机械应力诱导的瓶盖微塑料释放：材料特性的研究及其对细胞毒性的影响

《Journal of Hazardous Materials》：Mechanical Stress-Induced Microplastic Release from Bottle Caps: Insights on Material Properties and their impact on Cellular toxicity

微塑料释放及毒性机制研究：对比分析AB与BB品牌瓶盖开合100次后释放的微塑料（<1000μm），发现AB-MPs细胞毒性更强（IC50=6.24mg/mL），诱导ROS、炎症基因（NF-κB、TNF-α）及抗氧化酶（SOD2、CAT）表达变化，伴随线粒体肿胀和核仁区变化。揭示瓶盖材料（HDPE/PP）与机械应力导致的微塑料释放特性及毒性差异。

　　

乌德什娜·昌迈（Udeshna Changmai）| SK 萨哈娜（SK Sahana）| 乌纳亚纳·戈戈伊（Unnayana Gogoi）| 埃尚·阿巴斯（Eshan Abbas）| 普兰甘·杜阿拉（Prangan Duarah）| 库恩达利卡·戈斯瓦米（Kundalika Goswami）| 库希克·杜塔（Koushik Dutta）| 马纳什·兰詹·达斯（Manash Ranjan Das）| 里图帕尔纳·杜阿拉（Rituparna Duarah）| 曼图·布扬（Mantu Bhuyan）| 特里迪普·普坎（Tridip Phukan）

印度阿萨姆邦乔尔哈特（Jorhat）CSIR-东北科学与技术研究所（CSIR-North East Institute of Science and Technology）农业技术与农村发展部门，邮编785006

摘要

塑料饮用水瓶中微塑料（MPs）的释放引起了全球关注；然而，材料质量对微塑料释放及其在细胞系统中的毒性的影响尚未得到充分研究。观察到了厚度高达1000微米的微塑料碎片；扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）和机械性能分析显示，不同品牌塑料在微塑料行为上存在差异。这些微塑料在HEK293细胞中表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性，其中AB品牌微塑料的毒性更强（IC50 = 6.24 mg/mL）。48小时后，细胞内观察到线粒体肿胀、内质网核周聚集和微核形成。24小时时ROS含量增加，但在48小时后恢复到生理水平。qRT-PCR分析显示，AB品牌和BB品牌的微塑料在24小时暴露后均显著上调了炎症基因NF-κB（9.34倍）、TNF-α（2.58倍）和氧化应激响应基因SOD2（3.56倍）及CAT（5.7倍），其中AB品牌微塑料的诱导作用更明显。然而，凋亡基因表达显示，Bcl-2水平在24小时时升高（4.68倍），但在48小时时下降，同时Bax水平上升（0.44倍）。因此，来自塑料瓶的微塑料通过诱导活性氧、引发炎症和细胞凋亡以及改变细胞器动态来影响细胞系统。这些发现强调了瓶盖和瓶颈释放的微塑料在饮用过程中通过口腔进入人体的风险。

引言

微塑料是合成的高分子量聚合物，它们要么是直接合成的，要么是从塑料材料分解而来的，尺寸小于5微米。由于其低生物降解率，这些物质会在环境中长期存在，并对包括人类在内的所有生物造成负面影响[1]。近年来，在饮用水和食品中检测到微塑料已成为一个关键问题，因为它们对人类健康有害。多项研究表明，塑料食品包装（如茶包、塑料水壶和婴儿奶瓶）在受到不同环境因素影响时会导致微塑料渗出[2]。研究指出，人类通过多种途径摄入微塑料，包括受污染的食物和水，其中包装瓶装饮用水是微塑料暴露的一个重要来源[3],[4],[5]。塑料水瓶中的微塑料引发了严重担忧，因为研究表明这些颗粒可能来源于瓶子的制造材料；特别是瓶身的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、瓶盖的聚乙烯（高密度和低密度形式，即HDPE和LDPE）或聚丙烯（PP）[6]。聚合物组成主要由这些常见包装材料构成，但也有研究报道存在少量聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和其他聚合物[7]。可重复使用瓶装水中的微塑料含量约为20至200个微塑料/升[8],[9]。在矿泉水样本中观察到的微塑料碎片分为小尺寸（50至500微米）和非常小尺寸的颗粒（1–50微米）[10]。最近的全球调查显示，微塑料的平均浓度约为37个微塑料/升，主要颗粒尺寸在20至30微米之间，但其他研究根据包装类型和分析方法的不同，浓度范围可能在7-364个微塑料/升之间。从形态上看，微塑料主要以碎片和纤维形式存在，碎片通常占检测到的颗粒的70%以上[7]。大量研究强调了包装材料与微塑料类型之间的显著关联，表明瓶子成分、制造工艺和机械应力条件是微塑料污染的关键因素。据估计，全球人类每周平均摄入0.1至5克的微塑料，相当于一张信用卡的重量[11],[12]。 较小尺寸的微塑料已被记录在多种物种中，包括鱼类和海洋哺乳动物体内，这引发了人们对微塑料进入食物链并通过消化道在生物体内传播的担忧。小于20微米的微塑料颗粒可以穿透生物屏障，可能导致系统性暴露和不良健康影响，包括对免疫系统和生殖系统的影响[13]。此外，微塑料可通过多种机制引发氧化应激，导致蛋白质表达异常，从而影响细胞和分子功能[14]。研究表明，微塑料可以通过产生活性氧（ROS）来破坏细胞的氧化平衡[15]。然而，生物体会通过激活抗氧化防御机制来减轻暴露于微塑料时的氧化损伤。 通常，饮用水瓶中的微塑料是由于各种物理（如热指数、光氧化）和化学（如pH值变化、增塑剂和添加剂的渗出）因素而产生的；然而，机械应力是导致瓶装水中微塑料产生的主要原因之一。反复打开和关闭塑料瓶会产生压力，导致微塑料颗粒从瓶口颈部区域释放[16],[17],[18]。这种降解过程会将微塑料释放到水中，因此饮用受污染的水会增加人体摄入微塑料的风险[19]。Mason等人的全面研究[20]进一步证明了不同品牌甚至同一品牌瓶装水中微塑料浓度的显著差异，表明制造工艺和所用材料会显著影响污染程度。此外，反复打开和关闭瓶盖会导致微塑料在瓶口区域积聚。当瓶口直接接触口腔时，这些微塑料可能会随水一起被摄入，从而成为人类摄入微塑料的主要且未被充分认识的风险来源。尽管有这些证据，但系统性地探讨聚合物类型、包装成分与瓶装水中微塑料释放之间关系的研究仍然有限。因此，了解基于聚合物特性的微塑料释放机制对于优化产品设计并提高使用此类塑料包装材料的安全性至关重要。鉴于越来越多的证据表明微塑料从包装材料中渗出，特别是从HDPE瓶盖中渗出，迫切需要评估这些颗粒在细胞层面的生物学后果。尽管已有许多研究报道了瓶装水中微塑料的存在和浓度，但它们对人类健康的直接细胞毒性和分子效应仍有限。大多数用于毒性研究的微塑料和纳米塑料（MNPs）是商业上可获得的、球形、对称且尺寸均匀的聚合物，称为初级MNPs。然而，次级MNPs是通过降解和破碎产生的，它们构成了污染食物、水和空气的主要微塑料。这些次级MNPs通常具有混合的成分、不规则的形状和不同的尺寸[21],[22]。此外，这些次级MNPs在风化过程中会改变其物理化学性质，据报道其毒性比原始或初级MNPs更强。然而，这些来自塑料水瓶的次级MNPs对人体的毒性影响尚未得到充分研究。特别是消费者常见的单次使用塑料水瓶的反复使用和机械应力会加速这些有害次级MNPs的释放，从而在长期暴露下带来潜在的细胞毒性风险。 本研究旨在系统地探讨单次使用水瓶的反复使用对两种不同商业来源（一个全国性销售品牌和一个本地销售品牌）产生的微塑料的数量和释放的影响，并在受控的体外条件下进一步评估这些释放颗粒对人类细胞系的细胞毒性和分子效应。通过荧光显微镜（FM）和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）研究了在模拟实际开合循环（100次）后的颗粒。此外，还使用机械性能分析、X射线光电子能谱（XPS）、拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了塑料瓶盖的物理和化学性质，以及这些品牌微塑料的释放情况。该研究还考察了不同尺寸的微塑料对细胞毒性、细胞内ROS生成、线粒体和内质网（ER）完整性以及炎症标志物和抗氧化酶基因表达的影响。尽管已有许多关于商业上可获得原始微塑料的毒理学效应的研究，但关于来自食品包装塑料的微塑料的研究仍然有限。本研究为理解材料组成和实际使用对微塑料毒性的影响提供了新的视角。总体而言，这项工作加深了我们对异质性微塑料与环境相关生物系统之间复杂相互作用的理解，并为未来旨在减轻长期微塑料暴露潜在健康风险的研究和监管措施提供了基础。

塑料瓶的使用和实验设计

为了进行这项研究，选择了两种商业上可获得的塑料水瓶（每种500毫升），一种为本地销售品牌（AB），另一种为全国性销售品牌（BB）进行比较分析。选择AB品牌是因为在六个地区销售的塑料瓶装水品牌中，它的微塑料释放量最高；而选择BB品牌是因为在四个全国性销售的瓶装水品牌中，它的微塑料释放量最低。每个瓶子由PET瓶身和HDPE瓶盖组成。

瓶盖开合过程中微塑料的释放检测

反复开合塑料瓶盖约100次后，对两种品牌的瓶盖和瓶颈区域产生了机械应力，并释放了不同大小和数量的微塑料（图1）。用尼罗红（Nile Red）染色后，在100次开合后观察到强烈的、广泛的微塑料荧光，表明在机械应力作用下产生了微塑料。然而，对空白样本的荧光显微镜分析未发现微塑料。

结论

总之，反复开合塑料饮用水瓶会产生机械应力，导致不同大小的微塑料释放，这表明饮用水中可能存在微塑料污染。来自塑料瓶的微塑料在HEK293细胞系中表现出时间和剂量依赖性的效应，表明长时间暴露会加剧细胞毒性。塑料成分的变化导致了微塑料的不同毒理学效应。

环境影响

本研究的结果表明，反复开合塑料饮用水瓶产生的机械应力会产生大量微塑料（MPs），这些微塑料会在瓶盖-瓶颈接口处积累。这些从瓶盖直接释放的微塑料代表了一种未被充分认识的摄入途径，尤其是在通过塑料瓶饮水时。研究表明，导致细胞毒性的微塑料释放量受到显著影响。

未引用的参考文献

[70]

CRediT作者贡献声明

马纳什·兰詹·达斯（Manash Ranjan Das）：撰写、审稿与编辑、监督。 库希克·杜塔（Koushik Dutta）：方法学、调查。 库恩达利卡·戈斯瓦米（Kundalika Goswami）：方法学。 普兰甘·杜阿拉（Prangan Duarah）：方法学、数据管理。 里图帕尔纳·杜阿拉（Rituparna Duarah）：撰写、审稿与编辑、监督、方法学。 特里迪普·普坎（Tridip Phukan）：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资金获取、正式分析、概念构思。 曼图·布扬（Mantu Bhuyan）：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取。 埃尚·阿巴斯（Eshan Abbas）：方法学、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢CSIR-NEIST（位于阿萨姆邦乔尔哈特）主任的许可，允许他们开展这项研究（机构手稿编号：CSIR-NEIST/PUB/2025/156）。所有作者感谢Shreeram Pandit先生的技术支持。这项工作得到了CSIR-NEIST OLP项目（OLP-2402和OLP-2502）的支持。