞浓度和以甲基汞形式存在的汞百分比的变化。

**潜在净甲基化速率的空间模式**
虽然土壤中甲基汞的测量提供了采样时净甲基汞积累的见解，但实验室实验是必要的，以通过确定潜在的净甲基化速率（kmeth）和潜在的净脱甲基化速率（kdemeth）（例如，参考文献(56,60, 和68)）来研究土壤甲基汞生产和损失的差异。因此，我们对土壤浆液样本进行了实验室培养，增加了所有样本的含水量（溶液与土壤的比例为2:1）。培养48小时后，我们发现湿地中的潜在汞甲基化速率高于葡萄园（p = 0.019），并且不同土地利用/土地覆盖类型之间的脱甲基化速率没有差异（所有成对比较中p > 0.05；图7）。这些结果表明，湿地土壤中的潜在汞甲基化速率较高，这与我们发现的湿地土壤中甲基汞浓度和以甲基汞形式存在的汞百分比升高相一致。总体而言，它们表明湿地土壤比葡萄园土壤能更有效地转化汞。即使在实验室培养条件下为葡萄园土壤提供缺氧条件（即饱和状态），这些条件也不足以解释与湿地土壤之间的差异。我们的结果支持了Huang和Mitchell（2023年）的研究发现，即加拿大北方森林的土壤中潜在的汞甲基化速率低于湿地土壤。(60) 我们计算的地上土壤和湿地中的甲基化潜力虽然较低，但仍与先前文献中报道的类似环境中的值相当。(60,76) 此外，由于以甲基汞形式存在的汞百分比同时反映了净潜在甲基化和脱甲基化，因此可以将土壤中的kmeth/kdemeth比值进行比较。我们发现土壤中的kmeth/kdemeth与以甲基汞形式存在的汞百分比之间存在相关性（p = 0.031，τ = 0.16），这表明长期的土壤中净甲基汞积累（即以甲基汞形式存在的汞百分比）与实验室培养实验中计算的短期甲基汞生产和损失（kmeth/kdemeth）相对应。这一结果已在先前的森林和湿地生态系统土壤研究中得到证实。(60,68)

**图7.** 实验室培养48小时后的结果（葡萄园：n = 24，排水沟：n = 12，草地过渡区：n = 24，湿地：n = 36）。(A) 潜在的汞甲基化速率（kmeth）。(B) 潜在的汞脱甲基化速率（kdemeth）。注意y轴刻度的差异。箱形图上方的字母表示统计上的显著差异。高分辨率图像

此外，特别是在湿地中，较高的土壤SO42–浓度也可能驱动土壤中甲基汞浓度的变化。我们发现土壤中的硫（S）和SO42–浓度与甲基汞浓度之间存在相关性（p < 0.0001，S为p < 0.0001，SO42–为p < 0.0001）。同样，我们也发现土壤中的硫和SO42–浓度与以甲基汞形式存在的汞百分比之间存在相关性（尽管较弱）（p = 0.0049，S为p = 0.0049，SO42–为p = 0.0084，τ = 0.16）。多项先前的研究已经报道了SO42–浓度增加与实验室（Gilmour等人1992年，Harmon等人2004年，Mitchell等人2008b年）和现场研究（28?30）中甲基汞生成之间的关联，包括在Everglades农业区进行的研究，该地区农业用地下游也有湿地。(28) 之前的研究还指出，当S2–(31?34)或溶解的有机物质(35?38)含量高时，会抑制甲基汞的形成，从而形成所谓的“适居曲线”。我们的结果表明，所有地点的SO42–浓度都会导致土壤和孔隙水中甲基汞浓度的增加，但高浓度的SO42–（即范围：0.92–64.1 mg L–1）——包括海洋来源的SO42–以及可能的高S2–浓度——并未抑制我们地点的甲基汞生成。然而，单凭SO42–浓度不足以解释观察到的甲基汞浓度和以甲基汞形式存在的汞百分比的变化。这些结果表明，土壤中汞的甲基化和脱甲基化速率常数取决于实验持续时间，这表明在比较潜在反应时统一实验室培养时间的重要性。特别是，不同土地覆盖/土地利用类型区在最初的24小时内甲基化速率常数存在差异，而在接下来的24小时内则没有差异，这表明微生物活动受到了刺激。湿地和排水沟中的土壤在野外表现出更高的汞甲基化速率（即MeHg浓度和以MeHg形式存在的汞的比例较高）；因此，在实验室条件下，这些地点很可能具备甲基化汞所需的生物和底物。有趣的是，我们观察到这种土地利用/土地覆盖类型的差异仅在最初的24小时内出现。同样，在一项关于亚高山森林土壤的研究中，Miller等人（2025年）发现，在添加硫元素的实验室培养过程中，不同地点的汞甲基化速率常数差异仅在最初的24小时内存在。

这些结果表明，土壤中汞的甲基化和脱甲基化速率常数受实验持续时间的影响，这表明在比较不同条件下的潜在反应时，统一实验室培养时间的重要性。特别是在最初的24小时内，不同土地覆盖/土地利用类型区之间的甲基化速率常数存在差异，而在随后的24小时内则没有差异，这可能表明微生物活动受到了刺激。湿地和排水沟中的土壤在野外表现出更高的汞甲基化速率（即MeHg浓度和以MeHg形式存在的汞的比例较高），因此这些地点在实验室条件下很可能具备甲基化汞所需的生物和底物。有趣的是，这种土地利用/土地覆盖类型的差异仅在最初的24小时内出现。

土壤中汞的甲基化和脱甲基化速率也随着采样时间的不同而变化（甲基化速率在0–48小时内的差异为p = 0.0085；0–24小时内的差异为p = 0.033；所有时间区间内的脱甲基化速率差异为p < 0.0001；见补充信息图3）。在整个48小时的培养过程中，第二年野外季节（2024年2月）的土壤甲基化速率高于第一年野外季节（2023年2月）；而在培养开始的24小时内，第一年野外季节（2022年12月）的甲基化速率也高于第二年野外季节。这种模式可能是由采样时的环境空气温度所驱动的。由于较高的温度会促进汞的甲基化，2023–2024年的平均气温比2022–2023年高约5°C（见补充信息表3），这可能导致野外微生物群落的活跃度增加，从而提高了实验室培养物中的甲基化速率。脱甲基化速率的变化模式则有所不同，在整个培养期间，雨季中期（2023年和2024年2月）的脱甲基化速率高于雨季开始时（2022年和2023年12月）（所有成对比较的p值均小于0.0002）。土壤中汞甲基化和脱甲基化速率的季节性变化可能是由负责甲基化和脱甲基化的微生物群落差异所导致的。土壤中脱甲基化速率的变化模式可能是由于雨季期间温度较高和湿度较大的条件促进了微生物活动。

我们发现证据表明，在纳帕河流域末端的一个葡萄园中施加的硫元素通过排水沟和草地过渡区被输送到附近的湿地，并与海洋来源的硫酸根离子（SO42–）混合。葡萄园中施加的硫酸根离子似乎与土壤结合较为松散，因此在降雨事件中可以被输送。虽然硫酸根离子在整个景观中传输，但我们认识到它只是影响汞甲基化的众多因素之一。在我们的研究梯度中，那些经历土壤湿度变化和土壤条件恶化的地点（尤其是湿地和排水沟）的空气中甲基化汞（MeHg）浓度和潜在甲基化汞含量较高，这表明水分诱导的氧化还原循环对环境中甲基化汞的形成具有重要影响。不同土地覆盖/土地利用类型区中的碳源、植被组成和养分状况的变化也可能影响观察到的模式。我们的结果表明，下游湿地和周期性饱和的排水沟是加州葡萄园及其他类似高地农业区下游汞产生的主要场所。