Zn2+/K+离子存在下的鸟嘌呤富集DNA四链体序列GGGGTTTTGGGG的晶体结构

《Crystals》：The Crystal Structure of the GG-Rich DNA Quadruplex Sequence GGGGTTTTGGGG in Presence of Zn2+ and K+ Ions Hristina Sbirkova-Dimitrova, Hristo Gerginov and Boris L. Shivachev

　　

富鸟嘌呤(GG-rich)DNA序列在金属离子存在下的结构表征为理解四链体稳定性和离子依赖的构象特异性提供了重要见解。研究人员报道了在Zn²⁺、K⁺和Na⁺存在下，由序列GGGGTTTTGGGG形成的GG-四链体的晶体结构。该结构已沉积在RCSB蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中，登录码为9FTA。该结构通过单晶X射线衍射(Single-Crystal X-ray Diffraction, SCXRD)测定，分辨率为2.49 ?，属于P212121空间群。结构揭示了一种平行链、由两个G-四分体(G-tetrad)组成的G-四链体，其内部通道由K⁺离子稳定，而Na⁺和Zn²⁺则占据外围和沟槽相关位点。Zn²⁺离子通过非典型配位作用与磷酸氧原子和结构水分子相互作用，有助于晶格稳定和沟槽尺寸的微妙调整。T₄环形成一个紧凑、有序的基序，其贡献于晶体堆积而非分子内G4稳定。混合阳离子的存在产生了一个唯一的晶格结构，该结构由离子介导，为二价和单价金属如何协同调控G-四链体拓扑结构提供了结构见解。这些结果可能为理解特定离子对G4结构的影响奠定基础，并可能指导金属开放DNA结构的设计。

富鸟嘌呤DNA序列GGGGTTTTGGGG在Zn²⁺、K⁺和Na⁺存在下的晶体结构揭示了金属离子在稳定G-四链体和介导其晶格排列中的关键作用，为理解离子如何调控核酸高级结构提供了原子层面的见解。

G-四链体(G-quadruplex, G4)是一种非经典的核酸二级结构，由平面G-四分体通过Hoogsteen氢键堆叠形成。这类结构在基因组的端粒区域、基因启动子和调控位点广泛存在，在维持基因组稳定性和调控基因表达方面具有潜在功能。一价阳离子如K⁺和Na⁺通过占据四链体中心通道并与G-四分体的氧原子直接配位，在G4的稳定中起核心作用。其中，K⁺赋予的热稳定性通常高于Na⁺。二价阳离子如Zn²⁺也能通过与外围的磷酸氧或结构水分子相互作用，影响四链体的折叠和稳定性。然而，关于G4在混合单价/二价阳离子环境中的结构数据仍然有限。由于生物学上重要的二价金属（如Zn²⁺）可能通过在非典型位点结合来局部修饰四链体结构和晶格组织，因此开展混合阳离子研究具有重要意义。

针对上述问题，研究人员对序列d(GGGGTTTTGGGG)在混合离子环境下的结晶行为和结构进行了研究。该序列是一种典型的富含GG的基序，能形成平行折叠的G4复合物。通过单晶X射线衍射技术，研究人员成功解析了其在Zn²⁺、K⁺和Na⁺共同存在下的晶体结构（PDB登录号：9FTA）。该结构显示，DNA链形成了平行链的G-四链体，其中两个G-四分体平面被位于中心通道的K⁺离子稳定。同时，外围存在明确的Zn²⁺离子，它们通过配位作用介导了相邻G-四链体单元之间的分子间接触，从而稳定了晶体晶格，但未改变G-四链体核心的拓扑结构。该研究为理解单价和二价离子在决定G-四链体局部结构和晶体组织中的平衡作用提供了直接的结构证据。

为获得该结构，研究人员主要采用了以下关键技术方法：从Eurofins MWG Genomics公司购买了HPLC纯化的寡核苷酸序列。单链DNA溶解后经加热变性并缓慢退火以折叠成G-四链体构象。采用悬滴气相扩散法在293 K进行大分子晶体筛选，优化条件包含二甲胂酸钠缓冲液（pH 6.9）、KCl、ZnCl₂、2-甲基-2,4-戊二醇（MPD）和精胺。高质量的晶体在3-4周内生长出来。衍射数据在Elettra同步辐射光源（的XRD2束线）收集，波长为0.99 ?，样品温度维持在100 K。数据处理使用XDS和XSCALE软件。结构解析采用分子置换法（Molecular Replacement, MR），以已知结构PDB ID: 3NZ7为初始模型，使用Phaser软件获得相位，并使用REFMAC5和Coot软件进行多轮精修。结构分析使用X3DNA完成，图像绘制使用UCSF Chimera和PyMOL。

研究结果部分详细阐述了以下几个方面：

**晶体生长与数据收集**：在优化的结晶条件（含30 mM二甲胂酸钠pH 6.9， 50 mM KCl， 10 mM ZnCl₂， 10% MPD， 2 mM精胺）下，d(GGGGTTTTGGGG)形成了尺寸适于衍射分析的透明矩形块状晶体。衍射数据在100 K收集，处理后属于正交晶系P212121空间群，晶胞参数为a = 26.457 ?， b = 47.925 ?， c = 96.076 ?。最终结构模型包含48个DNA残基、Zn²⁺、K⁺、Na⁺离子以及41个水分子。

**结构解析与精修**：通过分子置换法解析结构，并使用REFMAC5和Coot进行精修，最终分辨率为2.49 ?，最终的R因子和自由R因子分别为0.334和0.426。尽管R值相对较高，但这主要归因于中等分辨率、非对称单元内存在多个独立分子（Z′ = 4）以及核酸晶体中常见的部分晶格无序。电子密度图清晰地定义了G-四分体的堆叠和整体四链体拓扑，表明整体折叠已被可靠确定。结构已沉积于PDB，登录码9FTA。

**不对称单元与离子分布**：不对称单元由四条对称独立的DNA链（链A-D）组成，每条链对应一个d(GGGGTTTTGGGG)寡核苷酸。这些链形成两个通过非晶体学对称相关的独立G-四链体单元。每个四链体均采用平行链G-四链体的典型结构。K⁺离子占据四链体中心通道内明确的位置，与相邻四分体的鸟嘌呤O6原子配位，稳定了四分体堆叠。相比之下，Zn²⁺离子位于四链体通道外的外围位点，其配位环境涉及相邻DNA链的磷酸氧、碱基原子和水分子，从而介导了相邻四链体单元之间的分子间接触，起到了稳定晶格的作用。此外，还观察到一个处于溶剂暴露位点的Na⁺离子，与有序水分子一起参与局部电荷补偿。该不对称单元清晰地展示了K⁺和Zn²⁺离子的功能分离：钾离子稳定内部的G-四链体结构，而锌离子主要作为外部交联元件促进晶体堆积和晶格稳定性。

**结构比较与分析**：将9FTA结构与用于分子置换的参考结构3NZ7进行叠合比较，结果显示核心四链体结构高度保守。9FTA的链B与3NZ7的整体均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD）约为0.4 ?，表明两者构象非常接近；而与链A相比偏差较大（RMSD ≈ 3.6 ?），这主要由环区构象和晶体堆积差异导致。使用X3DNA软件分析碱基对形态参数（剪切、拉伸、错位、扭转、开启和螺旋扭转），结果表明9FTA与3NZ7的参数值在可比范围内，特别是在钾离子稳定的核心区域。在9FTA中观察到的轻微偏差（如错位、扭转和开启参数）是局部性的，与晶体堆积适应性相关，不破坏G-四分体核心的稳定性。这些分析证实了G-四链体核心固有几何结构的保守性。

讨论部分总结并对比了本研究与其他G-四链体结构的异同。9FTA结构的核心特征与先前报道的钾离子稳定型平行链G-四链体一致，K⁺离子占据通道内的经典位置。其独特之处在于明确观察到的外围Zn²⁺离子，这些离子通过与磷酸基和碱基的配位作用，作为连接元件介导了四链体之间的晶格相互作用，这在G-四链体晶体结构中并不常见。与参考结构3NZ7相比，尽管两者在四链体折叠上高度相似，但9FTA展示了不同的晶格组织方式，即由Zn²⁺离子介导的堆积。这突显了结晶条件、离子组成和序列背景如何影响晶体包装而不改变G-四链体核心的基本拓扑。此外，非对称单元中包含两个独立G-四链体单元所产生的伪平移对称性，也是本结构区别于许多仅含一个独立单元的G-四链体结构的特点之一。

研究结论部分指出：该研究解析了G-富集DNA序列GGGGTTTTGGGG在2.49 ?分辨率下的晶体结构（PDB 9FTA）。所报道的X射线结构采用了一种由堆叠的G-四分体和明确定义的配位钾离子稳定形成的平行链G-四链体。K⁺离子占据经典的内部位置，对于维持四链体核心的结构完整性至关重要。不对称单元包含由四条对称独立链形成的两个晶体学独立的G-四链体单元，从而产生伪平移对称。外周的Zn²⁺离子被清晰解析，并介导了相邻四链体单元之间的分子间接触，在不干扰固有四链体拓扑的情况下贡献于晶格稳定。K⁺离子（稳定四链体核心）与Zn²⁺离子（参与晶体堆积）在三维空间和功能上的分离，突显了单价和二价离子在决定局部结构和晶体组织中的平衡作用。