浸泡时间、暴露面积与溶液体积对牙釉质和牙本质矿质损失的影响研究

《Crystals》：Exploring the Interplay Between Soaked Time, Exposed Area, and Solution Volume on Mineral Loss in Enamel and Dentin Boyu Ning, Xuefei Chen, Go Inoue, Ling Yu, Heba Elsubeihi, Morihiro Takamatsu, Lin Fan and Yasushi Shimada

　　

将牛牙牙块浸泡于脱矿溶液中是一种广泛使用的模拟龋齿样脱矿以进行后续实验研究的方法。本研究旨在评估不同控制条件下牛牙釉质和牙本质块的矿质损失程度及深度，并探究这些因素与矿质损失之间的关系，为研究者实现目标化的脱矿结果提供指导。共计54个釉质块和54个牙本质块根据暴露面积和溶液体积分为18组，并浸泡于脱矿溶液中。研究人员在浸泡前以及浸泡1、2、3、7和10天后对样本进行了微计算机断层扫描（micro-CT）。研究结果使用数据分析软件进行分析，并汇总为图形化表示。分析表明，浸泡时间和溶液体积与矿质损失呈正相关，而暴露面积与矿质损失呈负相关。所有组的平均矿质损失均随浸泡时间显著增加（例如，在牙本质3 × 3 mm²、50 mL组中，从6314增至25,670 vol%·μm，p < 0.05）。7天后，浸泡在较大溶液体积中的样本矿质损失显著大于浸泡在较小体积中的样本（p < 0.05）。此外，浸泡3天后，较大的暴露面积导致了更大的矿质损失。当溶液体积相对于暴露表面积足够大时，平均矿质损失与时间遵循幂函数关系。相反，当溶液体积有限时，则观察到时间与矿质损失之间存在对数关系。鉴于其优越的稳定性，平均矿质损失似乎是评估牙齿脱矿更可靠的指标。基于研究结果，可以实现更受控和可重复的脱矿条件，这可能有助于提高体外龋病模型的可靠性，并促进对预防和治疗策略的评估。

口腔健康是身心健康的关键方面，对患者的生活质量有深远影响[1,2]。龋病是人类最普遍的感染性疾病，是一个重大的全球公共卫生问题[3,4]。与传统治疗完全去除龋坏病损组织不同，一种称为微创牙科（Minimal Intervention Dentistry）的理念正日益获得接受[5,6,7,8]。该方法的核心要素是再生牙科（Regenerative Dentistry），这是一个鼓励牙科研究进步并将科学发现整合到未来治疗策略中的革命性概念[9]。研究人员开发了多种牙科材料来预防龋病，包括漱口水、涂漆和牙膏。尽管龋病的过程在概念上简单，但其潜在机制却非常复杂[10]。为了研究牙科材料的抑龋特性，已经开发出模拟龋病过程的模型，例如使用细菌产生的酸进行体外脱矿，以及使用pH循环系统进行体外脱矿/再矿化[11]。在这些人工龋模型中，最简单的方法是使用酸性缓冲液进行体外脱矿，如酸化明胶凝胶或含有乳酸或乙酸的缓冲液[12]。一些研究人员使用快速酸攻击，例如将高浓度磷酸或乙二胺四乙酸（EDTA）溶液短暂作用于矿物表面[13,14,15]。然而，这些溶液诱导的脱矿速度远快于自然龋病，导致脱矿层更简单且更表浅。例如，37%磷酸作用90秒诱导的牙釉质脱矿在扫描电子显微镜（SEM）下呈现典型的“鱼鳞状”外观，而EDTA对牙本质的脱矿则显示出粗糙表面、塌陷的胶原和暴露的牙本质小管[15]。有趣的是，在体外研究中观察到，由快速酸攻击形成的层通常由小晶体间隙组成，大分子难以进入，含有空气或蒸汽，折射率低，该层在快速酸攻击后缺失，但在酸攻击较慢和较轻时变得明显[16]。这表明，通过快速酸攻击形成的人工龋可能缺乏自然龋或使用较温和酸攻击模型中发现的多孔层。这可能是由于快速和剧烈的酸攻击过程中缺乏再矿化。相反，逐渐的酸渗透导致多孔结构的形成和部分溶解矿物的持续离子释放，由于残留晶体和病变内有限的离子扩散，这可能会影响随后的再矿化[17]。因此，使用快速酸攻击处理的样本的结果可能无法完全反映自然龋的行为。因此，应考虑一种不仅易于执行，而且能更准确模拟自然龋结构的脱矿方法。1979年，Van Dijk首次提出了一种相对温和的脱矿溶液，含有Ca、P和酸，为羟基磷灰石（HAp）提供欠饱和环境[18]。J.M. ten Cate等人优化了浓度，使其含有1.5 mM CaCl₂、0.9 mM KH₂PO₄和50 mM乙酸[19]。这种更接近自然龋的溶液现在广泛用于浸泡牛牙甚至拔除的人牙，以在龋病学实验中模拟龋诱导的脱矿[20,21,22,23,24]。然而，在设计脱矿方案时，浸泡时间、暴露牙齿面积和溶液体积等因素会显著影响脱矿结果，使得难以获得所需的脱矿程度和深度。研究人员通常根据具体需求选择条件，但缺乏既定指南的情况下，预实验可能既耗时又昂贵。此外，过去的研究通常涉及每日更换溶液，这不仅消耗更多时间，而且导致不必要的浪费。而且，很少有研究调查这些条件与矿质损失之间的关系。因此，本研究的目标是在特定条件下（浸泡时间为1、2、3、7和10天，暴露面积为5 mm × 5 mm、3 mm × 3 mm和2 mm × 2 mm，溶液体积为5 mL、15 mL和50 mL）评估牙釉质和牙本质的矿质损失程度和深度[25,26,27]。研究旨在建立浸泡时间、暴露面积和溶液体积与矿质损失之间的关系，并为研究者实现所需的脱矿结果提供指导。零假设是浸泡时间、面积和溶液体积对脱矿无显著影响。实验对象准备流程图见图1。使用G*Power（版本3.1，德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学）进行先验样本量计算。基于ANOVA设计的效应量0.6、显著性水平0.05和统计功效0.80，估计每组至少需要6个样本。使用了45颗无损伤、新鲜拔除、年龄在30个月以下的牛切牙，冷冻储存直至实验。在流动水下彻底去除软组织。使用低速金刚石锯（Isomet；美国伊利诺伊州Lake Bluff Buehler公司）将牙冠切割成6 mm × 6 mm × 2 mm、4 mm × 4 mm × 2 mm和3 mm × 3 mm × 2 mm的牙块，制备牙釉质样本（每组n = 18）。一个牙冠可产出一个6 mm × 6 mm × 2 mm、一个4 mm × 4 mm × 2 mm的牙釉质块，或两个3 mm × 3 mm × 2 mm的牙釉质块。为便于精确对齐系列图像，在每个样本侧面使用金刚砂车针（440SS ISO #010；日本京都Shofu公司）制作了直径约1.0 mm的参考标记。然后将牙块包埋在环氧树脂（EpoxiCure 2；美国伊利诺伊州Lake Bluff Buehler公司）中，仅暴露平坦的牙釉质面。在持续水冷却下，使用粒度从600到2000的碳化硅砂纸（Fuji Star；日本埼玉Sankyo Rikagaku公司）对这些表面进行抛光。在暴露表面涂上防酸指甲油（RAVEN RED 721；美国纽约州纽约市Revlon公司），制备5 mm × 5 mm、3 mm × 3 mm和2 mm × 2 mm的窗口供进一步操作。所有样本在去离子水（Milli-Q水；美国马萨诸塞州Billerica Millipore公司）中超声清洗3分钟，以去除切割和抛光产生的玷污层。使用27颗牛切牙牙根制备牙本质样本。仔细处理牙根以去除所有软组织，同时保留牙本质表面。每颗牙根劈成两半，并使用低速金刚石锯进一步切割成具有平坦表面的6 mm × 6 mm、4 mm × 4 mm和3 mm × 3 mm牙块（每组n = 18）。这些牙本质样本经历了与牙釉质样本相同的处理程序。根据表1所示的暴露表面积，将样本随机分配到18组（每组n = 6）。每个样本浸泡在相应体积的脱矿溶液中。本实验中，脱矿溶液由1.5 mM CaCl₂、0.9 mM KH₂PO₄和50 mM乙酸组成，初始pH用KOH调节至4.5。浸泡24小时、48小时、72小时、7天和10天后，在各时间点将样本从溶液中取出，并使用微计算机断层扫描（micro-CT）逐个扫描。使用直镊处理样本，避免直接接触暴露面。扫描后，用去离子水轻轻冲洗样本以去除任何残留溶液，防止干扰脱矿结果。所有样本在脱矿过程中置于Bioshaker（BR-21UM；日本埼玉TAITEC公司）中，于37 °C、100 rpm振荡。使用InspeXio SMX-100CT系统（InspeXio SMX-100CT；日本京都岛津公司）进行micro-CT扫描以评估牙釉质和牙本质的矿质损失。所有样本使用以下参数扫描：100 kV管电压，50 μA电流，10.0 μm各向同性体素尺寸和10 μm正常各向同性分辨率，400秒积分时间。X射线源到样品的距离为47.2 mm，X射线源到探测器的距离为300 mm。将样本置于管中并放置在计算机控制的转台上，每次扫描以0.3°步进旋转360°。为防止干燥，在扫描过程中在管上方放置湿擦拭卷。使用0.2毫米厚的黄铜（Cu–Zn）滤光片以减少射束硬化效应。每次使用系统时，扫描矿物密度参考铝模体（Phantoms；日本东京Ratoc System Engineering公司）以获取矿物密度校准信息。使用3D-BON软件（TRI/3D-BON；日本东京Ratoc System Engineering公司）分析样本的矿物密度，该软件提供矿物密度的可视化及定量体积数据。每次扫描生成250张以16位TIFF格式保存的图像，然后重建为分辨率为1024 × 1024像素、各向同性体素大小为10 μm的3D图像堆栈。使用从矿物密度模体（Phantoms；日本东京Ratoc System Engineering公司）扫描得出的校准曲线，将CT值转换为矿物密度（gAl cm^?3）。在与样本相同的条件下扫描了具有多个密度等级（2, 3, 4, 6, 8 gAl cm^?3）的铝阶梯楔和纯铝线（1.55 gAl cm^?3）。进行线性回归分析以建立CT值与矿物密度之间的关系（R² > 0.98）。在以处理窗口为中心、大小为800 × 800 × 1000 μm³的感兴趣体积（VOI）内测量每个样本的平均矿物密度。在深度方向上，以9.7 μm的间隔从VOI测量矿物密度（MD）值。根据MD曲线计算平均矿质损失（ML）（vol%·μm）和病变深度（LD）（μm），其中ML通过减去脱矿前曲线下的面积得出。然后根据ten Bosch等人提出的方法[28]，将LD定义为每个样本内矿物密度达到最大值95%时的深度。随后使用电子表格软件包（Microsoft Excel 2024 for Windows；美国华盛顿州Redmond Microsoft公司）将ML和LD结果汇编并分析，其中导入MD数据和相应的深度进行进一步计算。数据以均值 ± 标准差表示，使用SPSS for Windows（SPSS Version 29；美国伊利诺伊州Chicago SPSS公司）进行统计分析。进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行最小显著差异（LSD）检验。所有统计检验的显著性水平均为p = 0.05。图2A总结了各组牙釉质的平均ML随时间的变化，图2B显示了各组的LD。这些图清楚地表明，所有组的脱矿程度和深度随时间增加。具体而言，E-2-15、E-2-50、E-3-15和E-3-50组表现出近似的幂函数关系，其中平均矿质损失和病变深度随时间推移以稳定、一致的速度增加。相反，其他组显示出对数关系，平均矿质损失和病变深度在脱矿过程开始时增加更快，但增长速度随时间减慢。图3显示了牙釉质样本的代表性2D图像。这些图像说明了病变的形成和加深，随着脱矿期的延长，视觉差异变得更加明显。当在控制时间和溶液体积的情况下评估暴露面积对矿质损失的影响时，获得了图4中的数据。结果表明，浸泡3天后，无论溶液体积如何，矿质损失均存在显著差异。随着脱矿过程的持续，各组之间的差异变得更加明显，较小的暴露面积导致更大的矿质损失。这些发现表明，当溶液体积保持恒定时，暴露面积与矿质损失之间存在负相关关系，意味着较小的暴露面积随时间导致更多的矿质损失。当控制时间和暴露面积时，生成了图5，该图突出了溶液体积与矿质损失之间的关系。数据显示，浸泡3天后，不同溶液体积组之间的矿质损失存在显著差异。此外，随着时间的推移，这种差异变得更加明显。7天后，浸泡在较大量脱矿溶液中的组比浸泡在较小量中的组显示出更显著的矿质损失。这些结果表明，溶液体积与矿质损失之间存在正相关关系，意味着较高的溶液体积随时间导致更广泛的脱矿。图6A和图6B分别总结了牙本质的平均矿质损失和病变深度。结果表明，在所有组中，平均矿质损失和病变深度均随时间持续增加。与牙釉质结果类似，D-2-5、D-3-5和D-5-5组显示出时间与矿质损失之间的对数关系，随着脱矿过程的进行，矿质损失最初加速然后减慢。其他组则表现出幂函数关系，其中矿质损失随时间以更一致的速度持续。图7观察到了脱矿过程，显示了牙本质样本中病变的逐渐加深。为了评估牙本质中暴露面积与矿质损失的关系，将具有相同溶液体积的组分组在一起，如图8所示。浸泡3天后观察到矿质损失存在显著差异，随着时间的持续，差异变得更加明显。这一发现与牙釉质的结果一致，即较小的暴露面积导致矿质损失增加。为进一步评估溶液体积与矿质损失的关系，比较了具有相同暴露面积的组，如图9所示。3天后检测到矿质损失存在显著差异，随着时间的推移，这些差异变得更加明显。与牙釉质一样，较大的溶液体积在牙本质中导致更大的矿质损失，特别是在浸泡7天后。这种模式表明，溶液体积在脱矿程度上起着重要作用。图10A,B直接比较了相同条件下牙釉质和牙本质的平均矿质损失和病变深度结果。清楚地观察到，在所有其他条件相同的情况下，牙本质中的矿质损失始终高于牙釉质。这一发现表明，在本研究测试的条件下，牙本质比牙釉质更容易脱矿。使用牛牙进行人工脱矿并作为非感染性龋坏牙本质模型已成为一种广泛使用的方法。然而，近年来，由于脱矿溶液体积不足或脱矿时间不够，很少开发出实验系统作为真正龋坏牙本质的替代品。因此，一些研究担心所得结果可能受到这些次优样本的影响。这通常归因于缺乏适当建立的脱矿方案。本研究旨在调查脱矿溶液体积、样本大小和脱矿持续时间之间的关系，为建立更可重复的实验系统建立基准。牛牙因其可用性以及与人牙相比更稳定的成分而被广泛用于实验室再矿化研究[29]。已知牛牙和人牙的牙釉质和牙本质在元素组成方面非常相似[30]。相比之下，人牙不仅难以获得，而且难以加工以创建足够大的无龋表面。使用牛牙允许研究人员以相对较低的成本进行实验并获得可靠的结果。本实验通过提供特定条件来实现所需程度和深度的脱矿，从而促进了牛牙的使用。对数据进行了曲线拟合，并为常用的暴露表面积（如2 × 2 mm²、3 × 3 mm²和5 × 5 mm²）推导了近似方程。本研究使用基于乙酸的脱矿溶液，该溶液因其模拟自然脱矿的能力和易于制备而被广泛使用。在实验过程中，pH值未随时间调整，因为该研究旨在评估封闭系统条件下的脱矿行为，允许与矿物溶解相关的自然pH值变化发生。这种方法减少了研究人员不必要的步骤，节省了实验材料，并且更环保。无损技术评估矿物含量能够长期评估脱矿和再矿化对样本的影响[31]。与破坏性的二维（2D）技术相比，如金标准方法——横断显微放射自显影术（TMR）[28,32]，micro-CT具有显著优势。Micro-CT是无损的，能够从样本中捕获三维（3D）结构信息。它已被广泛用于分析牙釉质和牙本质中的脱矿和再矿化[33,34,35,36,37]。此外，比较micro-CT和TMR的研究表明，结合Al和Cu滤光片，micro-CT对矿质损失和脱矿深度的测量与TMR得出的结果非常吻合[38]。Micro-CT已被证明是无损定量脱矿和再矿化研究的有效替代方法，并在实验室中被广泛使用。牙釉质和牙本质的脱矿主要受H⁺与羟基磷灰石之间反应的支配。在此过程中，H⁺离子被逐渐消耗，导致牙硬组织溶解成PO₄^3?和Ca²⁺离子，同时pH值逐渐升高。当可用的H⁺消耗到一定阈值时，pH值接近临界值。在此阶段，进一步脱矿与PO₄^3?和Ca²⁺离子重新沉积到矿物相之间建立动态平衡。这一基本机制可能有助于解释本研究的发现。对时间影响各组的分析表明，当数据拟合成曲线时，存在两种类型的关系。在牙釉质中，E-2-5、E-3-5、E-5-5和E-5-15组显示出时间与脱矿之间接近对数的关系，而其他组则表现出幂函数关系。这种现象的原因可能是因为当脱矿溶液对于暴露面积充足时，脱矿的程度和深度都随时间呈正相关增加。相反，当溶液体积不足时，更可能出现对数关系。这可能是由于溶液不足时pH值快速升高，一旦达到临界pH值（牙釉质为5.5，牙本质为6.8）[39]，脱矿就会停止。由此产生的pH值升高随时间减慢了脱矿速度。在牙本质中观察到了类似的现象。D-2-5、D-3-5和D-5-5组显示出接近对数的关系，而其他组则显示出幂函数关系。然而，观察到牙釉质和牙本质之间的一个关键差异：15 mL溶液对于牙釉质相对不足，但对于牙本质则足够。这可能是因为牙本质较高的临界pH值需要较少的脱矿溶液。与牙本质相比，牙釉质中观察到更线性关系可能归因于牙本质脱矿更快，因为它密度低于牙釉质，导致pH值升高更快、H⁺消耗更大，最终减慢了脱矿过程。通过比较浸泡在相同溶液体积中的组，发现牙釉质和牙本质中，暴露面积似乎与矿质损失呈负相关。这可能是由于较大的暴露面积导致H⁺消耗增加，从而减慢了脱矿过程。在牙本质中，D-2-50组的结果与D-3-50组没有显著差异。这可能是因为50 mL脱矿溶液为牙本质10天的脱矿提供了足够的H⁺，但对于牙釉质则不足。因此，在10天期间，D-2-50和D-3-50显示出几乎相同的脱矿速率。这些发现表明，50 mL超过了暴露面积小于3 × 3 mm²的牙本质进行10天脱矿所需的阈值。比较相同条件下牙釉质和牙本质的ML和LD显示，所有组牙本质的矿质损失均大于牙釉质。这与牙本质密度远低于牙釉质，以及两者结构和组成的差异是一致的。牙釉质由约96%的无机物组成，主要是羟基磷灰石，而牙本质含有约70%的无机物[40]，这使得牙本质更容易受到酸攻击。此外，牙本质中的羟基磷灰石晶体比牙釉质中的更小且排列更不紧密[41]，使得酸更容易渗透。众多牙本质小管的存在进一步促进了酸向组织内的扩散，加速了脱矿过程。这些特征解释了在相同条件下牙本质比牙釉质矿质损失更大的原因。每天监测各组pH值变化持续8天，如图11所示。观察到在相同条件下，牙本质的pH值比牙釉质升高得更快。然而，尽管这种升高更快，牙本质组的pH值仍比牙釉质组更远离临界pH值。此外，pH值升高速率与暴露表面积呈正相关，与溶液体积呈负相关。此外，pH值升高速率随时间逐渐降低。这些发现与上述结果一致，进一步支持了研究人员的假设。当比较同一组内的平均ML和LD时，经常观察到LD无显著差异，而ML有显著差异。这可能归因于影响病变深度的几个因素，如个体差异、部分脱矿的牙釉质以及潜在的数据分析错误。LD可能比ML对这些因素更敏感。此外，用于分析micro-CT数据的3D-BON软件依赖于人类视觉评估和操作员经验，不可避免地会引入一定程度的误差。此外，样本之间的个体差异难以充分控制，即使在没有统计学显著差异的情况下，也可能导致组均值出现明显差异。因此，在评估脱矿时，ML似乎是比LD更稳定、更可靠的指标。这一观察结果也适用于使用micro-CT评估再矿化。基于所示结果，通过选择适当的浸泡时间、暴露表面积和溶液体积组合，可以实现牙釉质和牙本质所需的脱矿程度和深度，而无需进行耗时的预实验。此外，在整个过程中使用恒定的脱矿溶液可能有助于减少实验时间和材料消耗。尽管本研究为使用牛牙的脱矿过程提供了宝贵的见解，但应考虑一些局限性。一个局限性是本研究中每组的样本量为6个，考虑到样本间的个体差异，可能不够大。样本间的变异性仍然相对较高，这可能导致观察到平均值差异，但未检测到统计学显著差异。因此，在未来的实验中将增加样本量。此外，由于micro-CT成像需要一定时间，在此过程中可能发生矿物含量的微小变化，尽管研究人员努力用蒸馏水轻轻冲洗每个样本以确保完全去除脱矿溶液。此外，系列micro-CT分析中潜在的纵向以及横向对齐误差不可忽视，这是相关实验中一个常见且目前无法解决的问题。最后但同样重要的是，样本内变异性可能影响结果，特别是在牙釉质组中，由于脱矿后表面相对不均匀，尽管使用了相对较大的面积进行矿质损失计算。零假设被拒绝。这些发现突显了浸泡时间、溶液体积和暴露面积对脱矿程度和深度的显著影响。需要进一步研究以细化这些关系，并更详细地探索潜在机制，特别是在人类牙齿和现实龋齿条件的背景下。通过解决本研究的局限性并扩大未来研究的范围，可以更好地理解脱矿过程以及改进的预防和治疗策略。浸泡时间似乎与矿质损失呈正相关，溶液体积似乎与矿质损失呈正相关，而暴露面积似乎与矿质损失呈负相关。当溶液体积相对于暴露面积相对充足时，矿质损失与时间遵循幂函数关系。相反，当溶液体积相对不足时，矿质损失显示出更接近时间的对数相关性。鉴于其更好的稳定性，平均矿质损失可能是评估牙釉质脱矿更可靠的指标。基于研究结果，可以实现更受控和可重复的脱矿条件，这可能有助于提高体外龋病模型的可靠性，并促进对预防和治疗策略的评估。