《Environmental Microbiology》：Hi-C Links Reveal Viral Activity and Infection Within the Free-Living Microbial Community of a Secondary Chlorophyll Maximum in the Eastern Tropical North Pacific
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本研究聚焦于海洋缺氧区（ODZ）中未培养微生物与病毒的互作难题，利用Hi-C邻近连接技术结合长短读长宏基因组测序，首次在东热带北太平洋ODZ的次生叶绿素最大值中系统刻画了原核群落内的活跃病毒互作。研究成功鉴定了861个组装病毒重叠群，其中75个与微生物基因组存在显著连接，揭示了19对可能具有感染性的新型病毒?微生物配对，涉及9个不同的微生物门类，并发现大多数宿主携带反硝化基因潜力。该工作凸显了在未培养微生物群落病毒生态学研究中纳入邻近连接方法的重要性，为理解ODZ生态系统中的病毒?宿主互作提供了新视角。
在广阔的海洋中，存在着一些特殊的“缺氧区”（Oxygen?deficient zones, ODZs）。这些区域的水体长期处于缺氧甚至无氧状态，虽然其体积仅占全球海洋的约1%，但却是生物可利用氮被反硝化和厌氧氨氧化过程移除的关键场所，可能贡献了全球海洋生物可利用氮总损失量的约三分之一。随着海洋温度上升，这些区域正在垂直和水平方向上扩张，使其成为理解气候变化影响的关键地点。然而，ODZs中的绝大多数微生物和病毒尚未被培养，极大地限制了我们对其生态功能的理解。病毒作为微生物群落中的关键成员，能够影响营养流动、促进基因交换，并通过裂解释放有机物，可能深刻影响ODZs中以异养反硝化为主的氮循环过程。因此，揭示ODZs中病毒与宿主的真实互作关系，对于理解该生态系统的生物地球化学循环至关重要。
传统上，通过计算预测（in silico）方法在宏基因组数据中推断病毒宿主存在很大局限，尤其是在ODZ这类以未培养微生物为主的生态系统中。为了直接捕捉环境样本中病毒与宿主细胞内的物理邻近关系，本研究创新性地采用了Hi-C（High?throughput chromosome conformation capture）邻近连接技术，并结合PacBio HiFi长读长和Illumina短读长测序，对东热带北太平洋（Eastern Tropical North Pacific, ETNP）ODZ中一个次生叶绿素最大值水层的自由生活微生物群落（0.2–3.0 μm粒径）进行了综合分析。该研究旨在回答：在此未培养微生物群落中，哪些病毒是活跃的？它们感染哪些宿主？这些互作具有怎样的生态学意义？
本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1. 样本采集与处理：于2019年10月在ETNP海域（16.58° N, 107.05° W）130米深度的次生叶绿素最大值层采集海水样品，通过序贯过滤获得0.2–3.0 μm粒径的自由生活微生物样品，并分为两份，一份用于标准宏基因组测序，另一份用甲醛固定后用于Hi?C文库构建。2. 测序与组装：对两份样品分别进行PacBio HiFi长读长和Illumina NovaSeq短读长测序，并将数据用于混合组装，获得高质量的重叠群。3. 病毒与微生物基因组鉴定：使用VirSorter2、VIBRANT和geNomad多种软件联合鉴定病毒重叠群；通过MetaBat2、MaxBin2和基于Hi?C连接的ProxiMeta三种方法进行分箱，再经DAS?Tool整合获得高质量的宏基因组组装基因组（Metagenome?Assembled Genomes, MAGs）。4. 病毒?宿主连接分析：将Hi?C读段比对到混合组装结果，统计病毒重叠群与MAGs重叠群之间的连接数，并通过计算病毒每宿主细胞值（Viruses Per Host cell, VPH）来评估互作的显著性，将VPH ≥ 1作为活跃感染的保守阈值。5. 基因组注释与系统发育分析：使用DRAM、DRAM?v、CheckV、GTDB?Tk等工具对病毒和MAGs进行基因注释、质量评估和分类学鉴定；对病毒的大末端酶（terL）基因进行系统发育分析。
研究结果
病毒群落特征与辅助代谢基因
研究从混合组装中鉴定出861个长度≥10 kb的病毒重叠群，其中大多数被归类为未分类的有尾病毒目（Caudoviricetes）。在这些病毒序列中发现了87个独特的辅助代谢基因（Auxiliary Metabolic Genes, AMGs），涉及辅因子与维生素代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢等通路，也包括与硫代谢（cysH）、甲烷代谢（cofF）以及趋化性（motA）相关的基因，但未发现与反硝化或厌氧氨氧化通路直接相关的AMGs。
Hi?C连接揭示病毒?宿主互作
通过Hi?C连接分析，在75个病毒重叠群与微生物MAGs之间发现了显著的连接。其中，有19对互作的VPH值大于1，被推断为活跃的病毒感染。这些活跃感染涉及9个不同的微生物门类，包括浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexota）、α?变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ?变形菌纲（Gammaproteobacteria）、粘球菌门（Myxococcota）和疣微菌门（Verrucomicrobia）等，其中许多病毒的宿主是尚未被培养的类群。
计算预测与Hi?C连接的比较
使用iPHoP软件进行的计算宿主预测仅能为208个病毒重叠群提供预测，且与Hi?C连接结果吻合度有限。在25个同时具有计算预测和Hi?C连接的病毒中，仅有4对的预测与连接结果在分类学上直接匹配。大多数具有高VPH值的Hi?C连接病毒（50个）根本没有计算宿主预测，且Hi?C连接的病毒在群落中的平均丰度显著高于未连接的病毒。
活跃感染病毒的基因组特征
19个具有高VPH值的病毒重叠群大小在12?60 kb之间，含有病毒复制、结构蛋白、裂解和成熟相关的典型病毒基因。其中6个病毒含有大末端酶（terL）基因。
terL系统发育暗示溶原性生活史
对11个连接病毒（包括6个VPH ≥ 1的病毒）的terL基因进行系统发育分析，发现其中9个与已知的温和噬菌体（如大肠杆菌噬菌体P1、Clostridium噬菌体C?st、D3112噬菌体、T1样噬菌体）聚在一起，而未见与典型的烈性噬菌体如T4或T7样噬菌体密切相关的序列。此外，在航次中进行的丝裂霉素C诱导实验间接支持了缺氧水体中可能存在溶原性病毒。
被感染宿主的代谢潜力
在17个被活跃病毒感染的中等质量或更高质量的MAGs中，有10个含有至少一个反硝化基因（如napA/narG、nir、nor），表明它们具有将硝酸盐还原为亚硝酸盐、一氧化氮或一氧化二氮的基因组潜力。特别是一个被两种病毒高丰度感染（VPH 2.1 和 9.4）的浮霉菌门MAG含有三个反硝化基因，暗示其可能贡献于一氧化二氮的产生。
研究结论与意义
本研究通过整合Hi?C邻近连接技术与混合宏基因组测序，首次在东热带北太平洋ODZ的次生叶绿素最大值中，直接在未培养的自由生活微生物群落内鉴定了活跃的病毒?宿主互作。研究成功揭示了19对可能具有感染性的新型病毒?微生物配对，涉及包括浮霉菌门、绿弯菌门在内的9个微生物门类，极大地扩展了我们对海洋缺氧区病毒宿主范围的认识。
研究表明，传统的计算宿主预测方法在鉴定此类环境中的病毒宿主时存在显著局限，许多活跃且高丰度的病毒互作被其遗漏。这凸显了像Hi?C这样能够在原位捕捉物理邻近关系的实验方法，对于研究未培养生态系统中病毒生态学的重要性。
对病毒terL基因的系统发育分析以及初步的诱导实验暗示，在ODZ的缺氧水体中，溶原性（lysogeny）可能是一种普遍的病毒生活史策略。这与“在宿主生产力或丰度较低的环境中，溶原性更占优势”的假说相一致。溶原性病毒的诱导裂解可能向水体中释放溶解性和颗粒性有机质，从而为依赖有机物的异养反硝化过程提供燃料，并可能影响反硝化与厌氧氨氧化过程的平衡，最终调节氧化亚氮（N2O）等温室气体的产生。
此外，研究发现许多被病毒感染的宿主微生物携带反硝化基因，表明病毒活动有可能通过调控这些关键微生物的功能，间接影响ODZ的核心氮循环过程。这项工作不仅为理解ODZ生态系统中病毒活动的真实范围和性质提供了新的视角，也强调了在未来的病毒生态学研究中，应采用多种方法相结合的策略，以更全面地揭示病毒在自然环境中的活动及其生态效应。
该论文已发表在《Environmental Microbiology》期刊上。
