《Journal of Hazardous Materials》：Developmental exposure to environmental levels of sulfamethoxazole (SMX) leads to hyperactivity in zebrafish larvae by inducing oxidative stress and calcium dyshomeostasis
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磺胺甲噁唑（SMX）作为环境常见污染物，其神经发育毒性机制在斑马鱼模型中研究发现：SMX暴露导致幼虫自发运动异常和心率改变，高 throughput行为学显示过度活跃、社交回避及暗适应能力下降，活体双光子成像证实小胶质细胞数量和形态改变，转录组学揭示氧化应激相关通路激活及钙信号通路紊乱，生化检测显示乙酰胆碱和第二信使水平升高，联合使用钙调蛋白抑制剂和抗氧化剂有效缓解毒性，表明氧化应激与钙失衡是SMX神经毒性的核心机制。
邹民健|王双|朱志瑞|鲍慧明|兰先勇|张胜祥|丹妮拉·瓦洛内|尼古拉斯·S·福尔克斯|王克|赵海宇
中国甘肃省兰州市天水南路222号兰州大学生命科学学院，甘肃省环境污染生物监测与生物修复重点实验室
摘要
抗生素污染已成为一个重大的环境问题，其中磺胺甲噁唑（SMX）作为一种广泛使用的磺胺类抗生素，是水生生态系统中最持久和最具生物活性的污染物之一。越来越多的证据表明，SMX在实验和临床环境中均具有神经毒性作用，但其发育过程中的神经毒性及其潜在机制仍不甚明了。在本研究中，我们利用斑马鱼作为脊椎动物模型，探讨了环境相关浓度下SMX暴露对神经发育的影响。发育评估结果显示，SMX改变了早期幼体的自发运动行为和心率。高通量行为分析显示出现明显的过度活跃、社交回避行为以及趋暗性降低，这些现象表明神经行为受到了早期干扰。体内双光子成像技术显示，SMX暴露后小胶质细胞的数量和形态发生了显著变化。转录组分析揭示了氧化应激相关过程的激活以及钙信号通路的失调。生化检测结果显示乙酰胆碱水平升高，细胞内第二信使（环腺苷单磷酸和环ADP-核糖）增加，与兴奋-收缩耦合和肌纤维组织相关的基因表达上调。重要的是，使用Ryanodine受体抑制剂丹曲林钠或抗氧化剂乙酰-L-肉碱和N-乙酰-L-半胱氨酸进行联合治疗可以有效缓解SMX引起的神经行为异常，这表明钙稳态失衡和氧化应激是SMX神经毒性的核心驱动因素。总体而言，这些发现揭示了SMX在神经发育过程中干扰神经信号传导和钙稳态，并将氧化应激与行为障碍联系起来。本研究为SMX的发育神经毒性提供了机制上的见解，强调了慢性低水平抗生素污染的生态和潜在健康风险。
引言
抗生素被归类为药品和个人护理产品（PPCPs），在水产养殖、兽医医学和人类临床治疗中得到广泛应用。然而，由于它们的广泛使用、代谢不完全以及环境中的持久性，抗生素逐渐被认为是水生生态系统中的新兴污染物[1]。2000年至2010年间，全球抗生素消耗量增加了约35%，这反映了环境负担的显著增加[2][3]。淡水污染的主要来源包括畜牧业、水产养殖设施、医院和化工厂[4]。由于抗生素及其代谢物的化学稳定性以及废水处理系统中的去除效率有限，它们经常进入地表水，积累在其中，污染食物网，促进耐抗生素细菌（ARB）和抗生素抗性基因（ARGs）的传播，对生态和人类健康构成威胁[5][6]。
磺胺甲噁唑（SMX）是一种广谱磺胺类抗生素，在人类和兽医医学中已使用了五十多年[7]。由于使用广泛且降解不完全，SMX是水生环境中检测频率最高的磺胺类药物之一，有92%的环境样本中检测到了它的存在[8]。虽然地表水中的典型浓度范围在ng/L到低μg/L之间，但在畜牧场、水产养殖设施、医院和制药厂的排放水中曾报告超过10mg/L的浓度[2]。这些“点源”或热点浓度可能远超环境背景水平，代表了局部生态风险。
环境相关浓度的SMX已被证明会损害初级生产者（如绿藻、蓝藻和硅藻）以及水生植物（如Lemna minor、Lemna gibba和Myriophyllum sibiricum），从而威胁食物网的稳定性[9][10][11][12]。在水生动物中，SMX暴露会导致甲壳类动物和鱼类的氧化应激、肝毒性和肠道微生物群失调[2][13]。此外，SMX经常与其他污染物（如微塑料和重金属）共存，引发了对混合毒性的担忧[14][15][16]。除了生态影响外，SMX还促进了抗生素抗性基因的传播，并可能促进跨物种的抗性传递[17]。尽管世界卫生组织（WHO）将SMX归为第3类物质，但人们对长期暴露和潜在的生物累积风险仍存在担忧[18][19]。临床研究表明，长期接触磺胺类药物与造血和泌尿系统功能障碍有关，在某些情况下还与神经精神障碍相关[20][21]。这些发现强调了需要进行超越抗菌抗性的SMX毒性机制研究。
斑马鱼（Danio rerio）是发育生物学、神经生物学和毒理学研究的成熟脊椎动物模型[22]。其快速的胚胎发育、光学透明性、遗传易操作性以及与人类关键信号通路的高度保守性使其特别适合用于研究神经发育毒性[23]。先前的斑马鱼研究表明，SMX暴露会改变免疫相关转录本和凋亡途径，扰乱肠道生理，激活氧化应激信号通路，并通过影响叶酸代谢、碳酸酐酶活性和神经递质系统来损害发育和行为[24][25][26][27]。然而，尽管有这些观察结果，SMX如何干扰早期神经发育的具体机制以及分子变化如何转化为神经行为结果仍不够明确。重要的是，先前被认为与SMX毒性相关的通路——包括叶酸代谢、氧化还原稳态和神经递质信号传导——是早期发育过程中神经元分化、突触形成和神经回路成熟的基本调节因素[28][29][30]。氧化应激和钙稳态失衡是密切相关的过程，它们可以破坏神经兴奋性、线粒体功能和突触传递。这表明，在早期发育过程中暴露于SMX可能通过氧化还原平衡和细胞内钙信号传导的协调紊乱来干扰神经行为。
在本研究中，斑马鱼胚胎暴露于从环境相关浓度（μg/L）到点源浓度（mg/L）范围内的SMX。我们通过表型评估、高通量行为分析、体内双光子成像、转录组测序、基因表达分析和生化检测，系统地评估了发育和神经行为终点。通过整合分子、细胞和行为数据，我们旨在阐明氧化应激、钙失衡与SMX暴露引起的神经行为改变之间的机制联系。这项工作加深了我们对磺胺类抗生素生态和健康风险的理解，并可能为SMX的临床和监管使用提供更合理的指导。实验部分
中国斑马鱼资源中心（CZRC）提供了野生型AB、Tg (HuC: EGFP)、Tg (Mpeg1: EGFP) 和 Tg (Flk: mCherry) 班次的斑马鱼。所有饲养和实验程序均获得了兰州大学动物护理和伦理委员会的批准（伦理批准编号EAF2020006），并遵循《实验室动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院）进行。
斑马鱼幼体暴露于SMX的发育毒性
斑马鱼与哺乳动物具有保守的发育、代谢和生理过程，使其成为评估发育毒性的理想脊椎动物模型[55]。为了评估磺胺甲噁唑（SMX）的潜在发育毒性，胚胎从受精后1天（dpf）开始连续暴露（图1A）。为了验证处理的有效性，我们选择了100μg/L和2mg/L作为代表性浓度，并测量了实际暴露水平。讨论
磺胺甲噁唑（SMX）是一种常用的磺胺类抗生素，通常与三甲氧苄氨嘧啶（TMP-SMX，复方磺胺甲噁唑）联合使用，通过抑制微生物叶酸合成来发挥作用[65]。尽管在治疗剂量下通常被认为是安全的，但高剂量的SMX治疗方案与患者的神经毒性和自发性肌阵挛有关[66]。除了临床应用外，SMX还是一种持久的环境污染物。结论
本研究证明，环境相关浓度的磺胺甲噁唑（SMX）会在斑马鱼幼体中引起明显的神经行为异常，表现为过度活跃、刺激反应减弱和类似焦虑的行为。从机制上看，SMX破坏了神经肌肉接头和神经元突触处的氧化稳态和钙信号传导，将氧化还原失衡与钙稳态失衡联系起来。使用丹曲林钠进行药理干预可以缓解这些症状。环境影响声明
磺胺甲噁唑（SMX）是一种常用的磺胺类抗生素，在人类医学、畜牧业和水产养殖中广泛应用，广泛分布于全球地表水中。SMX对水生生物具有多器官毒性，对水生生态系统构成重大污染风险，引起了全球范围内的关注。然而，关于SMX如何影响早期神经发育和行为的认识仍然有限。我们的发现突显了SMX在环境相关浓度下的神经发育毒性。作者贡献声明
邹民健：撰写——初稿、验证、方法学、研究、数据分析。丹妮拉·瓦洛内：监督、资源提供。尼古拉斯·S·福尔克斯：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供。王克：资源提供、研究、资金获取。赵海宇：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源提供、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。朱志瑞：研究。鲍慧明：方法学、研究。兰先勇：利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号32570555、32100376）、中国国家重点研发计划（编号2022YFF1001200）、甘肃省青年人才项目（团队）（编号2026QNTD004）、中央高校基本科研业务费（编号lzujbky-2024-ey09，针对HZ）、甘肃省自然科学基金（编号23JRRA1040）以及赫尔姆霍兹协会自然、人工与认知资助计划的支持。
