《Applied Surface Science》：Multiscale analysis of plasma-modified silk fibroin and chitosan films
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多尺度表面分析揭示等离子体改性丝心蛋白和壳聚糖对细菌及巨噬细胞响应的差异化影响，结合XPS和AFM量化多尺度形貌特征，发现细观结构主导细菌粘附，而宏观形貌调控巨噬细胞形态，表面化学对生物膜形成作用有限。
Jordan Nashed|Tomasz Bartkowiak|Alexandru Horia Marin|Tine Curk|Viviana Marcela Posada-Perez
Ken和Mary Alice Lindquist，宾夕法尼亚州立大学核工程系，美国宾夕法尼亚州
摘要
本研究建立了一个多尺度表面表征框架，用于识别等离子体改性聚合物表面上具有生物学意义的地形长度尺度。生物与材料表面的相互作用涉及广泛的长度尺度，然而大多数表面表征方法依赖于单一尺度指标，这限制了它们解释尺度依赖性生物反应的能力。将等离子体改性的丝素纤维蛋白和壳聚糖表面的多尺度描述符与细菌和免疫细胞反应进行了关联分析。利用X射线光电子能谱（XPS）和原子力显微镜（AFM）对表面化学和地形进行了表征，随后通过滑动带通滤波和基于曲率张量的分析来量化尺度依赖性的地形特征。通过荧光显微镜评估了巨噬细胞的反应和生物膜的生长。相关性分析显示了明显的尺度依赖性：单个细菌和小型菌落主要与细小尺度的地形特征相关，而巨噬细胞的形态则与较大尺度的表面特征更为相关。相比之下，尽管壳聚糖和丝素纤维蛋白在细菌支持方面存在明显差异，但表面化学描述符与生物膜形成的相关性较弱，这表明标准化学指标并不能完全捕捉材料的特性。这些结果共同表明，多尺度地形分析能够识别出与特定生物相互作用最相关的表面特征大小，从而支持将其作为功能性生物材料的表面工程工具。
引言
控制材料表面的生物膜形成和炎症反应对于维持生物材料和生物医学设备的功能性能至关重要，这促使人们开发出既能抑制细菌粘附又能与宿主细胞保持兼容性的表面设计策略[1]、[2]。丝素纤维蛋白（SF）[3]、[4]、[5]、[6]、[7]和壳聚糖（Ch）[9]、[10]、[11]是广泛研究的聚合物基底，其界面特性可以通过表面改性来调节生物相互作用[7]、[12]、[13]。特别是，从天然杀菌表面衍生出的物理启发式表面图案化策略作为无化学方法来控制细菌引起了人们的兴趣[14]、[15]、[16]。尽管其杀菌机制仍有争议[17]，但高长宽比的纳米结构被广泛报道可以在不引起哺乳动物细胞细胞毒性反应的情况下机械性地破坏细菌膜[18]、[19]。
我们的团队探索了一种称为“定向等离子体纳米合成”（DPNS）的表面改性技术，作为在生物材料表面上创建高长宽比纳米结构的方法[7]、[13]、[20]、[21]、[22]。该技术从等离子体源中提取离子，并以低能量（约100–500电子伏特）和用户选定的入射角将它们加速到目标材料上，从而在材料表面上创建定向的纳米结构[7]、[20]。重要的是，DPNS创建的结构比通常用于研究杀菌地形的高度控制图案更为复杂[7]、[13]，这给它们的定量分析带来了计量学挑战。
生物与材料表面的相互作用发生在多个长度尺度上，从纳米级的蛋白质吸附（影响后续的细胞粘附）到微米级的细菌附着和细胞组织[27]、[28]。蛋白质通常处于纳米尺度，主要受纳米级地形的影响[29]，而细菌（约1微米）和单个真核细胞（约10微米）对纳米级和微米级的表面特征都有反应[13]、[24]、[26]。相比之下，集体细胞组织和菌落级行为则受更大尺度表面结构（>100微米）的影响[28]。这种表面特征与生物反应之间的固有多尺度耦合促使人们使用区分尺度的（多尺度）表面分析方法。
表面计量学中的多尺度分析可以定义为“在多个观察尺度上研究地形，并比较、合并或关联来自不同尺度观察或计算的结果”的过程[30]。这可以通过多种方式实现，例如空间滤波或在不同长度尺度或空间分辨率下拍摄图像[30]。它还可能涉及找到在特定观察尺度上几何特性最明显的表面表征参数，或者确定形成过程与最终表面地形之间、表面地形与功能反应之间发生相互作用的尺度[31]。尽管多尺度技术具有相关性，但在生物材料表面研究中仍被低估且标准化程度不足；该领域大多仍在争论是纳米尺度还是微米尺度的地形主导生物反应[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。此外，虽然表面地形的定性描述符很有用，但更系统化的定量方法将有助于对任意复杂度的表面进行更一致的比较[29]、[30]。
丝素纤维蛋白（SF）和壳聚糖（Ch）的临床相关性，以及它们固有的局限性，加上定向等离子体纳米合成（DPNS）作为一种物理表面改性策略的出现，激发了我们之前对DPNS处理过的SF[7]和Ch[13]的研究。在此基础上，本研究通过将表面描述符与细菌和巨噬细胞的反应相关联，来探讨等离子体诱导的表面改性如何影响生物相互作用。两种互补的多尺度方法被应用于原子力显微镜（AFM）地形数据，以解析尺度依赖性的表面特征。第一种方法由Bartkowiak等人开发，使用多尺度曲率张量来估计多个观察尺度上的局部表面几何形状[38]。第二种方法是带通滤波方法，它在规定的长度尺度窗口内隔离地形特征，最初由Berglund和Brown引入用于多尺度表面分析[39]、[40]。传统的单一尺度（实测）地形描述符也被包括在内，以评估在未明确考虑尺度时是否忽略了具有生物学意义的表面特征。表面化学特性通过X射线光电子能谱（XPS）进行表征，地形参数作为解释变量，而细菌粘附指标、生物膜大小分布和巨噬细胞形态描述符作为生物反应变量。这一框架能够识别与特定生物反应最相关的表面特征大小，并允许直接比较等离子体改性的SF和Ch表面的多尺度与传统表面描述符。
部分摘录
薄膜合成
按照标准的LiBr基提取流程[7]、[41]获得了SF薄膜。简要来说，Bombyx mori蚕茧在0.02 M碳酸钠中脱胶以去除丝胶，彻底冲洗后干燥。所得到的丝素纤维蛋白溶解在60°C下的9.3 M溴化锂中，随后通过超纯水进行48小时的透析（3.5 kDa分子量截留），并多次更换水。澄清后的SF溶液（约7.8 wt/vol%）通过渗透透析浓缩至10%
地形变化
大多数纳米尺度研究，特别是那些将生物变量与表面特征相关联的研究，依赖于单一尺度的地形描述符[49]、[50]。鉴于生物相互作用发生在多个长度尺度上，因此需要能够生成不同尺度特征的表面改性策略来探究尺度依赖性效应。在本研究中，使用Ar+辐照来诱导地形变化，同时仅对表面化学产生轻微改变。结论与展望
多尺度分析用于研究DPNS处理的SF和Ch薄膜的表面特性及其与巨噬细胞和细菌行为的关系。DPNS在Ch和SF上产生了多尺度地形改变，以及表面碳化、脱氧和氮化学的变化，其中Ch上的地形变化比SF更为明显。与SF相比，处理过的Ch上的生物膜形成显著减少，表明材料之间存在差异
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了包括ChatGPT、Perplexity和Gemini在内的人工智能辅助工具，以帮助编写代码进行数据解析、分析和绘图。使用这些工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对本文的内容承担全部责任。
CRediT作者贡献声明
Jordan Nashed：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、项目管理、方法论、研究、数据管理、概念化。Tomasz Bartkowiak：写作 – 审稿与编辑、可视化、监督、软件、资源管理、方法论、研究、概念化。Alexandru Horia Marin：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、研究、数据管理。Tine Curk：写作 – 审稿与编辑、监督。Viviana利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢宾夕法尼亚州立大学的材料研究所提供的共享仪器，以及技术培训和专家支持，包括使用Thermo Scientific Verios G4扫描电子显微镜（SEM）、Thermo Scientific Scios FIB-SEM、Physical Electronics VersaProbe III X射线光电子能谱仪（XPS）和Bruker Icon Dimension II原子力显微镜（AFM）。
