在原因不明的反复着床失败的女性中，自然杀伤细胞上ILT2、NKG2D和NKp46受体的表达异常

《Journal of Reproductive Immunology》：Abnormal expression of ILT2, NKG2D and NKp46 receptors on natural killer cells in women with unexplained recurrent implantation failure

本研究探讨了反复植入失败（uRIF）和活产（LB）患者外周血及子宫内自然杀伤（NK）细胞亚群中活化与抑制受体表达差异，发现uRIF患者CD56dimCD16bright uNK的ILT2受体表达降低，NKG2D受体表达降低，NKp46受体表达升高，但细胞毒性颗粒无显著差异，提示NK细胞功能失衡与胚胎植入失败相关。

　　

张颖颖|严曦|吴静雅|陈万乐|罗璐|严妮薇|张丽梅|欧阳娟|周灿权|王琼

中国广州中山大学第一附属医院妇产科生殖医学中心

摘要

复发性植入失败（RIF）是指在辅助生殖技术过程中胚胎反复植入失败的情况，其中一半的原因仍然无法解释（uRIF）。有证据表明，uRIF与自然杀伤（NK）细胞的免疫失调有关。本研究的目的是探讨患有uRIF和成功妊娠（LB）的女性在月经周期的胚胎植入阶段，外周血（pbNK）和子宫内（uNK）样本中NK细胞亚群中的细胞毒性颗粒、活化受体和抑制受体的表达情况。研究招募了25名成功妊娠的孕妇（LB组）和13名uRIF患者（uRIF组）。通过流式细胞术评估了pbNK和uNK亚群中ILT2、NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D、KIR2DL2/S2/L3受体以及细胞内细胞毒性颗粒（穿孔素和颗粒酶B）的表达情况。与LB组相比，uRIF患者中CD56^dimCD16^bright uNK上的ILT2受体、CD56^dimCD16^dim和CD56^dimCD16^bright uNK上的NKG2D受体表达显著降低，而CD56^dimCD16⁺ pbNK和CD56^dimCD16^bright uNK亚群中的NKp46受体表达显著升高。然而，pbNK或uNK细胞及其亚群中的穿孔素和颗粒酶B表达在uRIF组和LB组之间没有显著差异。pbNK和uNK细胞亚群中ILT2、NKG2D和NKp46受体的表达改变可能暗示了NK细胞亚群中异常表达的活化受体和抑制受体与胚胎植入失败之间的关联。

引言

复发性植入失败（RIF）是一个定义不明确的临床概念（Failure等人，2023年）。最常用的定义是至少三次胚胎移植失败或至少三个刺激周期失败（Lu等人，2025年）。大约10-15%的女性在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）后可能会经历RIF（Busnelli等人，2020年）。已知有多种因素可能导致RIF，但超过一半的RIF病例无法解释，被归类为不明原因的RIF（uRIF）（Genest等人，2025年）。胚胎植入是母胎界面的一种免疫炎症反应（Mor等人，2011年；Griffith等人，2017年）。在植入窗口期间，大约30%的子宫细胞是免疫细胞，这些细胞在妊娠时构成母胎界面。这些免疫细胞包括自然杀伤（NK）细胞、T细胞和单核细胞（Bulmer等人，2010年）。在母胎界面中，NK细胞在正常妊娠中的胚胎植入、滋养层侵袭、螺旋动脉重塑和胎儿发育中起关键作用（Kanter等人，2021年；Rao等人，2023年）。在人类中，约90%的外周血NK（pbNK）细胞是CD56^dimCD16⁺细胞，80%的子宫NK（uNK）细胞是CD56^brightCD16^-细胞（King等人，1998年）。

仅凭pbNK细胞计数升高并不能可靠预测接受IVF患者的RIF（Thum等人，2005年；Zhang等人，2020年）。据报道，pbNK亚群（CD56^dimCD16⁺CD69⁺）细胞的增加与uRIF相关（Thum等人，2004年）。然而，也有研究建议应检测uNK细胞而非pbNK细胞（Santillán等人，2015年）。通过流式细胞术（Tersoglio等人，2021年）或免疫组化（Babayeva等人，2020年）在黄体期检测uNK细胞计数可以预测uRIF患者的妊娠结局。但也有研究报道uNK细胞计数与RIF之间没有显著关联（Donoghue等人，2019年）。因此，有必要进行专注于uNK细胞亚群功能的研究，特别是它们的活化受体和抑制受体，而不仅仅是检测总uNK细胞计数。

NK细胞的主要活化受体是自然杀伤组2成员D（NKG2D）和自然细胞毒性受体（NCRs），包括NKp46、NKp44和NKp30（Moretta等人，2001年）。NKG2D可触发细胞因子的释放和细胞毒性介质的产生，并对NK细胞受体的表达及对外部信号的响应产生长期影响，在NK细胞功能调节中起重要作用（Wensveen等人，2018年）。NCRs的激活对于诱导NK细胞对各种肿瘤细胞和感染细胞的细胞毒性功能至关重要（Sivori等人，2019年）。胚胎可以通过ILT2和KIR2DL受体与胚胎上的HLA-G和HLA-C结合来避免母体NK细胞的攻击（Nilsson和Hviid，2022年）。此外，NK细胞的细胞毒性还通过释放穿孔素和颗粒酶B等细胞毒性颗粒来实现（Prager等人，2019年）。然而，目前尚无关于患有uRIF的女性中外周血和子宫样本中NK细胞亚群中活化受体和抑制受体的研究。

基于以往的研究结果，我们假设与植入失败密切相关的可能是NK细胞功能的受损，而不仅仅是总NK细胞计数。因此，本研究的目的是探讨患有uRIF和成功妊娠的女性在月经周期的胚胎植入阶段，外周血和子宫样本中NK细胞亚群中的细胞毒性颗粒、活化受体和抑制受体的表达情况。

研究对象和伦理批准

本研究于2016年8月至2019年3月在中山大学第一附属医院的生殖中心招募了患者。随访截至2021年3月。在参与者入组前获得了知情同意，该研究得到了中山大学第一附属医院伦理委员会的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》和《良好临床实践》的原则进行。

符合以下条件的

参与者特征

表1显示了LB组和uRIF组患者的人口统计学特征和IVF周期特征，包括年龄、BMI、基础生殖激素（FSH、LH、E2和PRL）水平、甲状腺相关激素（TSH、FT3、FT4、TT3和TT4）水平、活检日（LH+7天）的E2浓度、取出的卵子总数、受精率、移植的胚胎总数以及高质量胚胎的比例。这些变量在LB组和uRIF组之间没有显著差异。

uRIF组和LB组中CD16⁺ NK亚群的比例相似

讨论

本研究同时检测了LB组和uRIF组中pbNK和uNK亚群中ILT2、NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D、KIR2DL2/S2/L3受体以及细胞内细胞毒性颗粒（穿孔素和颗粒酶B）的表达情况。与LB组相比，uRIF患者中CD56^dimCD16^bright uNK上的ILT2受体、CD56^dimCD16^dim和CD56^dimCD16^bright uNK上的NKG2D受体表达较低，而CD56^dimCD16⁺ pbNK和CD56^dimCD16^bright uNK亚群中的NKp46受体表达较高。

结论

本研究提供了新的证据，表明与LB组相比，uRIF患者的NK细胞亚群中ILT2、NKp46和NKG2D受体的表达发生了改变。具体来说，抑制性受体ILT2和活化受体NKG2D在uRIF患者中显著降低，而活化受体NKp46在CD56^dimCD16^bright uNK细胞中显著升高。这种受体表达的失调表明NK细胞功能的平衡调节受到了破坏。

作者贡献

张颖颖负责数据分析和手稿起草。严曦负责患者信息收集和随访、数据分析及手稿起草。吴静雅负责样本收集、样本检测、数据获取、数据分析和数据解释；陈万乐、罗璐、严妮薇、张丽梅负责患者招募和样本收集。欧阳娟负责流式细胞术的指导。周灿权参与了研究工作。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号81871159和81170568）对QW的支持，以及广东省自然科学基金（项目编号2015A030313192）对QW的支持。

作者贡献声明

严妮薇： 数据整理。罗璐： 数据整理。欧阳娟： 方法学研究。张丽梅： 数据整理。陈万乐： 数据整理。吴静雅： 研究调查、数据整理。严曦： 文章撰写-初稿、研究调查、正式分析、数据整理。王琼： 文章撰写-审稿与编辑、项目管理、资金获取、数据整理。周灿权： 文章撰写-审稿与编辑。张颖颖： 文章撰写-审稿与编辑、初稿撰写、研究调查、数据整理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢中山大学第一附属医院妇产科生殖医学中心的所有合作者在患者招募和样本收集方面的帮助。没有他们的参与，本研究无法完成。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。