四环素降解细菌在四环素-铜共污染环境下对污染物解毒及耐药基因组重塑的双重作用

《Journal of Hazardous Materials》：Dual roles of tetracycline-degrading bacteria in pollutant detoxification and resistome reshaping under tetracycline-copper co-contamination

本研究评估了四环素降解菌共生体对铜-四环素共污染土壤的生物修复潜力，通过化学、生物及生态学方法发现，该共生体显著提高四环素降解率（48.57%-53.71%），降低铜生物有效性，缓解土壤酶抑制，重塑微生物群落及抗性基因网络，为复杂污染治理提供新策略。

　　

肖珊珊|韩卓|唐云辉|吴雪玲|黄瑾|曾伟民

中南大学矿物加工与生物工程学院，中国长沙410083

摘要

土壤中抗生素和重金属的复合污染日益成为环境挑战，但针对其协同毒性的修复策略仍然有限。本研究通过结合化学、生物和生态评估方法，评估了一种能够降解四环素的细菌联合体（Raoultella sp. XY-1 和 Pandoraea sp. XY-2）在四环素-铜（TC-Cu）复合污染土壤中的生物修复潜力。土壤柱实验表明，与未接种的对照组相比，生物强化显著增强了四环素的降解效率（90天后降解率为48.57–53.71%），同时通过将可酸提取和可还原的铜组分转化为更稳定的氧化形式，降低了铜的生物可利用性。接种后，土壤酶活性（蔗糖酶、尿素酶、磷酸酶）的抑制作用也得到了缓解，反映了土壤功能的恢复。宏基因组测序结果显示，TC-Cu复合污染改变了微生物群落组成，尤其是增加了放线菌门（Actinomycetota）和弯曲菌门（Campylobacterota）的相对丰度。生物强化还促进了Raoultella的定植，并通过群落相互作用间接刺激了本地耐受性菌株的发育。相关性网络分析进一步表明，Raoultella在携带抗生素抗性基因（ARG）和金属抗性基因（MRG）的菌属共现网络中具有较高的连接性。LC-MS检测四环素微生物降解过程中的中间产物，提出了三种微生物降解途径，并推测了TC-Cu共存条件下的微生物抗性机制。总体而言，这些发现表明，降解四环素的细菌不仅降低了污染物的毒性，还重塑了复合污染土壤中的微生物和遗传景观，可能在低TC-Cu水平下抑制抗性基因的扩散风险。这项工作为生物修复的生态权衡提供了新的见解，并为复杂抗生素-金属污染场景下的针对性、可持续策略的发展提供了支持。

引言

抗生素和重金属在畜牧业中的广泛和同时使用导致了自然环境中的频繁复合污染[3]、[65]、[94]。由于这些污染物的持久性、生物累积性和毒性[50]、[64]、[7]，它们引发了日益严重的环境和健康问题。在各种污染物中，四环素（TCs）和铜（Cu）是畜牧业相关环境和农业生态系统中常见的共污染物质[89]。自20世纪40年代以来，四环素被广泛用于人类医学和动物饲养，是动物使用的最大类别的抗菌药物（超过30%）[17]、[80]。由于其代谢能力较差，高达80%的摄入四环素以未代谢的形式通过动物粪便排入环境[12]、[44]、[54]。农业土壤中的抗生素主要来源于废水灌溉和动物粪便施用。先前的调查显示，中国农业土壤和灌溉水中的四环素污染浓度范围分别为0至200毫克/千克和0至660纳克/升，而动物粪便中的浓度则高达3至950毫克/千克[54]、[59]、[71]。在长江三角洲，农业土壤中的平均四环素浓度约为34.9毫克/千克[71]。同样，铜也被广泛添加到动物饲料中以促进生长和增强疾病抵抗力，导致其在土壤生态系统中的持续积累[29]、[77]。先前的研究显示，农田土壤中的铜浓度范围为10至739毫克/千克，而动物粪便中的铜浓度中值可达100–1000毫克/千克[13]、[76]。这些污染物的泄漏引发了人们对TC-Cu复合污染相关生态风险的担忧。

四环素和铜污染之间的相互作用非常复杂。例如，四环素的电子供体基团可以与铜离子形成复合物，改变这两种化合物的环境行为和持久性[14]。这种复合作用可能会产生不同于单一污染物的选择压力，从而影响抗性基因（ARG）的分布。因此，TC-Cu复合污染比单一污染物具有更大的生态风险，因为它会破坏微生物群落并加速抗性基因和金属抗性基因（MRG）的传播[33]、[40]。Liu等人[46]发现，抗性基因的丰度与抗生素和重金属的生物可利用性部分之间存在强相关性，这突显了理解它们耦合环境行为的重要性。因此，为了减轻复合污染的风险，提出了抗生素降解和重金属固定等策略。无机添加剂（如零价铁、石灰和沸石）可以有效固定重金属并减少抗生素的含量。然而，这些方法成本较高且容易引起二次污染[38]、[39]。相比之下，微生物修复因能够有效降解抗生素并通过微生物代谢过程降低重金属的生物可利用性而受到广泛关注，同时具有低成本和生态友好性。例如，某些细菌菌株在实验室条件下可在几天内降解10–100%的四环素，并将铜的生物可利用性降低3–5%[11]、[16]、[36]。然而，大多数先前的研究集中在相对较低的污染浓度或简化的实验系统上，可能无法完全反映受动物粪便或废水灌溉严重影响的土壤条件。此外，高浓度的铜可能会抑制微生物代谢活性并降低抗生素的降解效率[43]，使得高度复合污染土壤的修复尤为困难。

在我们之前的研究中，分离出了两种高效的四环素降解菌株Raoultella sp. XY-1和Pandoraea sp. XY-2，并证明它们在四环素污染土壤中具有高降解效率[83]。本研究探讨了它们在四环素-铜复合污染土壤中的表现。具体而言，我们评估了（i）四环素的降解效率和铜组分的转化情况，（ii）对关键土壤酶活性的影响，以及（iii）通过宏基因组测序分析微生物群落和抗性组的动态。这项工作为四环素降解细菌在污染物解毒和抗性组重塑中的双重作用提供了新的见解，为制定更现实和可持续的生物修复策略奠定了基础。

化学物质、土壤和四环素降解细菌

所有化学物质（包括CuSO₄?5?H₂O）均购自中国上海的中药化学试剂有限公司，而盐酸四环素（50?mg/mL）则由上海桑工生物技术有限公司提供。

土壤样本（深度0–20?cm）采集自中国湖南省长沙市的月卢山（坐标28.18°11′1.17′′N, 112.94°56′7.61′′E），该地区附近没有潜在的污染源。采集后，土壤首先用2毫米筛网过滤，随后储存在4°C下

土壤中四环素残留物浓度及铜不同形态的变化

本研究评估了四环素降解细菌联合体在不同TC-Cu复合污染情景下的修复效果，包括四环素的降解、铜的含量及其生物可利用性。细菌联合体的存在显著增强了受污染土壤中四环素的消散（图1A）。未接种的受污染土壤中可检测到的四环素降解水平表明存在本地的四环素降解微生物。90天后，降解率...

结论与展望

本研究提供了充分证据，证明使用四环素降解细菌联合体进行生物强化可以同时减轻抗生素-金属复合污染，并改变土壤微生物组的多种生态功能。引入的联合体加速了四环素的降解，通过降低铜的生物可利用性稳定了铜的含量，减轻了协同毒性，并部分恢复了关键土壤酶活性。宏基因组分析显示，TC-Cu复合污染对微生物组产生了显著影响...

环境意义

四环素和铜在畜牧业中的广泛使用导致它们在周围土壤中的累积，引发了人们对生态风险和抗性基因传播的担忧。本研究证明，使用四环素降解联合体进行生物强化可以提高四环素的去除效率，并促进铜的稳定，同时不会增加抗性基因的丰度，同时减轻复合污染对土壤酶活性的抑制作用。进一步的宏基因组分析...

作者贡献声明

肖珊珊：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析、概念构建。韩卓：方法学、实验设计、概念构建。唐云辉：方法学、实验设计。吴雪玲：撰写——审稿与编辑、方法学。黄瑾：方法学、撰写——审稿与编辑。曾伟民：撰写——审稿与编辑、监督、资金筹集、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（编号2019YFC1803604）、国家自然科学基金（编号51934009、52274289、52074353）、中央政府引导地方科技发展基金（2022ZYC122）、湖南省科技计划（2021NK1040）、湖南省自然科学基金（2021JJ30855、2021JJ30836）以及国家重点实验室综合开发利用开放基金的支持。